纖維素酶的結(jié)構(gòu)及功能綜述

1、伊/ k f研究生課程作業(yè)（綜述）41題目：纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能食品學(xué)院食品工程專業(yè)學(xué)號學(xué)生諜程食品酶學(xué) 指導(dǎo)教師二0一三年十二月纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能摘要：人類的生命活動(dòng)離不開酶，生物體的一切新代活動(dòng)都離不開酶，并且 工業(yè)酶產(chǎn)業(yè)正在迅速發(fā)展。本文簡單闡述了酶的結(jié)構(gòu)與功能，重點(diǎn)以纖維素 酶為例子，闡述它的來源、結(jié)構(gòu)、分類、催化機(jī)制以及在各行業(yè)的應(yīng)用，并 對纖維素酶的發(fā)展前景作了一定展望。關(guān)鍵詞：纖維素酶 結(jié)構(gòu) 家族 功能The structure and function of cellulaseAbstract:Humans life activities is dependent on th

2、e enzyme,and all the metabolic activity of organisms cannot leave the enzyme, and industrial enzyme industry is developing rapidly.This article simply expounds the structure and function of enzymes.The key to cellulose enzyme as an example,expounds its source,structure, classification,catalytic mech

3、anism and application in various industries,and lastly expect the development prospect of cellulase.Keywords: cellulase structure family function1前言酶是生物體組織或細(xì)胞具有特殊催化活性的蛋白質(zhì)，亦稱生物催化劑。 根據(jù)蛋白質(zhì)分子的組成和盤曲折疊方式，可以將酶分為一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)），與酶的催化功能密切相關(guān)，結(jié)構(gòu)的改變會弓1起酶催 化作用的改變或喪失。1955年Sanger等報(bào)導(dǎo)了胰島素的氨基酸序列，人們開 始把視線注意在酶的結(jié)構(gòu)上

4、。隨后1963年，核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)被測定， 之 后用 X-ray crystallography 測定了 ribonulease, lysozyme, chymotrypsin,trypsin, papain和carboxypeptidaseA的三級甚至四級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)就是指蛋白質(zhì)分子 中肽鏈的氨基酸殘基的排列順序，由于半胱氨酸側(cè)鏈的巰基經(jīng)氧化后，能形 成一SS一鍵，因此在蛋白質(zhì)分子的鏈成鏈間都有可能形成二硫鍵；二級結(jié) 構(gòu)指蛋白質(zhì)分子的肽鏈本身三維空間的規(guī)律性；三級結(jié)構(gòu)就是蛋白質(zhì)的二級 結(jié)構(gòu)按照一定方式再盤曲折疊，并通過氫鍵和疏水鍵維系的結(jié)構(gòu)。且酶蛋白 的一級結(jié)構(gòu)是基礎(chǔ)，但必須有一定的空

5、間構(gòu)型（一般指二級、三級結(jié)構(gòu)）時(shí) 才呈現(xiàn)活性1。酶的基本組成單位是氨基酸，20種氨基酸按不同順序排列組合而成具有 一定空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈，各種氨基酸還具有不同的側(cè)鏈，各種側(cè)鏈又有不同 的化學(xué)反應(yīng)性。它們的相互作用形成各種化學(xué)鍵，如離子鍵、氫鍵、疏水鍵 等。酶分子的特定化學(xué)結(jié)構(gòu)反映了一定的催化功能。酶與那些化學(xué)催化劑相 比，有一些顯著的催化功能，比如高效催化能力，以及在溫和反應(yīng)條件下的 高度選擇性。在有機(jī)合成領(lǐng)域，酶已經(jīng)被作用催化劑選擇性的合成有機(jī)混合 物。所有的天然高分子聚合物生產(chǎn)都是通過酶的體催化得到的2。1961年國際酶學(xué)委員會（Enzyme mittee，0根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型 和機(jī)理，

6、把酶分成6大類。加表1所示：表1的分類及其反應(yīng)本質(zhì)大類反應(yīng)本質(zhì)亞類亞一亞類氧化還原酶電子轉(zhuǎn)移供體中被氧化基團(tuán)的性質(zhì)受體的類型轉(zhuǎn)移酶基團(tuán)轉(zhuǎn)移被轉(zhuǎn)移基團(tuán)的性 質(zhì)被轉(zhuǎn)移的基團(tuán)的進(jìn)一步描述水解酶水解被水解的鍵的類 型（酯鍵、肽鍵）底物的類型：糖苷、肽等裂合酶鍵裂開被裂開的鍵：C-S、C-N等被消去的基團(tuán)異構(gòu)酶異構(gòu)化反應(yīng)的類型底物的類別、反應(yīng) 的類型和手性的 位置連接酶鍵形成被合成的鍵：C-C、底物S1、底物S2、C-O、C-N等 第三底物(共底物)幾乎是核苷酸自然界中，一切生命現(xiàn)象都與酶有關(guān)，生物體的新代過程都在酶的催化 作用下進(jìn)行，并受酶的控制和調(diào)節(jié)。如果離開了酶，新代就不能進(jìn)行，生命 也就停止。因

7、此，酶學(xué)的研究有著重大的理論和實(shí)踐意義。近年來，分子生 物學(xué)領(lǐng)域，在不斷涌現(xiàn)的新方法和新技術(shù)的推動(dòng)下，使酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān) 系愈加清晰。本文以纖維素酶為具體例子，詳細(xì)介紹了纖維素的來源、結(jié) 構(gòu)、催化機(jī)制、應(yīng)用等容。2纖維素酶的概念自1906年從蝸牛消化道發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來，陸續(xù)報(bào)道了細(xì)菌、放線菌、 絲狀真菌等許多微生物中纖維素酶的存在。1954年開始，美軍Natick實(shí)驗(yàn)室 就已研究了軍用纖維素材料微生物降解的防護(hù)問題，后來發(fā)現(xiàn)纖維素經(jīng)微生 物降解后，可產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)、豐富的生產(chǎn)原料，且有望解決自然界不斷產(chǎn)生的固 體廢物問題，于是纖維素酶得到了廣泛的關(guān)注。2.1纖維素酶的來源不同的微生物合成的纖維素酶

8、在組成上有顯著的差異，對纖維素的降解能力 也大不相同。自然界可以產(chǎn)生纖維素的微生物主要有細(xì)菌、放線菌、真菌 等。由于放線菌的纖維素酶產(chǎn)量極低，研究很少；細(xì)菌的產(chǎn)量也不高，且主 要是切葡聚糖酶，大多數(shù)菌所產(chǎn)纖維素酶對結(jié)晶纖維素沒有活性，另外，所 產(chǎn)生的酶是胞酶或吸附于細(xì)胞壁上，很少能分泌到細(xì)胞外，增加提取純化難 度，在工業(yè)上很少應(yīng)用。目前，用于生產(chǎn)纖維素的微生物菌種大多都是絲 狀真菌,其中產(chǎn)酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉屬(Trichoder-ma)、曲霉屬(Aspergillus) 和青霉屬(PenicHlium),特別是里氏木霉(Trichoderma reesei)及其近緣菌株較為 典型。絲狀真菌

9、具有產(chǎn)酶的諸多優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生的纖維素酶為胞外酶，便于酶的 分離和提?。划a(chǎn)酶效率高，且產(chǎn)生纖維素酶的酶系結(jié)構(gòu)較為合理；同時(shí)可產(chǎn) 生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。同時(shí)，其生長環(huán)境粗放、酶易提取， 且菌株安全無毒，因而里氏木霉被公認(rèn)為是最具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的纖維素酶生 產(chǎn)菌。2.2纖維素酶的結(jié)構(gòu)關(guān)于纖維素酶的結(jié)構(gòu)，第一次報(bào)道是Pettersson和Bhikhabhai關(guān)于里氏木 霉的I型外切纖維素酶的氨基酸序列中，發(fā)現(xiàn)其與來自同物種的切葡聚糖酶相 關(guān)。絲狀真菌所產(chǎn)的典型游離纖維素酶分子具有多結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架，包括碳水 化合物結(jié)合模塊(Cellulose-binding module，CBM)，其通過柔性的

10、連接肽(Linker) 連接至催化結(jié)構(gòu)域(Catalyticdomain，CD)上，另外部分酶分子還含有其他結(jié) 構(gòu)域。構(gòu)成厭氧細(xì)菌纖維小體的纖維素酶分子一般由一個(gè)對接模塊(Dockerin) 通過連接肽與一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域(CD)連接，其中對接模塊可與支架蛋白 (Scaffoldin，又稱作腳手架蛋白)的粘連模塊(Cohesin)結(jié)合，而支架蛋白一般 還會存在一個(gè)CBM5oCBM在結(jié)合及降解天然纖維素的過程中具有重要作用； 而CD則主要是催化糖苷鍵的斷裂。纖維素酶包括三個(gè)酶活性：切葡聚糖酶 (Endoglucanase，EG； EC 3.2.1.4)，可以切斷纖維素鏈的阡1,4鍵；外切葡聚 糖KC

11、ellobiohydrolase， CBH ； EC 3.2.1.91，EC3.2.1.176)又稱纖維二糖水解 酶，可以移除自由鏈端的纖維二糖；阡葡萄糖苷i(B-glucosidase，BGL； EC 3.2.1.21)，可以水解纖維二糖成為葡萄糖單元回。不同來源、不同組分的纖維素酶分子量差別較大，如Geotrichum candidum 產(chǎn)生的一種切葡聚糖酶，其分子量為130000D，而斜臥青霉的EG的一個(gè)組分， 分子量僅24000D。纖維素酶分子的一級結(jié)構(gòu)都具有類似的結(jié)構(gòu)，即由球狀的 催化結(jié)構(gòu)域、鏈結(jié)區(qū)和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD ）三部分組成。從酶分子的高 級結(jié)構(gòu)來說，不同來源的酶分子又

12、具有不同的高級結(jié)構(gòu)。如 Clostridium cellulovorans 包括兩個(gè)多纖維素酶體，每個(gè)小體又都包含9個(gè)相同組分的亞單 位，而其中一個(gè)小體的酶活性是另一個(gè)小體活性的4倍，足以說明纖維素酶 組成的復(fù)雜怕刀。2.3纖維素酶的家族根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的相似性，將不同物種來源的碳水化臺 物活性酶類（Carbohydrate-Active enZYmes，CAZy）分成不同的蛋白質(zhì)家族，將蛋 白質(zhì)氨基酸序列相似度高于30%的歸為同一GH家族。其中糖苷水解酶現(xiàn)已 有131個(gè)家族，纖維素酶類分布在至少17個(gè)GH家族中，是糖苷水解酶數(shù) 據(jù)庫中家族數(shù)目最多的一類水解酶類。不同家族的纖維素酶

13、具有不同的演化 歷史和進(jìn)化起源，因此不同GH家族之間的親緣關(guān)系不同，有的親緣關(guān)系比較 近，如GH7家族只含有真菌的水解酶類，GH8家族只含有細(xì)菌產(chǎn)生的水解酶 類等；有的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，如GH9家族的纖維素酶，產(chǎn)生該類酶的生物種類 廣泛，有細(xì)菌（包括好氧菌和厭氧菌）、真菌、植物與動(dòng)物（原生動(dòng)物與白蟻）， 另外GH5與GH12家族的成員也廣泛分布于古菌、細(xì)菌與真菌三類生物中。不同的微生物產(chǎn)生的纖維素酶屬于不同的類別，加隸屬于絲狀真菌的瑞 氏木霉TrichodermaReesei （紅褐肉座菌Hypocreajecorina 的無性型），其分泌 的纖維素酶主要分布于GH5, GH6, GH7, GH1

14、2, GH45與GH61家族；放線 菌中的褐色高溫單孢菌Thermobifidafusca主要有來自GH5, GH6, GH9與 GH48家族的相關(guān)纖維素酶基因；而好氧細(xì)菌中哈氏噬纖維菌 Cytophaga hutchinsonii主要產(chǎn)生GH5與GH9家族的相關(guān)纖維素酶叫厭氧細(xì)菌中的熱 纖梭菌 Clostridium thermocellum 主要產(chǎn)生 GH5, GH8, GH9 與 GH48 家族的 相關(guān)蛋白。同一家族具有相同的催化斷鍵機(jī)制，同一族系，甚至不同族系都 可能會具有相同的斷鍵機(jī)制9。表2列出了部分主要纖維素酶家族的蛋白結(jié)構(gòu) 折疊類型、催化機(jī)制及其他主要信息。表2主要纖維素酶家族

15、的基因序列、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、催化機(jī)制及其成員信息統(tǒng)計(jì)GH feinilyNumberFgeneNumber ofPDB1/ rtnidnires3D structure 枸usClanSCOF foldCatalytic iiLedianistnCatalytic proton donorCatalytic nudaaplule/ baseEdD42d/8（顯弟GH-MInvrrlingG1L1Aqj91448頊1。(afa)6a/a toroidInvertingA叩Glu4S10212/3O毗GH-MInvertingGlu639339/97-：sirandcrt 阪 barrelInverti

16、ngAnyA叩45215SMDoublets p-bandInvertingAspA棗7494745/9b-jellyGH-BRetainingGluGlurollConcaMvalm A-tike ID3引1，tiT nllyLectitis/gjucana sesRftaini 迎12rdLGH-CGinGin53401113/37（阿GH-ATIM 隕-bandR.?tanuQgGinG1L144RctaimnEGluGlu3纖維素酶的催化機(jī)制及應(yīng)用3.1催化機(jī)制纖維素是地球上最豐富的生物資源，最初是在植物和海藻的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu) 中發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)也可以從其他的途徑生產(chǎn)纖維素，比如細(xì)菌。纖維素是

17、由 伊1,4-糖苷鍵連接D-葡萄糖單元形成的一條線性高分子鏈，超過10000個(gè)葡 萄糖殘基。由于纖維素的結(jié)構(gòu)非常緊密，很難通過一些化學(xué)方法將其徹底水 解，要利用纖維素生產(chǎn)綠色能源是一個(gè)難題。而纖維素酶卻能高效水解纖維 素酶。目前我們了解到，纖維素酶直接作用于纖維素，最開始的兩個(gè)酶行為是， 將其分解為纖維二糖和葡萄糖，這是在切纖維素酶和外切纖維素酶的協(xié)同作 用下實(shí)現(xiàn)的。這種纖維二糖隨后被纖維二糖酶水解成為葡萄糖。川葡聚糖酶 和外切葡聚糖酶可以分解水落性纖維糊精和非晶態(tài)纖維素，但是外切纖維素 酶是降解晶態(tài)纖維素的最佳酶皿。纖維素酶水解纖維素的催化機(jī)制如圖1所示 uh。它揭示了在降解完整纖維素體系過

18、程中觀察到，在經(jīng)過大量水解后纖維 素分子結(jié)構(gòu)幾乎沒有發(fā)生很大變化的原因，可以歸結(jié)于單個(gè)酶分子是對酶分子的不同部分進(jìn)行修改。圖1 C.fimi酶降解纖維素的示意圖（其中，直線表示結(jié)晶纖維素，鋸齒線表示非結(jié)晶纖維素。由示意圖可以看 出，Cel6A是一種與非結(jié)晶纖維素具有高度親和力的非連續(xù)性切葡聚糖酶，同 時(shí)Cel5A是一種弓|起非結(jié)晶纖維素解聚的連續(xù)性切纖維素酶；Cel6B是一種進(jìn) 攻纖維素非還原性末端的外切葡聚糖酶，同時(shí)Cel48A是一種分解纖維素還原 性末端的連續(xù)性外切葡聚糖酶）3.2應(yīng)用纖維素酶廣泛應(yīng)用于植物性農(nóng)產(chǎn)品加工、飲料和調(diào)味品的釀造、紡織工 業(yè)、級回收、清潔劑酶、動(dòng)物飼料添加劑等方面

19、。隨著石化能源的日益枯竭，生物資源由于其資源豐富、可再生性和不增 加溫室氣體排放等優(yōu)點(diǎn)，正日益弓1起政府和社會的重視。采用纖維素酶將生 物質(zhì)水解為糖，再發(fā)酵可產(chǎn)生物液體燃料（加生物乙醇、丁醇和碳?xì)浠衔?等），為解決能源危機(jī)展現(xiàn)了新的曙光。若纖維素酶水解生物質(zhì)產(chǎn)生的乙醇、 丁醇或其他糖發(fā)酵產(chǎn)品成為主要運(yùn)輸燃料，那么纖維素酶將會成為世界第一 大工業(yè)。為降低成本，植物基因工程正致力于研究利用植物自身生產(chǎn)纖維素 酶來講解纖維素12J且蛋白質(zhì)的多樣性，需有效地講解植物細(xì)胞壁，并且由于 真菌產(chǎn)酶的多樣性，建立一個(gè)與真菌產(chǎn)酶活性相當(dāng)?shù)闹参锂a(chǎn)酶體系是相當(dāng)困 難的。Saeid Karkehabadi等人13致

20、力于降低生物生產(chǎn)乙醇的成本做了研究，從 嗜熱菌中發(fā)現(xiàn)了一種61家族蛋白，它可以提高T.reesei粗纖維素酶預(yù)處理玉 米秸稈的活性，使酶成本降低了數(shù)倍。并且T.reesei菌中含有多種61家族基 因，并且61家族蛋白結(jié)構(gòu)中不含油類似于纖維素結(jié)合位點(diǎn)的區(qū)域。具體來說，纖維素在食品行業(yè)，一方面主要進(jìn)行橄欖油以及果蔬汁的榨 取，去除掉果蔬汁以及蔬菜汁的沉淀物，促進(jìn)谷物水分吸收，去除豆子中的 豆衣，實(shí)現(xiàn)谷物蛋白以及淀粉的成功分離等；另一方面，纖維素可以用于提 取纖維寡糖等可落性糖，脫粒細(xì)胞壁，取出有用的蛋白等。在紡織行業(yè)中， 紡織行業(yè)纖維素酶的應(yīng)用仍然屬于比較新興的應(yīng)用，主要用于拋光以及打磨 兩個(gè)階段

21、，日常應(yīng)用圍也比較廣，主要是能夠有效的取出衣物表面存在的碎 纖維，方便家庭日常的洗滌工作，通過拋光以及打磨兩個(gè)階段，提高衣物光 澤。在制酒工業(yè)中，纖維素酶主要有力于葡萄酒以及啤酒的制造，利用纖維 素酶，能夠促進(jìn)水解制酒過程中葡萄汁以及大麥汁，有效的分解沉淀物，提 高過濾的效率，增加酒香，提高釀酒的效率，促進(jìn)釀酒業(yè)的發(fā)展。飼料行業(yè) 我我國農(nóng)業(yè)的基礎(chǔ)，是保證滿足十幾億人口大國溫飽的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而纖維素 酶又是其中的重點(diǎn)問題，纖維素酶加入到飼料當(dāng)中，能夠起到很好的補(bǔ)充作 用，增強(qiáng)動(dòng)物體能，防止動(dòng)物反芻事件發(fā)生。除此以外，還能通過應(yīng)用在纖 維素物質(zhì)加去掉谷物殼等中，有效提高動(dòng)物消化的效率，并且分泌相應(yīng)的

22、物 質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物體的粗糙糧食得到消化以及吸收。4總結(jié)與展望纖維素酶作為一種生物工程主要建設(shè)工業(yè)酶，其成功的提取以及應(yīng)用， 對于保證我國解決能源以及食品問題，促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)發(fā)展有著空前意義，纖 維素酶憑借其價(jià)格以及成本低廉、應(yīng)用廣泛、使用方便等特點(diǎn)，已經(jīng)成為人 們關(guān)注的熱點(diǎn)話題之一。而天然的來自真菌的纖維素酶大多為酸性酶，在堿 性條件下不能有效地發(fā)揮作用，而且纖維素酶的活性和熱穩(wěn)定性有限，不能 滿足使用的需要。蛋白質(zhì)工程技術(shù)和酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)為天然纖維素酶 分子的改造提供了有效的途徑。可以在基因水平上，通過定點(diǎn)突變、易錯(cuò)PCR、 DNA改組(DNAShuffling)、克隆等手段產(chǎn)生各種各樣的

23、突變體，再從中篩選出 符合人們需要的性質(zhì)改善的突變酶，如耐堿性酶、比活力提高的酶、熱穩(wěn)定 性提高的酶等，最后，將該突變酶的基因高效表達(dá)，或者弓1回原宿主同源置 換野生型基因，即獲得了經(jīng)分子改性的高效纖維素酶產(chǎn)生菌。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)組學(xué)等技術(shù)的迅速發(fā)展，以蛋白家族的序 列比對與結(jié)構(gòu)模建為基礎(chǔ)，通過分析纖維素酶序列、結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)化關(guān)系, 研究酶分子的活性架構(gòu)及其持續(xù)性催化的分子動(dòng)態(tài)過程，有助于闡明其催化 機(jī)制，從而奠定理性設(shè)計(jì)的理論基礎(chǔ)。可以預(yù)見的是，隨著越來越多新的基 因被克隆出來和新的分子設(shè)計(jì)理念的出現(xiàn)，微生物酶的應(yīng)用前景會越來越好。 因此，人們還必須不斷的改進(jìn)現(xiàn)有的纖維素酶分

24、子改造技術(shù)，探索發(fā)明新的 更高效的文庫構(gòu)建和篩選方法，以期為纖維素酶改造成為更加穩(wěn)定，更加適 應(yīng)外界環(huán)境條件創(chuàng)造更加誘人的前景。編.參考文獻(xiàn)袁靜明.酶的結(jié)構(gòu)與功能J.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1975,01:47-55.Hiroshi Uyama,Shiro Kobayashi.Enzyme-catalyzed polymerization to functional polymersJ.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2002,19: 117-127.紅歌,東升，亮偉.纖維素酶菌種選育研究進(jìn)展J.農(nóng)業(yè)科學(xué),2008, 08:5-7.Macromo16cules V6g6tales.Cellulases and their interaction with cellulose*J.CELLULOSE,1994,1:169-196.王金蘭，王祿山,巍峰，等.降解纖維素的超分子機(jī)器研究進(jìn)展.生物化學(xué)與 生物物理進(jìn)展J,2011,38(1):28