熒光定量PCR實驗的影響因素小結(jié)

1、熒光定量PCR實驗的影響因素小結(jié)引物的設(shè)計和選擇符合熒光PCR的探針并進(jìn)行設(shè)計對于實時熒光PCR尤其 重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計意味著絕對的失敗。但是，好的設(shè)計并不等于好的 實驗結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進(jìn)行介紹。1、引物退火溫度引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50%的引物和互補序列表 現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài) 下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減 少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55到70C。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm 低 5C。設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可

2、信的方法是近鄰分析法。大部分計 算機程序使用近鄰分析法一一從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜 交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時可以如 下進(jìn)行：以低于估算的Tm5C作為起始的退火溫度，以2C為增量，逐步提高退 火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳 結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5C，就會由于 在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同， 將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5C?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高 Tm設(shè)計的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計

3、的退火溫度進(jìn)行剩 余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。2、引物濃度引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5p M。較高的引 物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴增。為了確定引物濃度，可以在260nm （OD260） 測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers 法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計算。與大分子雙 鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系 數(shù)。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的 的消光系數(shù)（OD/u mol）和消光系數(shù)的

4、倒數(shù)3 mol/OD）。一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長 的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul （50p M）。也可以用OLIGO 軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/u mol），計算出一定的工作濃度下，引物的 加水量。濃度（U M）=A260 （OD/ml）X稀釋系數(shù)X消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD）舉例：計算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10p l稀釋100倍（加 入990p 1）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8 nmol/OD, 代入得：濃度= 0.2 （OD/m1）X 100X4.8

5、 （nmo1/OD）=96nmo1/m1 = 96 M3、引物、探針的純度和穩(wěn)定性定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以 除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學(xué) 的效率不是100%。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使 DNA從3到5合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50 個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。 最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100p M。也可以用雙蒸水溶解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物

6、儲存在-20C。以大 于10p M濃度溶于TE的引物在-20C可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15C到 30C ）僅能保存不到1周。十粉引物可以在-20C保存至少1年，在室溫（15C 到30C ）最多可以保存2個月。探針即寡核苷酸進(jìn)行熒光基團的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以 后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間可以高 達(dá)一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，最好稀釋成2uM （10X），作為工作濃度分裝多支，避光保存。4、熱啟動熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要

7、的方法之一。 盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72C，聚合酶在室溫仍然有活性。因此， 在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會 產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引 物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如定點突變、表達(dá)克隆或用于DNA 工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于 預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完 全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到？（儀達(dá)到變性

8、溫度。包 括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高 通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包 裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟 熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法 比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。Transitor Hot Start Taq酶對于自動熱啟動PCR來說高效可靠。Transitor Hot Start Taq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾，使得該 酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴增前，不會產(chǎn)生由于引物隨機 粘連

9、而形成的非特異性擴增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團會被剪切，從而釋放酶 活。此外，隨著PCR擴增的進(jìn)行，酶活會被逐步釋放，有效提高擴增效率及產(chǎn)物 量。Transitor Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95C保溫過程中要持 續(xù)20分鐘才會被釋放到反應(yīng)中，從而完全恢復(fù)聚合酶活性。5、鎂離子濃度鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引 物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的 游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含 200p M dNTP的實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子

10、溶液（普通 PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴 增，降低忠實性。為了確定最佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增， 進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用Transitor Hot Start Taq酶。Transitor Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合 酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。6、模板質(zhì)量模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會抑制PCR。一些在 標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01 %時就會抑制擴增 反應(yīng)。分離基因

11、組DNA較新的方法包括了 DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及 FTA Gene Guard System，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯 存DNA。應(yīng)注意進(jìn)行PCR反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR反應(yīng)的成功率。7、模板濃度起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴增和熒光PCR擴增， 104到106個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線（或在漠化乙錠染色膠上 觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大?。ㄏ卤恚Ｅe例說，100ng到 川g的人類基因組DNA，相當(dāng)于3X104到3X105個分子，足以檢測到單拷貝基 因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DN

12、A的量是pg級的。對 于一般的檢測樣品，10100ng的量就足夠檢測了。當(dāng)然對模板做一個梯度稀釋， 對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴增效率。8、防止殘余（Carry-over ）污染PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染 可以與目的模板一塊被擴增。當(dāng)前一次擴增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴增反應(yīng)時，會發(fā) 生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA 也會是污染源（非殘余污染）?？梢栽赑CR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液 管可以阻止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離 的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換于套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫?/p>