灝洋生物向您介紹幾種細胞的分離方法

1、.DATA SHEET tbdsciencePAGE ：.；PAGE 8天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司TIAN JIN HAO YANG BIOLOGICAL MANUFACTURE CO.,LTD236# Baidi Road Nankai District Tianjin 300192 P.R China: 86-22-60524017 Fax: 86-22-87893403 87894017 :387745440 35441562tbdscience:tbdscienceeyou 灝洋生物 TBDsciences灝洋生物向您引見幾種細胞的分別方法：白細的胞分別：加速紅細胞沉降法加速紅

2、細胞沉降法 利用高分子量的聚合物促使紅細胞凝聚成串錢狀，從而加速紅細胞沉降，使之與白細胞分別。常用的高分子聚合物有明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮PVP及甲基纖維素等。1 試劑及配制3%明膠灝洋生物產(chǎn)粘度為25泊以上：選取優(yōu)質(zhì)明膠，用生理鹽水配成3%溶液，置沸水浴加熱溶解，分裝，高壓蒸汽滅菌8磅15-20min.6%右旋糖酐灝洋生物產(chǎn)分子量200-400KD：用生理鹽水配制。 操作方法分為2種。 第一種：取抗凝靜脈血參與等量3%明膠鹽水溶液中，混勻或用3份血液與1份3%明膠溶液混勻；將試管直立靜置室溫或37溫箱中30-60min,利用明膠與紅細胞的粘協(xié)作用，促使紅細胞快速下沉，而白細胞留在明膠溶

3、液中；用毛細吸管汲取富含白細胞的上層液，移入另一試管中；按自然沉降法-操作。 第二種：取1份右旋糖酐溶液加等量抗凝血，混勻；按操作方法1的-操作。外周血單個核細胞分別試劑：聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法外周血中單個核細胞PBMC包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、外形和比重與其他細胞不同，紅細胞和多核細胞比重較大，為1.092左右，而淋巴細胞和單核細胞比重為1.075左右。利用比重1.077左右的分層液作密度梯度離心，使一定比重的細胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分別。1試劑及配制 聚蔗糖泛影葡胺分層液LTS1077：灝洋生物有廢品供應(yīng)，比重為1.0770.001臺盼藍染液：稱取4g臺盼

4、藍，于研缽中用少量雙蒸水研磨，加雙蒸水至100ml ,1500r/min離心15min,吸出上層液，即為4%水溶液。用前，1.8%氯化鈉溶液1倍，即為2%臺盼藍染液。2.操作方法 取靜脈血放入抗凝管，搖允，用Ph7.2-7.6 Hank 液稀釋血液1-2倍。取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分層液灝洋生物產(chǎn)3-4ml,放入15X150mm試管中。用毛吸管汲取稀釋血液，在離分層液上1cm處，沿試管壁徐徐參與，使稀釋血液重疊于分層液上，稀釋血液與分層液體積比例約為2：1。用程度離心機以2000r/min離心30min,離心后管內(nèi)容物分為三層，上層為血漿內(nèi)含血小板，中間層為分層液，底層為紅細胞和多核白

5、細胞。在上、中層液體界面處可見到乳白色渾濁的單個核細胞層。 用毛細吸管悄然插到白膜層，沿試管壁周緣汲取界面層單個核細胞，移入另一試管中。加5倍以上體積不含Ca2+、Mg2+Hank液，混勻，1500r/min離心10min,吸棄上清，反復(fù)洗滌2次。末次離心后，吸盡上清。按每毫升血液標(biāo)本加0.2ml含20%小牛血清Hank液重新混懸細胞。取1滴細胞懸液置血球計數(shù)板內(nèi)計數(shù)。然后細胞濃度調(diào)理至2X106/ml 細胞活力檢測：取1滴細胞懸液加1滴2%臺盼藍染液混勻，加蓋片，顯微鏡高倍鏡檢?；罴毎恢?，折光強；死細胞被染成藍色，體積略膨大?；罴毎麛?shù)應(yīng)在95%以上。3本卷須知用稀釋后的全血可是單個核細胞

6、得率高，將稀釋的血液疊加于分層液上時，一定要細心，動作要輕，防止沖散分層液面或與分層液混合而影響分別結(jié)果。配制單個核細胞懸液所用的培育液要求等滲，具緩沖作用，并對細胞無毒性。汲取單個核細胞時，應(yīng)防止吸出過多上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染。配制好的單個核細胞可放室溫或0-4，后一條件較好，可減低細胞代謝活動。留意不要迅速改動其所出的溫度，以免呵斥“溫度休克。 通用型細胞分別液LTS1130 的比重的配方灝洋生物產(chǎn)取比重LTS1077的人淋巴細胞分別液灝洋生物產(chǎn) 3ml ,放入15X150mm試管中。用PBS將肝素抗凝血稀釋1-2倍后，將稀釋全血加到LTS1077分別液上，稀釋的血液：分別液約為2

7、：1。用程度離心機以1500r/min離心10min,離心后，單個核細胞位于血漿和分別液的界面層，紅細胞和粒細胞沉淀在分別液層下，一部分單核細胞和血小板位于分別液層上。汲取界面單個核細胞層，用PBS洗三次。用適當(dāng)?shù)呐嘤褐丿B單個核細胞，配成所需濃度的細胞。用臺盼藍拒染法檢查細胞活力。NK細胞分別試劑：細胞分別液不延續(xù)梯度分別法 通用型細胞LTS1130分別液，為無毒、無刺激的新型密度梯度離心分別劑。其在離心過程中會自然構(gòu)成密度梯度，從而將不同密度的細胞分別出來。 1試劑及配制pH7.2檸檬酸鹽緩沖液 檸檬酸 327mg 檸檬酸鈉 2.63g 磷酸氫鈉 222mg 葡萄糖 2.55mg 蒸餾水加

8、到 100ml (2)聚蔗糖-泛影葡胺分層液LTS1077d=1.0770.001(3)通用型細胞分別液LTS1130灝洋生物產(chǎn)產(chǎn)品Hank液含5%小牛血清 2操作方法外周血單個核細胞的分別取外周血于檸檬酸鹽緩沖液中，兩者體積比為7：1。離心，1000r/min,10min,棄上清，留意勿觸及細胞沉淀。用吸管小心汲取細胞沉淀上面富含白細胞的部分。以3倍體積的Hank液稀釋細胞，置于聚蔗糖-泛影葡胺分層液LTS1077上，2000r/min,20min.小心汲取界面白細胞部分，用Hank液洗2次，配成0.5-1108細胞/ml.(2)非延續(xù)細胞分別液LTS1130密度梯度離心制備7種不同的細胞分

9、層液，范圍為40%-57.5%，每梯度相差2.5%，即40%、42.5%、45%、47.5%、50%、52.5%、55%、57.5% 。將不同密度的細胞分別液悄然地一層層鋪起，從高密度至低密度加，最后加1ml細胞懸液于頂部。 離心，2000r/min,30min. 小心汲取第二、三部分的細胞。第一部分是頂部液體與40%細胞分別液之間，第二部分是40%與42.5%細胞分別液之間，第三部分是42.5%與45%的細胞分別液之間，這兩部富含NK細胞。用Hank液洗2次，1000r/min,10min,細胞重懸于Hank液中，4存放備用。3結(jié)果察看 經(jīng)過形狀學(xué)分析，細胞分別液密度梯度離心分別的NK 細胞

10、80%為LGL，細胞活力95%。4鑒定 用CD56、CD57單抗間接免疫熒光法鑒定純度，臺盼藍拒染法測存活率。5本卷須知血標(biāo)本應(yīng)新穎，宜在4下分別細胞，以堅持細胞活力。普通用檸檬酸鹽抗凝，能夠檸檬酸鹽能更有效阻斷補體系統(tǒng)在體外活。單核細胞分別試劑：密度分別法密度梯度離心法單核細胞只占末梢血白細胞的3%-5%，比重與淋巴細胞近似。用離心法很難將兩者分開。普通利用對塑料的粘著作用來分別單核和淋巴細胞，將粘附的細胞用機械的或酶作用的方法剝離并富集。但此法有損傷細胞及回收率低等缺陷。先可用以下兩種方法獲得量多較純的單核細胞。1.Colotta 方法試劑及配制pH 7.2PBS液。聚蔗糖-泛影葡胺分層液

11、LTS1077灝洋生物產(chǎn)品d=1.077。10%小牛血清，25mmol/L Hepes RPMI-1640培育液Ph 7.2。46%細胞分別液。操作方法將用PBS 5倍稀釋的肝素抗凝血40ml,疊加在10ml分層液上，室溫，400r/min 20min。分別出外周血單個核細胞，用PBS離心洗2次，再用PBS懸浮。150r/min 離心10min,除去血小板，于沉淀中參與5ml 含10%小牛血清及25mmol/Lhepes的RPMI-1640液，制成5ml 的懸液。將其加在46%的細胞分別液5ml中，室溫，550r/min離心30min后得到3個帶：第1帶為富集單核細胞層83%；第2帶也有少量單

12、個核細胞 ；第3帶為淋巴細胞。搜集第1、2帶細胞。2密度梯度離心法試劑及配制A 液：90g/L 聚蔗糖15ml，加500g/L泛影葡胺10ml(比重 1.14 ) 灝洋生物產(chǎn)品 LTS1140B 液：90g/L聚蔗糖17.5ml，加500g/L泛影葡胺10ml(比重 1.13) 灝洋生物產(chǎn)品 LTS1130C 液：90g/L聚蔗糖20ml，加500g/L泛影葡胺10ml(比重 1.12 ) 灝洋生物產(chǎn)品 LTS1120D 液：90g/L聚蔗糖24ml，加500g/L泛影葡胺10ml(比重 1.08) 灝洋生物產(chǎn)品 LTS1080操作方法在10ml離心管中依次參與A、B、C、D4液各2ml,制成

13、梯度。于D液上重疊以生理鹽水2倍稀釋的肝素抗凝血2ml，1000r/min離心40min。在血漿與D液的界面為單核細胞層純度97%-100%。吸出單核細胞層人外周血中性粒細胞分別試劑：小量分別和大量分別1小量分別法1試劑及配制6%右旋糖酐生理鹽水。聚蔗糖-泛影葡胺分層液(LTS1077) 灝洋生物產(chǎn)品d=1.077g/ml。0.83%NH4CL溶液：取0.83g NH4CL、0.1g KHCO3、0.0037g EDTANa2，蒸餾水加至100ml。P3-170.1%白明膠Hank液。 2操作方法取3-10ml肝素抗凝靜脈血，加1/4體積的6%右旋酐生理鹽水，混勻后在室溫斜置30-45min，

14、使紅細胞下沉。取上層按1：1比例疊加到聚蔗糖-泛影葡胺分別液面上(LTS1077) 灝洋生物產(chǎn)品 ，500r/min離心30min。將沉淀細胞用0.83%NH4CL溶液廢除紅細胞，離心洗滌后懸于2-3ml 0.1%白明膠Hank液中，計數(shù)并調(diào)整濃度。取細胞液涂片，分別作臺盼藍拒染實驗和Giemsa染色，鑒定其存活率與純度。2大量中性粒細胞的分別法1試劑和配制通用型細胞分別液LTS1130:將購買的 LTS1130 分別液用10HBSS無鈣、鎂按9：1的體積比配成貯存液，該濃度被以為100%。再用1HBSS含10mmol/L Hepes,Ph 7.2將100%的 LTS1130 分別液稀釋成81

15、%、70%和55%的濃度備用，其密度分別為1.100、1.0875和1.0697。2葡聚糖：將Dextra T-500用PBS配成4%的濃度。3離心梯度的配制：取17100mm的離心管Falcon,將5ml 81%的 LTS1130 分別液參與管底，然后依次加入3ml 70% LTS1130 分別液和4ml 55% LTS1130 分別液即可。2操作方法將全血3000r/min離心3.25min。取40ml淡黃色細胞層buffy coat與4%Dextran混合。5min后將80ml 2%Dextran 參與懸液中，然后將懸液倒入50ml 的離心管中，讓其自然沉淀30min。取Dextran沉

16、淀后的“上清部分，150g 離心8min，并用PBS洗滌2次。將細胞約5-80106/ml參與梯度離心的最上層即55%分別液層，用程度轉(zhuǎn)頭10，1600r/min離心20min。離心后將產(chǎn)生3條細胞帶，其中帶2中性粒細胞約占96.5%。取出細胞，用HBSS洗滌后配成所需濃度。樹突狀細胞分別試劑-兩種方法方法一1試劑及配制分別單個核細胞所需試劑。5%小牛血清RPMI-1640培育液。無Ca2+、Mg2+ PBS。作E化環(huán)實驗所需試劑。人免疫球蛋白Ig(10mg/ml)。牛血漿白蛋白BPA，密度=1.082。牛血漿白蛋白BPA=1.047。2操作方法肝素抗凝血用聚蔗糖-泛影胺分層液分別單個核細胞，

17、用無Ca2+ Mg2+ PBA洗3次，去除血小板，用含5%小牛血清RPMI-1640液配成5107/ml。將單個核細胞與經(jīng)神經(jīng)氨酸酶NA處置過的羊紅細胞E，SRBC做總E花環(huán)實驗，用分層液離心去除其中的T細胞。E花環(huán)陰性細胞用RPMI-1640洗兩次，制成3-5106/ml細胞懸液，置于100mm塑料平皿中，在5% CO2 37孵箱中培育2h，傾出培育液，再用1640培育液洗2次，以除去非粘附細胞。貼壁細胞參與5%小牛血清RPMI-1640培育液在37繼續(xù)培育16h，此時多數(shù)單核細胞仍結(jié)實粘附于平皿上，而樹突狀細胞那么脫粘附，輕搖之。搜集非粘附細胞，用Ig包被板再粘附法純化DC：將人Ig10m

18、g/ml參與塑料平皿中，室溫下置20-30min，然后傾出Ig，用冷PBS洗2次，將非粘附細胞310ml參與包被皿中，37孵育30min，除去混雜的Fc受體陽性FCR+單核細胞粘附于皿上。 P3-18用牛血潔白蛋白BSA不延續(xù)密度梯度離心分別B細胞和樹突細胞：將2-4107細胞重懸于4ml =1.082的BPA，在其上疊加2ml =1.047的BPA，以10000r/min離心15min4進展，低密度細胞位于界面層，高密度細胞主要為B細胞和NK細胞沉于管底。低密度細胞為純化的樹突狀細胞，洗滌后重懸于5%小牛血清1640液中，用臺盼藍拒染法檢測細胞活力。本卷須知：為得到較高純度的DC，可用包被抗

19、-Ig的紅細胞、單核細胞與包被抗紅細胞抗體溶血素的紅細胞以構(gòu)成花環(huán)的方法去除B細胞和單核細胞；也可將T細胞、B細胞和單核細胞分別與其相應(yīng)抗體及補體做細胞毒實驗加以去除，經(jīng)過密度梯度離心得到純化的DC。方法二1主要試劑Ficoll-Hypaque分別液 PercollVerapamil(維爾帕米)人IgRPMI-1640S-100蛋白Naphthol AS-biphosphate(2)操作方法分別周邊血單個核細胞PBMC：按用Ficoll-Hypaque液分別出PBMC，用D-Hank液洗滌2次。用RPMI-1640液洗滌1次。加Verapamil后分別DC：每ml PBMC中參與verapam

20、il 20l,室溫下置30min。用Percoll密度梯度離心，取50%界面層細胞。用D-Hank液洗2次，用RPMI-1640洗滌1次，備用。用Panning 法進一步純化DC。 將人Ig10mg/ml參與克隆板孔中1ml/孔，4，30min，然后傾入Ig，用冷PBS洗2次。將上述備用的細胞懸液參與克隆板孔1ml/孔，4，1h，悄然吹打，搜集非粘附細胞，用D-Hank液洗3次，以上加人Ig 作對照。3鑒定：用抗S-100蛋白抗體進展鑒定，本方法可得到純度為93%的DC。紅細胞的分別試劑P167將抗凝血離心沉淀，洗滌，去除血小板和白細胞，得到下層紅細胞。(1)試劑及配制0.9%NaCl無Ca2

21、+， Mg2+ Hank液。2操作方法取抗凝血加等量生理鹽水，混勻，2000r/min離心5min，去上清。用無Ca2+， Mg2+ Hank液將紅細胞洗滌3次，前兩次2000r/min，5min，末次2000r/min，10min，去上清。將壓積紅細胞配成所需濃度。骨髓抽吸物中的單個核細胞分別試劑：利用骨髓抽吸物種各種細的比重不同，經(jīng)過密度梯度離心使單個核細胞得以分別。1試劑及配制1無Ca2+， Mg2+ HBSS。235%、30%、25%、20%、15%蔗糖：用含20%小牛血清的HBSS配制為密度梯度介質(zhì)。3枸櫞酸-枸櫞酸鹽溶液：2.92g枸櫞酸、9.16g枸櫞酸鈉加蒸餾水至400ml 。

22、4氯化銨NH4Cl溶血溶液：8.29g NH4Cl、1.00g KHCO3、0.0372g EDTANa2蒸餾水加至1000ml。2操作方法 1用裝有0.5ml枸櫞酸的注射器汲取2.5-3.0ml骨髓抽吸物。 2將骨髓抽吸物放入尖底試管中，與10ml 0.83%NH4Cl溶液混合，使紅細胞溶解，用吸管將細胞懸液吹打2min使紅細胞充分溶解，參與適量無Ca2+、 Mg2+的 HBSS，600g離心5min。3傾去上清液，反復(fù)洗滌一次。4傾去上清液，將細胞重懸于2ml HBSS中，小心地疊加于由35%、30%、25%、20%、15%蔗糖各2ml組成的密度梯度上。5200g離心7min.(6)用吸管吸出上半部分液體，置于另一試管中，參與5倍體積無Ca2+、 Mg2+的 HBSS，600g離心5min。7反復(fù)洗滌1次。8吸出或傾出上清液，將細胞重懸，使其濃度為107/ml。脾，淋巴結(jié)或扁桃體中單個核細胞分別試劑：1試劑及配制1無Ca2+，Mg+ PBSS25%小牛血清RPMI-16402操作方法1將一個無菌塑料平皿裝入足量HBSS應(yīng)蓋住皿底，用