天津大學(xué)生物化學(xué)06第六章課件-《酶學(xué)》

1、第六章 酶學(xué)1（研究發(fā)展)我國(guó)幾千年前就開始制作發(fā)酵飲料及食品。西方國(guó)家在19世紀(jì)初確定了發(fā)酵的總方程式：葡萄糖（C6H12O6） 乙醇(CH3CH2OH)+2CO21857年微生物學(xué)家巴斯德（Pasteur）等人提出酒精發(fā)酵是酵母細(xì)胞活動(dòng)的結(jié)果。1878年提出了“酶”這個(gè)名稱。1913年Michaslis和Menten提出了酶促動(dòng)力學(xué)原理米氏學(xué)說(shuō)。1926年Sumner第一次從刀豆中提出了脲酶結(jié)晶，并證明此酶具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。第六章 酶學(xué)2(總）第一節(jié) 酶與一般催化劑的比較第二節(jié) 酶的分類和命名第三節(jié) 酶的化學(xué)性質(zhì) 第四節(jié) 酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、酶專一性 第五節(jié) 酶的作用機(jī)理 第六節(jié) 酶促反應(yīng)

2、的速度及其影響因素 第七節(jié) 酶的分離提純及活力測(cè)定 第八節(jié) 酶的應(yīng)用 第一節(jié) 酶與一般催化劑的比較一、與一般催化劑的共性 二、作為生物催化劑的特性 一、與一般催化劑的共性用量少而催化效率高。不改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點(diǎn)，僅能改變反應(yīng)速度?？山档头磻?yīng)的活化能。活化能是指在一定溫度下一摩爾底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能。二、作為生物催化劑的特性1（總）1催化效率高。2具有高度的專一性。3酶易失活。4活力受調(diào)節(jié)控制。5活力與輔酶、輔基有關(guān)。二、作為生物催化劑的特性2（1）催化效率高：比非催化反應(yīng)高1081020倍，比其它催化反應(yīng)高1071013倍雙氧水裂解(過(guò)氧化氫酶）1二、作為生物催化劑的特性32具有

3、高度的專一性：一種酶只能作用于某一類或某一種特定的物質(zhì)。3酶易失活：凡使蛋白質(zhì)變性的因素（強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等）都能使酶被破壞而完全失活活力受調(diào)節(jié)控制：如抑制劑調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)、酶原激活及激素等的控制5活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)：有些酶是復(fù)合酶，若將其中小分子物質(zhì)（輔酶、輔基及金屬離子）除去，酶就失去活性。第二節(jié) 酶的分類和命名一、酶的分類 1.根據(jù)催化反應(yīng)類型分 2.根據(jù)類別分二、酶的命名 1.系統(tǒng)命名 2.習(xí)慣命名 第二節(jié) 酶的分類和命名 (分類1)1.根據(jù)催化反應(yīng)類型分1.氧化還原酶（脫氫酶與氧化酶）(1)脫氫酶 A-H2 + B（輔酶） A + B-H2(2)氧化酶 B-

4、H2 + O2 BO + H2O2.轉(zhuǎn)移酶 A-X B A B-X3.水解酶 A-B H2O AOH BH第二節(jié) 酶的分類和命名 (分類2)1.根據(jù)催化反應(yīng)類型分4.異構(gòu)酶5.裂解酶 A B + C6.合成酶 A + B + ATP C ADP(ATP起提供能量活化反應(yīng)分子的作用)第二節(jié) 酶的分類和命名 (分類2)2.根據(jù)類別分：類、亞類、亞亞類等每一種酶都有由四個(gè)數(shù)字組成的編號(hào)，前加EC（酶學(xué)委員會(huì)）。 四個(gè)數(shù)字分別表示：該酶屬于在六大類中的歸屬、在亞類中的歸屬、在亞亞類中的歸屬及該酶在一定亞亞類中的位置，如： 乳酸脫氫酶 EC11127 四個(gè)數(shù)字分別表示：第一大類（氧化還原酶）、第一亞類（

5、氧化-CHOH）、第一亞亞類（氫受體為NAD、乳酸脫氫酶在此亞亞類中的序號(hào))第二節(jié) 酶的分類和命名 (命名1)1系統(tǒng)命名：底物的名稱+反應(yīng)的類型 如：乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、ATP：乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶第二節(jié) 酶的分類和命名 (命名2)2慣用命名：比較簡(jiǎn)短，使用方便，通常依據(jù)酶所作用的底物及其反應(yīng)類型來(lái)命名。如催化乳酸脫氫變?yōu)楸岬拿附腥樗崦摎涿?；水解蛋白的酶叫蛋白水解酶；從?lái)源上還分為胰蛋白酶，胃蛋白酶等。第三節(jié) 酶的化學(xué)性質(zhì)（總）一、酶大多是蛋白質(zhì)二、酶的輔因子 一、酶是蛋白質(zhì)1對(duì)熱不穩(wěn)定。2為兩性電解質(zhì)。3引起蛋白質(zhì)變性的化學(xué)及物理因素，同樣 也能使酶失活。4具有膠體物質(zhì)的一系列特性。5受蛋白水解酶

6、作用而喪失活性。6酶的催化活性與蛋白質(zhì)本性密切聯(lián)系。7許多酶的氨基酸排列順序已陸續(xù)測(cè)出。酶有以下性質(zhì)與蛋白質(zhì)極為相似二、酶的輔因子輔因子：酶中除蛋白質(zhì)外的非蛋白小分子物質(zhì)。 全酶=酶蛋白+輔因子輔因子類型：金屬離子、小分子有機(jī)化合物、有時(shí)這兩者協(xié)同作用。作用：作為電子、原子或某些基團(tuán)的載體參與反應(yīng)，并促進(jìn)整個(gè)催化過(guò)程的進(jìn)行。輔酶：用透析法可除去的小分子有機(jī)物，直接參加催化反應(yīng)。輔基：用透析法不易除去的小分子物質(zhì)，如金屬離子，它間接參加反應(yīng)。第四節(jié) 酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、專一性一、酶結(jié)構(gòu)與功能二、酶作用的專一性 一、酶結(jié)構(gòu)與功能（一）活性部位和必需基因（二）酶原的激活（三）同功酶（一）活性部位和必需

7、基團(tuán)1必需基團(tuán)：酶分子的某些基團(tuán)，經(jīng)化學(xué)修飾改變后，則酶的活性即會(huì)喪失?；钚灾行模菏侵该阜肿又兄苯雍偷孜锝Y(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位?；钚圆课换钚灾行模ㄒ唬┗钚圆课缓捅匦杌鶊F(tuán)2(1)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)酶活性部位上的基團(tuán)有兩類結(jié)合基團(tuán)：參與和底物 結(jié)合的基團(tuán)（一）活性部位和必需基團(tuán)2(2)催化基團(tuán)：直接參與催化反應(yīng)的基團(tuán)。 胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） 的活性中心（一）活性部位和必需基團(tuán)2(3) 隨肽鏈的盤繞折疊，構(gòu)成酶活性部位的基團(tuán)彼此靠近，形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。（一）活性部位和必需基團(tuán)3（總）1酶的專一性研究2酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾3X射線晶體衍射法確定酶的活心中心的

8、方法（總）1酶的專一性研究 通過(guò)研究酶的專一性底物的結(jié)構(gòu)，判斷和確定活性中心的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。2酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾1使用一些對(duì)酶分子側(cè)鏈功能基團(tuán)可進(jìn)行共價(jià)修飾的試劑作用于酶，以查出哪些基團(tuán)是保持酶活力所必需的。酶分子中可被修飾的基團(tuán)：硫氫基（巰基）、羥基、咪唑基、氨基及羧基等。可用作化學(xué)修飾的試劑：用的較多的有DFP（二異丙基氟磷酸）。2酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾2二異丙基氟磷酸（DFP）的作用3X射線晶體衍射法直接對(duì)酶三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)酶分子的絕大部分非極性側(cè)鏈匯集成三維結(jié)構(gòu)的“骨架”，而大部分極性側(cè)鏈則位于酶分子表面，這樣的結(jié)構(gòu)是有利于進(jìn)行酶的催化反應(yīng)的。 牛胰蛋白酶（二）

9、酶原的激活1酶原的激活：由無(wú)活性的酶原變成活性酶的過(guò)程。舉例：某些酶特別是一些與消化作用有關(guān)的酶。常見的酶原及其激活劑:(南大P274，表7-5) （二）酶原的激活2(胰蛋白酶的激活)纈天天天天賴異纈甘組SS絲SS腸激酶（激活作用）纈天天天天賴異甘組SS絲纈SS活性中心胰蛋白酶原胰蛋白酶（三）同工酶同工酶：具有不同分子形式，卻催化相同的化學(xué)反應(yīng)的酶。同工酶具有不同的理化性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)。這種差異是由于酶蛋白的編碼基因不同，或者由于mRNA或翻譯產(chǎn)物是經(jīng)過(guò)不同加工過(guò)程產(chǎn)生的。具有不同分子形式的同工酶之所以能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，是因?yàn)樗鼈兊幕钚圆课辉诮Y(jié)構(gòu)上相同或者至少非常相似。二、酶作用的專一性（

10、總）含義：酶對(duì)所有作用的底物有嚴(yán)格的選擇性，一種酶僅能作用于一種物質(zhì)或一類分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，這種選擇性作用稱為酶的專一性。 1結(jié)構(gòu)專一性 2立體異構(gòu)專一性1結(jié)構(gòu)專一性各種酶對(duì)底物結(jié)構(gòu)的專一性要求不同：有的酶只對(duì)底物分子中其所作用的鍵要求嚴(yán)格；而另一些酶對(duì)底物的要求更高些。葡萄糖苷酶:要求底物必須是D葡萄糖通過(guò)糖苷鍵所形成的糖苷，不要求R基團(tuán)。2立體異構(gòu)專一性幾乎所有酶對(duì)立體異構(gòu)體都具有高度的專一性。酶的立體專一性在實(shí)踐很有意義乳酸脫酶：能催化L乳酸脫氫變?yōu)楸?，?duì)D-乳酸則無(wú)作用D乳酸L乳酸 乳酸脫酶 2H第五節(jié) 酶的作用機(jī)理（總）一、酶的催化作用與分子活化能 二、與酶的高效率有關(guān)的因素

11、一、酶的催化作用與分子活化能1能閾:在一個(gè)反應(yīng)體系中，只有那些含能達(dá)到或超過(guò)某一定限度的活化分子才能在碰撞中發(fā)生化學(xué)反應(yīng),這一限度即為能閾。使反應(yīng)達(dá)到一定能閾的途徑有兩條： 1對(duì)反應(yīng)體系加熱或用光照射。 2使用適當(dāng)?shù)拇呋瘎?，降低反?yīng)的能閾，使反應(yīng)沿著一個(gè)活化能閾較低的途徑進(jìn)行。一、酶的催化作用與分子活化能2其活化能正常為75.3千焦耳。用膠態(tài)鉑作為催化劑時(shí)，活化能降至49.0千焦耳。用過(guò)氧化酶催化時(shí)，則可降低至8.4千焦耳反應(yīng)速度增加一億倍以上。過(guò)氧化氫分解成水和氧的反應(yīng)：一、酶的催化作用與分子活化能3反應(yīng)過(guò)程中能的變化一、酶的催化作用與分子活化能3反應(yīng)過(guò)程中能的變化二、與酶的高效率有關(guān)因素（

12、總）（一）底物與酶的靠近及定向 （二）酶使底物分子中的敏感鍵 “變形” （三）共價(jià)催化中間體學(xué)說(shuō)（四）酸堿催化 （五）酶活性中心是低介電區(qū)域 （一）底物與酶的靠近及定向（1靠進(jìn)）1靠近效率：催化基團(tuán)COO愈靠近底物酯鍵，則反應(yīng)速度愈快，在最靠近的情況下，速度可由開始的1增至53000倍。酯酯水解相對(duì)速度12053000（一）底物與酶的靠近及定向（2定向1）(1)鎖鑰學(xué)說(shuō)(2)軌道定向（一）底物與酶的靠近及定向（2定向2） 1890年有些學(xué)者提出的，強(qiáng)調(diào)酶對(duì)它所作用的底物有著嚴(yán)格的選擇性，它只能催化一定結(jié)構(gòu)或一些結(jié)構(gòu)近似的化合物發(fā)生反應(yīng)。(1)鎖鑰學(xué)說(shuō)（一）底物與酶的靠近及定向（2定向1） 19

13、58年由Kosnland提出的，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶表面并沒(méi)有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀;反應(yīng)后，釋放出產(chǎn)物，酶的構(gòu)象再逆轉(zhuǎn)，回到它們的初始狀態(tài)。（2）軌道定向假說(shuō)（誘導(dǎo)楔合學(xué)說(shuō)）（二）酶使底物分子中的敏感鍵 “變形” 酶使底物中的敏感鍵發(fā)生“變形”，而易于破裂。酶中的某些基團(tuán)或離子可以使底物分子內(nèi)敏感鍵中的某些基團(tuán)的電子云密度增高或降低，產(chǎn)生“電子張力”，使敏感鍵的一端更加敏感，更易于發(fā)生反應(yīng)，此學(xué)說(shuō)的理論依據(jù)來(lái)源于羧肽酶的X衍射分析結(jié)果。（三）共價(jià)催化中間體學(xué)說(shuō)1這種方式是底物與酶形成一個(gè)反應(yīng)活性很高的共價(jià)中間物，它很易變成過(guò)渡態(tài)而大大降低反應(yīng)的活化能。證明此學(xué)

14、說(shuō)的正確與否可用光譜法，甚至用電子顯微鏡觀察中間產(chǎn)物的存在。（三）共價(jià)催化中間體學(xué)說(shuō)1S+E=SEE+P（四）酸堿催化 酶活性部位上的某些基團(tuán)（如氨基、羥基、硫氫基、咪唑基等）可作為良好的質(zhì)子供體或受體，對(duì)底物進(jìn)行酸堿催化。（五）酶活性中心是低介電區(qū)域 酶的活性中心穴內(nèi)相對(duì)地說(shuō)是非極性的。因此，酶的催化基團(tuán)被低介電環(huán)境所包圍。在某些情況下，還可能排除高極性的水分子。這樣，底物分子的敏感鍵和酶的催化基團(tuán)之間就會(huì)有很大的反應(yīng)力，這是有助于加速酶反應(yīng)的。第六節(jié) 酶促反應(yīng)的速度及其影響因素一、酶反應(yīng)速度的測(cè)量 二、影響酶促反應(yīng)速度的因素 一、酶反應(yīng)速度的測(cè)量11測(cè)量單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量2測(cè)量單位時(shí)間

15、內(nèi)產(chǎn)物的生成量一、酶反應(yīng)速度的測(cè)量2產(chǎn)物的濃度酶反應(yīng)的速度曲線從圖中可見，開始一段時(shí)間，反應(yīng)速度幾乎維持恒定。但隨時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線斜率逐漸減少，反應(yīng)速度逐漸降低。斜率=濃度/時(shí)間 =vt一、酶反應(yīng)速度的測(cè)量3（1）底物濃度降低、產(chǎn)物濃度上升而逐漸增大了逆反應(yīng)。（2）酶本身在反應(yīng)中失活，產(chǎn)物的抑制等。 因此，一般測(cè)定酶促反應(yīng)初期的速度，因?yàn)榇藭r(shí)以上因素還來(lái)不及起作用，此速度稱為“反應(yīng)初速度”（條件：底物濃度足夠大時(shí)）其原因可能是二、影響酶促反應(yīng)速度的因素（總）（一）酶濃度對(duì)酶作用的影響 （二）pH對(duì)酶作用的影響 （三）溫度對(duì)酶作用的影響 （四）底物濃度對(duì)酶作用的影響（五）激活劑對(duì)酶作用的影響 （

16、六）抑制劑對(duì)酶作用的影響 （一）酶濃度對(duì)酶作用的影響反應(yīng)的速度v酶的濃度（E)v =k E在底物足夠過(guò)量而其他條件固定的條件下，酶促反應(yīng)的速度和酶濃度成正比。（二）pH對(duì)酶作用的影響相對(duì)活力各種酶的pH值的活性曲線2468100最適pH :酶表現(xiàn)出最大活性的pH。生物體內(nèi)大多數(shù)酶的最適pH接近于中性（6.5-8.0）。胃蛋白酶的最適pH為1.5-2.5,胰蛋白酶的最適pH在9左右。溶液pH偏離最適pH時(shí)，酶的活性降低，偏離越遠(yuǎn)，活性越低。 胃蛋白酶胰蛋白酶（三）溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響1反應(yīng)的速度v溫度tOC低溫時(shí)酶的活性低，酶促反應(yīng)速度很慢。溫度升高時(shí)，反應(yīng)速度也逐步增加但當(dāng)溫度增加到一定程度以后

17、，引起酶的變化，酶促反應(yīng)減慢以至消失。（三）溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響2最適溫度:酶表現(xiàn)最大催化能力時(shí)的溫度 大多數(shù)酶的最適溫度接近于體溫370C。但也有個(gè)別的酶具有較大的抗熱性。酶的反應(yīng)活性在低溫下并不喪失，只是催化活性很微弱，溫度回升活性又可恢復(fù)。反應(yīng)的速度v溫度tOC最適溫度（四）底物濃度對(duì)酶作用的影響1一級(jí)反應(yīng)：當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速度與底物濃度成正比關(guān)系?；旌霞?jí)反應(yīng)：隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速度不再按正比升高。零級(jí)反應(yīng):隨底物濃度的不斷加大，反應(yīng)速度不再上升，趨向一個(gè)極限，說(shuō)明酶已被底物所飽和。一級(jí)反應(yīng)vSVmax 1/2VmaxKm零級(jí)反應(yīng)混合級(jí)反應(yīng)（四）底物濃度對(duì)酶作用的影響2“中間產(chǎn)

18、物”假說(shuō) 為了解釋上圖所示現(xiàn)象，曾有許多假說(shuō)，其中“中間產(chǎn)物”假說(shuō)是被大家公認(rèn)的比較合理的假說(shuō)。它認(rèn)為酶與底物先結(jié)合成一個(gè)絡(luò)合物，即中間產(chǎn)物。此中間產(chǎn)物亦被人們看作為穩(wěn)定的過(guò)渡態(tài)物質(zhì)，然后此絡(luò)合物再進(jìn)一步分解成為產(chǎn)物和游離態(tài)酶。 E +S ES P+EK1K2K3K4（四）底物濃度對(duì)酶作用的影響3 1米氏方程的提出 2米氏常數(shù)的意義及測(cè)定 1米氏方程的提出1(方程）1913年Michaelis和Menten提出酶促動(dòng)力學(xué)的基本原理，并歸納為一個(gè)數(shù)學(xué)式加以表達(dá)-米氏方程。米氏方程表明了底物濃度與酶反應(yīng)速度間的定量關(guān)系，這就使“中間產(chǎn)物假說(shuō)”得到了人們的普遍承認(rèn)，現(xiàn)在一般稱為“米氏學(xué)說(shuō)”。1米氏方

19、程的提出2(解釋1）米氏方程圓滿地表示了s和V之間的關(guān)系1當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，Kms，分母中s可忽略不計(jì)，即：得： V= （Vmax/ km）s 即反應(yīng)速度與底物濃度成正比，符合一級(jí)反應(yīng)1米氏方程的提出2(解釋2）米氏方程圓滿地表示了s和V之間的關(guān)系2當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r(shí)S Km，Km 可忽略不計(jì)，即： 得： V= Vmax 即反應(yīng)速度與底物濃度無(wú)關(guān)，符合零級(jí)反應(yīng) 2米氏常數(shù)意義及測(cè)定1(意義1） 當(dāng)反應(yīng)速度v等于最大的反應(yīng)速度Vmax的一半時(shí)，即v= Vmax/2，代入方程得：簡(jiǎn)化得： Km=s2米氏常數(shù)意義及測(cè)定1(意義2）當(dāng)酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大的反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。它的單位是mol/L，

20、與底物濃度單位一致。不同酶促反應(yīng)的Km可相差很大，一般在10-310-5mol/L之間。米氏常數(shù)在酶學(xué)研究中是一個(gè)極重要的數(shù)據(jù)。米氏常數(shù)的物理意義是：2米氏常數(shù)意義及測(cè)定2（Km特點(diǎn)） （1）Km是酶的特征常數(shù)之一。（2）如果一種酶有幾種底物，則對(duì)每一種底物，各有一個(gè)特定的km值,因此，測(cè)定酶的Km可以作為鑒別酶的一種手段。（3）Km愈?。?/Km愈大）酶對(duì)底物的親和力愈大，達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)需要的底物濃度就越小。因此 Km值最小的底物一般稱為該酶的最適底物或天然底物。（4）可由所要求的v（應(yīng)到達(dá)Vmax的百分?jǐn)?shù)），求出應(yīng)當(dāng)加入的S；反過(guò)來(lái)，也可根據(jù)已知的S，求出該條件下的v。2米氏常數(shù)意

21、義及測(cè)定3（實(shí)際意義）(1)鑒定酶(2)判斷酶的最適底物(3)計(jì)算一定速率下的底物濃度(4)了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平(5)判斷反應(yīng)方向和趨勢(shì)(6)判斷抑制類型2米氏常數(shù)意義及測(cè)定4（測(cè)定11）linewenver-Burk的雙倒數(shù)作圖法1 1 Km 1 1 = + V Vmax S Vmax若以1/V對(duì)1/S作圖,即得:即取米氏方程的倒數(shù) 2米氏常數(shù)意義及測(cè)定4（測(cè)定12）斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmaxlinewenver-Burk的雙倒數(shù)作圖法2此法因方便而應(yīng)用最廣實(shí)驗(yàn)點(diǎn)過(guò)分集中于直線的左端，作圖不易十分準(zhǔn)確2米氏常數(shù)意義及測(cè)定4（測(cè)定2）以v對(duì)v/S作圖, 得一直線其縱

22、軸截距為Vmax橫軸截距為Vmax/Km斜率為Km法: 即把米氏方程改寫為： VmaxvVmax/Kmv/S斜率為Km（五）激活劑對(duì)酶作用的影響1(概念)激活劑:能增進(jìn)酶的活性，加速酶促反應(yīng)進(jìn)行的物質(zhì)。激活:使已有活性的酶活性增高。是由小到大的問(wèn)題。致活:活性從無(wú)到有的問(wèn)題。如Mg2+是各種磷酸激酶的激活劑；CO2+，Mn2+，Zn2+是某些肽酶的激活劑；Cu2+、Fe2+是某些氧化酶的激活劑。（五）激活劑對(duì)酶作用的影響2(機(jī)理) （1）可能是構(gòu)成酶活性中心的成分之一，由于分離提純而喪失，所以加入某些金屬離子有助于增強(qiáng)酶的活性。 （2）可能是酶與底物結(jié)合的橋梁。作用機(jī)理（六）抑制劑對(duì)酶作用的影

23、響1抑制作用:使酶活力下降，但并不引起酶蛋白變性的作用。酶的抑制劑:對(duì)酶抑制作用的物質(zhì)。失活作用:使酶變性的作用。抑制作用一般分為兩類： 1不可逆抑制作用 2可逆的抑制作用1不可逆抑制作用1定義:抑制劑與酶結(jié)合后，不能用透析的方法除去抑制劑而恢復(fù)酶活力。舉例:二異丙基氟磷酸（DFP)能夠與胰凝乳蛋白酶或乙酰膽堿酯酶活力中心的絲氨酸殘基反應(yīng)，形成穩(wěn)固的共價(jià)鍵，因而抑制酶的活性.不可逆抑制作用11不可逆抑制作用2又如碘乙酸、碘乙胺對(duì)巰基酶的不可逆抑制不可逆抑制作用2 碘乙酸(碘乙胺)2可逆的抑制作用可逆的抑制作用:抑制劑與酶的結(jié)合為一可逆反應(yīng),用透析等方法能除去抑制劑使酶恢復(fù)活力它又分為 （1）競(jìng)

24、爭(zhēng)性抑制作用 （2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用 （3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 （1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用1(定義)定義:當(dāng)抑制劑與酶結(jié)合后，妨礙了底物與酶結(jié)合，因而降低了酶的活力.（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用2(舉例) 如琥珀酸脫氫酶能催化琥珀酸脫氫生成反丁烯二酸與琥珀酸結(jié)構(gòu)近似的如草酸、丙二酸、草酰乙酸或戌二酸均可作為琥珀脫氫酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(式子表示) 競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用可用下式表示： Ki2（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4(速度方程1) 按推導(dǎo)米式方程的方法可導(dǎo)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的速度方程 （1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4(速度方程2)從上述速度方程可以看出：有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，Km值增大1I/Ki倍，而且Km值將隨著I增

25、高而增大，當(dāng)S km時(shí)（也就是s使酶飽和時(shí)，方程即為v=V，最大反應(yīng)速度不變。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，改變Km而不改變V的作用。反映競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)是底物濃度很高時(shí)，抑制作用可以被解除，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑影響Km而不影響V.（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4(速度方程3)體現(xiàn)在圖中，I存在時(shí)與I不在存在時(shí)所得直線都在縱軸上交于一點(diǎn)，即縱軸截距相等。而橫軸截距負(fù)值減少，斜率增大。其作用機(jī)理可能是由于底物與抑制劑結(jié)合在酶分子的同一部位上，也可能是由于底物或抑制劑中的一個(gè)與酶結(jié)合后，引起酶發(fā)生變化，產(chǎn)生不利于另一個(gè)結(jié)合的構(gòu)象.1/v1/S1/km1/km（1+I/Ki）Vmax正常I加大（1）競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用4(速度方

26、程4)Vmax不變 Km變大（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用1(定義1)定義1:有些抑制劑和底物可同時(shí)結(jié)合在酶的不同部位上，也就是說(shuō)抑制劑與酶結(jié)合后，不妨礙酶再與底物結(jié)合。（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用1(定義2) 但所形成的酶底物-抑制劑三元復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此酶活性降低。（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用2(式子表示)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用可用下式表示（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(速度方程1) 推出的速度反應(yīng)方程為雙倒數(shù)法處理（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(速度方程2) 由方程可以看出：非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在時(shí)，v減少1I/Ki倍。而且v將隨I增大而降低，但Km值不變。當(dāng)S無(wú)限增大時(shí)，有I存在時(shí)的曲線永遠(yuǎn)低于無(wú)抑制劑存在

27、的曲線，彼此不能重合。因此，反映出此種抑制不能增大S來(lái)克服。這種影響v而不改變Km的作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(速度方程3) 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用改變v而不影響Km的效應(yīng)表現(xiàn)在：有I存在時(shí)得到的直線和沒(méi)有I存在時(shí)所得的直線在橫軸上交于一點(diǎn)，即橫軸截距相等。都是1/km。但縱軸截距和直線斜率增大，并將隨著I增大而增大，這個(gè)特點(diǎn)也常用來(lái)做為判斷非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的一個(gè)根據(jù)。1/v1/S1/km正常I加大（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(速度方程4) Vmax變小 Km不變（2）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用3(作用機(jī)理4) 抑制作用于酶活性部位中催化基團(tuán)，也可能是與維持酶分子構(gòu)象的必需基團(tuán)作用，而使

28、酶的活性降低。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的機(jī)理可能是（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制1(式子表示) 相對(duì)于上述兩種抑制作用，反競(jìng)爭(zhēng)性抑制存在著下列平衡，抑制劑只能與酶底物中間復(fù)合物結(jié)合（3）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制2(速度方程) 隨著抑制劑的增加，Vmax和Km均變小，形成的三元復(fù)合物不能分解為產(chǎn)物，因此影響反應(yīng)速度。這類抑制很少見。其動(dòng)力學(xué)曲線的特征是3.三種不同抑制作用的特點(diǎn)工科P104，南大P2814.對(duì)酶的抑制作用研究的意義 酶的抑制作用在醫(yī)學(xué)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及基礎(chǔ)理論研究上都具有一定的意義。如人服用磺胺藥物后，磺胺藥物即作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和細(xì)菌體內(nèi)利用對(duì)氨基苯甲酸的酶結(jié)合。從而使細(xì)菌體內(nèi)無(wú)法合成其生活所需物葉酸，而導(dǎo)致

29、代謝紊亂，細(xì)菌繁殖受到抑制；在農(nóng)業(yè)上抑制作用常用于設(shè)計(jì)新農(nóng)藥第七節(jié) 酶的分離提純及活力測(cè)定 一、酶的分離提純二、活力測(cè)定 一、酶的分離提純(總)1目的2提純3制備戰(zhàn)略1目的（1）研究酶的理化特性、鑒定酶（2）生物試劑及用作藥物（高純度）2提純酶有兩大類，胞外酶及胞內(nèi)酶。胞外酶易分離。如收集動(dòng)物胰液即可分離出其中的各種蛋白酶及脂酶。胞內(nèi)酶存在于細(xì)胞內(nèi)，必須破碎細(xì)胞才能進(jìn)行分離。3制備戰(zhàn)略(總)（1）選材（2）破碎細(xì)胞（3）抽提（4）濃縮（5）純化3制備戰(zhàn)略1（1）選材：含量高，易于分離。（2）破碎細(xì)胞：研磨，勻漿器，搗碎機(jī)。（3）抽提：抽提時(shí)注意的因素：pH、溫度、鹽及蛋白酶等。一般在低溫下，調(diào)

30、節(jié)pH至等電點(diǎn)，用鹽析（硫酸銨或氯化鈉）或有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮、異丙醇等）使酶沉淀。酶是生物活性物質(zhì)，一般在050C進(jìn)行提純。乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑分級(jí)分離時(shí)必須在150C200C進(jìn)行，酶制品一般都應(yīng)在200C以下低溫保存。3制備戰(zhàn)略2： （4）濃縮：抽提液和發(fā)酵液中酶濃度一般都很低，所以，在純化前要進(jìn)行濃縮，常用的方法有： 蒸發(fā)：高真空的條件下，大面積熱空氣接觸，使水分在瞬時(shí)蒸發(fā)，而達(dá)到目的。由于水分蒸發(fā)時(shí)能帶走熱量，所以，只要真空條件好，受熱并不強(qiáng)。 超過(guò)濾。 凝膠過(guò)濾。 冰凍濃縮。 其他：如聚乙二醇濃縮等。3制備戰(zhàn)略3： （5）純化：首先了解所需純化酶的理化性質(zhì)（溶解度、分子大小和解離特性

31、），以及酶的穩(wěn)定性等。判斷所選方法與條件的適當(dāng)性，控制操作條件。具體純化方法有： 根據(jù)分子大小：凝膠過(guò)濾、超濾、超離心等。 根據(jù)解離性質(zhì)：離子交換、電泳、等電聚焦等。 根據(jù)溶解度：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等。 酶與底物、輔助因子及抑制劑的專一性親和作用，可采用親和層析。二、活力測(cè)定1酶活力與酶反應(yīng)速度 2酶的活力(activity)單位 3酶的比活力(specific activity) 1酶活力與酶反應(yīng)速度1從圖中可知，反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定，隨時(shí)間延長(zhǎng)，酶反應(yīng)速度逐漸下降。研究酶反應(yīng)速度，應(yīng)研究酶促反應(yīng)的初速度。因?yàn)榇藭r(shí)反應(yīng)速度是成直線上升。產(chǎn)物的濃度酶反應(yīng)的速度曲線斜率=濃度/時(shí)間

32、 =v酶活力的大小可以用在一定條件下，它所催化某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來(lái)表示。酶反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示：V=S/tPt1酶活力與酶反應(yīng)速度2造成反應(yīng)速度下降的原因：（1）底物濃度降低（2）酶部分失活（3）產(chǎn)物對(duì)酶抑制（4）產(chǎn)物濃度增加加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行1酶活力與酶反應(yīng)速度3測(cè)定產(chǎn)物增加量或底物減少量的常用的方法：化學(xué)滴定法、比色、比旋光、氣體測(cè)壓、測(cè)定紫外線吸收、電化學(xué)法、熒光測(cè)定以及同位素技術(shù)等。在簡(jiǎn)單酶反應(yīng)中，底物減少與產(chǎn)物增加的速度是相等的。但一般以測(cè)定產(chǎn)物為好。因?yàn)闇y(cè)定反應(yīng)速度時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)規(guī)定的底物濃度往往是過(guò)量的，反應(yīng)時(shí)底物減少的量只占其總量的一個(gè)極小部分，測(cè)定時(shí)不