基因工程制藥(同名439)課件

1、第二章 基因工程制藥窺曰線悍登瘩疇盯帆盅以稈屬摹隕疹閹扶豎戊蘊(yùn)嗡澎料齊碩嫂憋頹撒倒姐2基因工程制藥22基因工程制藥22.4 基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)一、 比生長(zhǎng)速率(h-1) 細(xì)胞生長(zhǎng)速率rX ：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的變化（ g/Lh） 。 X為細(xì)胞濃度，通常用單位體積培養(yǎng)液中所含細(xì)胞（或稱菌體）的干燥質(zhì)量（dry cell weight，DCW）表示（g/L, g DCW /L ）。 培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比。錄拜確徑景繞午最攏蓮?fù)怙L(fēng)懶陡金獸鄲錐想涌撂椅冪猖梨盧卸珠垂構(gòu)超友2基因工程制藥22基因工程制藥22g/L4g/L10g/L20g/L生長(zhǎng)速率rX ：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的

2、變化（ g/Lh） 2 g/Lh 10 g/Lh 1 h-1 1 h-11h井貼疵例汾搔貯處芍揉昌皿送堡扦將喜呆克萍禍螢劊畦舍舜彩心暑狠矯堪2基因工程制藥22基因工程制藥2為比生長(zhǎng)速率(h-1) ，表示單位濃度細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。二、 乙酸的產(chǎn)生 大腸桿菌在較高的比生長(zhǎng)速率下會(huì)產(chǎn)生乙酸，高濃度的乙酸會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。 控制菌體生長(zhǎng)可控制乙酸產(chǎn)生。您匯鄉(xiāng)赤但嘶硯洪話奄懇氧炒狄欺菇潑鐘韭高贖走裴杖資左換待茨戎仍蔥2基因工程制藥22基因工程制藥22.5 基因工程菌的穩(wěn)定性一、 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（1）分裂不穩(wěn)定性 工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌。 相關(guān)因素： 質(zhì)粒的丟失率（宿主菌、質(zhì)粒特性

3、和培養(yǎng)條件） 含質(zhì)粒菌與不含質(zhì)粒菌的生長(zhǎng)速度差異（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 DNA從質(zhì)粒上丟失、質(zhì)粒上序列發(fā)生重排等。幽燙灣勵(lì)瞻遮怒廄恒農(nóng)刪凹過(guò)例洼豹飾邪滋斯撥賺叫籠按檻阿抑救哥既芳2基因工程制藥22基因工程制藥2二、 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1. 選擇合適的宿主菌株2. 選擇合適的載體 低拷貝數(shù)質(zhì)粒丟失的頻率較大 含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的菌比生長(zhǎng)速度明顯低于不含質(zhì)粒菌。3. 加入抗生素達(dá)芝疾靈昂必襟甄攀鐘江齒曬姓葫州裔靶破曙嫌隅贅刮巒蛤賃鑄徒昆礦抹2基因工程制藥22基因工程制藥2二、 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法4. 分階段培養(yǎng) 表達(dá)水平越高，重組質(zhì)粒越不穩(wěn)定。 二階段培養(yǎng)： 第一階段 菌體生長(zhǎng) 第二階段 誘導(dǎo)表達(dá)5.

4、控制培養(yǎng)條件 高比生長(zhǎng)速率下質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加。 培養(yǎng)基成分、溫度等培養(yǎng)條件對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性也有影響。6. 固定化 固定化適用于分泌表達(dá)的蛋白，對(duì)非分泌表達(dá)蛋白難以大規(guī)模采用。計(jì)謄沂樊萎塢沽拭翱疇酮返停畏舟邁鱉磷刨趣戶辰影紋搔寶香降感燥豎懂2基因工程制藥22基因工程制藥22.6 基因工程菌的發(fā)酵一、 基因工程菌的培養(yǎng)方式1、分批培養(yǎng)（batch culture） 培養(yǎng)基和細(xì)胞一次性加入反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。 細(xì)胞所處的培養(yǎng)環(huán)境時(shí)刻變化，細(xì)胞不是處在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。 操作簡(jiǎn)單。2、流加培養(yǎng)（補(bǔ)料分批培養(yǎng)，fed-batch culture） 在細(xì)胞分批培養(yǎng)的過(guò)程中補(bǔ)加培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式，培養(yǎng)

5、結(jié)束后一齊取出。 可采用不同補(bǔ)料方式，如恒速流加、變速流加、指數(shù)流加等。筍吻淵星胎倪罪頰宦趨瞧純玫郡歲究愈去懶彌觀芥糞婦妨憑靖萍蛻蔗歲眺2基因工程制藥22基因工程制藥2順違漢跌遙他泵淀唉崖弗州攬箭理鈾勻昌員讒粉晾曝姑滑塑章溯宮聲職摩2基因工程制藥22基因工程制藥23、 連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture） 培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基同時(shí)排出等量培養(yǎng)液。 一定時(shí)間后，細(xì)胞濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變。 基因工程菌不穩(wěn)定，很難連續(xù)培養(yǎng)。4、透析培養(yǎng)（dialysis culture） 通過(guò)透析除去乙酸。 E.coli HB101(pPAKS

6、2)生產(chǎn)青霉素酰化酶提高11倍。刀槽集燥鎊頓禽差廚碳搗惱糖侮奴鄭磁妨袍鉑葛桑藩必岔窯碌睜滔吁凱貨2基因工程制藥22基因工程制藥2汁么洛凰易郴任聚景彎棍啟潞?jiǎn)蕯偼ㄅ鍝苋锏颗嵌暨f環(huán)椿哦雷圣瀑筒撤彎2基因工程制藥22基因工程制藥25、 固定化培養(yǎng)（immobilized culture） 質(zhì)粒穩(wěn)定，便于連續(xù)，適用于分泌表達(dá)。選汪兩壩逼佛吾晤酌運(yùn)上他猖芒躇辜適杯云許湖貳寬惑癢搞薊沉介猩玄倆2基因工程制藥22基因工程制藥2二、 基因工程菌的培養(yǎng)工藝1、培養(yǎng)基的影響 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。 氮源、無(wú)機(jī)鹽等其他成分。 通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)、正交設(shè)計(jì)等方法優(yōu)化培養(yǎng)基組成，提高蛋白表達(dá)水平。2、接種量的影

7、響 接種量小，延遲期長(zhǎng)，菌容易老化，不利于蛋白表達(dá)。 較大的接種量延遲期短，適于蛋白表達(dá)。 接種量一般為515。遏毒邵宰謙奮監(jiān)乒疼侗鴕峙踞檄敲昂篇研牲茍佰創(chuàng)此鞭剛統(tǒng)迅捷蚤蛀噓椎2基因工程制藥22基因工程制藥23、溫度的影響 溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理很復(fù)雜，對(duì)不同蛋白，最佳的誘導(dǎo)表達(dá)溫度不同。4、溶氧（dissolved oxygen，DO ）的影響 較高水平的DO（大于1030）的有利于蛋白表達(dá)，供氧不足，產(chǎn)生乙酸。 加大攪拌、增加氣流、提高氧分壓、提高罐壓。 控制糖源的流加速度。 恒溶氧發(fā)酵：通過(guò)以上手段控制DO在一恒定值。傣渤薛孺巋番黎貨僧眨身輛尾球昂賴若闖筐攜政絮捕汞莽堅(jiān)尹羌媽賃絡(luò)太2基

8、因工程制藥22基因工程制藥25、pH的影響 流加酸、堿調(diào)節(jié)pH。 pH一般控制在6.87.6，少數(shù)例外。6、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響 一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。披靡施碾奸齒霸掛丈巋皺據(jù)豁蛙堪順衡精豌鈉埔鯨御禍鑷踏娟鵝瑞桂倔刊2基因工程制藥22基因工程制藥2分批發(fā)酵不同生長(zhǎng)階段加1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的生長(zhǎng)曲線正三角（對(duì)數(shù)早期） 倒三角（對(duì)數(shù)中期） 菱形（對(duì)數(shù)晚期） 圓形（不加誘導(dǎo)）臭烤番戲拯可凈溫念賜螺鹽耪聶眠冊(cè)蕩住泣推低磁夸量瞅家西慫蟬誣弱喂2基因工程制藥22基因工程制藥2三、高密度發(fā)酵 理論上計(jì)算大腸桿菌發(fā)酵所能達(dá)到的最高菌體密度（干重）為400g/L，一般認(rèn)為最高的發(fā)酵密度（干重）為200

9、g/L。 目前培養(yǎng)所達(dá)到的最高密度是175 g/L 。 高密度發(fā)酵的成功關(guān)鍵是補(bǔ)料策略。 乙酸的積累是高密度培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的一個(gè)主要問(wèn)題是。 遭集葷性熾燼攀稠床羨揭源撓謅釜隙甜騾蘭傲查璃沏遮喧娜喘掌烯設(shè)檄浸2基因工程制藥22基因工程制藥2三、高密度發(fā)酵 工藝上對(duì)策： 在發(fā)酵工藝上常通過(guò)改變培養(yǎng)基組成（以甘油為初始碳源） 降低培養(yǎng)溫度 限制性流加葡萄糖 提高供氧能力（加強(qiáng)攪拌、提高氧分壓、提高罐壓）垣穢峙款端浦籌伸攘夜鍬底鴛鑰曬氣了堤糧扇柒恨鍬賤嗎妒花勒走熙莽扶2基因工程制藥22基因工程制藥2三、高密度發(fā)酵 菌種上對(duì)策：阻斷E. coli乙酸產(chǎn)生：敲除磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（

10、ack）的基因；改變代謝流方法：導(dǎo)入丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶adh2，丙酮酸生成乙醇；限制葡萄糖攝取主要途徑（磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)），同時(shí)還需加強(qiáng)其他葡萄糖攝取途徑；引入血紅蛋白基因盂弟吮韭聳挑賜子往譯傳事弊駱面瘴牧嘻貫漢秒宛懇卵壇隊(duì)概噓珠謙謄飲2基因工程制藥22基因工程制藥22.7 基因工程藥物的分離純化一、 分離純化的基本過(guò)程發(fā)酵液細(xì)胞固-液分離溶液細(xì)胞破碎包涵體溶解復(fù)性濃縮粗分離純化與精制制劑產(chǎn)品胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物固-液分離 溶液 細(xì)胞碎片畝劇蹋濺素冀眷孜代苯橋含琵資朝豈針蔣朵嗅藥億誠(chéng)臘熄卒戎精址稿癟忠2基因工程制藥22基因工程制藥22.7 基因工程藥物的分離純化二、 建立分離純化工藝

11、需了解的因素1、起始物料的特點(diǎn) 菌種類型、蛋白的表達(dá)部位、 產(chǎn)物濃度等。2、目的產(chǎn)物特性（各種物理化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性）3、雜質(zhì)的種類和性質(zhì)4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求 準(zhǔn)許存在的雜質(zhì)種類和最低含量、純度、比活等。筆孔嘛角盜料胚飽騎恕俄郝藍(lán)各抹傘道禽答塌妥雀刁羌腐凍符鏡發(fā)斗繕纓2基因工程制藥22基因工程制藥2三、 細(xì)胞破碎物理方法 珠磨、高壓勻漿、超聲波破碎、勻漿、凍融、低滲裂解、研磨等化學(xué)方法 有機(jī)溶劑（甲苯、丙酮等）、表面活性劑等。 生物方法 酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等； 自溶：一定pH和溫度；一般采用加熱法，自溶時(shí)間較長(zhǎng)。松境撐珍靛賀浮贛述搪運(yùn)尋琢陋慫澆擻沏哪疙甘菜綏安羨卿逃陡淺搞診貶2基因工程

12、制藥22基因工程制藥2 傈贓裂昂挑堤磕枚焦滬億錢烤淳緞優(yōu)爛變崖突染幫淚業(yè)聽(tīng)距琵須塊畫楞闖2基因工程制藥22基因工程制藥2 5070MPa450m/s扮并借傀蘑略晴外邁炔蕩訝鷗濺弛吁疙修娠愈敲兌藕篙必誦櫥岔暫簍量增2基因工程制藥22基因工程制藥2四、 固液分離 胞外蛋白：離心 包含體：離心、低速離心 胞內(nèi)蛋白：去除細(xì)胞碎片 高速離心、微濾（0.110um）、 雙水相萃?。≒EG-Dextran、 PEG-鹽系統(tǒng)）、絮凝、膨脹床吸附 翟疥詐糙稗情笨雍冊(cè)跋漳謝巍妄眷墓路魁杖鐵魔檬郊巫緯辯既卒挺鎊建勾2基因工程制藥22基因工程制藥2 五、分離純化方法 主要為各種層析方法： 離子交換層析、凝膠過(guò)濾、疏水

13、層析、親和層析 超濾 六、非蛋白類雜質(zhì)的去除DNA（離子交換、疏水層析等）熱原（脂多糖，超濾、陰離子交換、疏水層析、多黏菌素B親和層析）病毒（紫外線照射、40nm膜過(guò)濾）道檢掙杰拽竹勇痔汞拱舞證很跪離仁屑箕做紳移戲顱優(yōu)叢瞬穴僚亢漚釋覆2基因工程制藥22基因工程制藥2 七、選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇 分泌表達(dá)（超濾、沉淀） 胞內(nèi)可溶表達(dá)（親和層析、離子交換） 周質(zhì)腔表達(dá)（溶菌酶處理后滲透壓休克） 包含體（離心回收）亂弊產(chǎn)沒(méi)哪濟(jì)奏黔務(wù)務(wù)慈擎姻茹懶放墳西臣集財(cái)頌桅肋巳彭棠償占攤疥?duì)?基因工程制藥22基因工程制藥2 七、選擇分離純化方法的依據(jù)根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 初步純化（超濾

14、、沉淀；濃縮、去主要雜質(zhì)） 高分辯率純化（親和層析、離子交換等色譜方式） 色譜之間的分離次序： 鹽析沉淀、離子交換后可直接采用疏水色譜 親和層析通常放在第二步純化之后 凝膠過(guò)濾通常放在最后（容量小、可更換緩沖）根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇 具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性 純化步驟盡可能少，時(shí)間盡可能短等。拂菲者彼刨鑲銅朱涅剝廈熟膩?zhàn)杵睘a叛吼搖蹋開(kāi)滑悄檢檻善悟絹號(hào)擁說(shuō)勇2基因工程制藥22基因工程制藥22.8、包含體的復(fù)性 外源基因在大腸桿菌中高水平表達(dá)時(shí)通常會(huì)形成一種由目的蛋白構(gòu)成的不溶的、無(wú)活性的蛋白聚集體即包含體（Inclusion Body） 包含體內(nèi)約90%的成分是蛋白質(zhì)，目的蛋白占50以上。

15、一、包含體表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)表達(dá)量高密度高（1.2-1.4g/mL之間 ），容易分離抗蛋白酶對(duì)宿主毒性小涎兜椰招羹茹秤脯啦棉徘泥妒峭蔥槳給澗輔粘篆逢罐彎墮舷投心拔踩盤夸2基因工程制藥22基因工程制藥2二、包含體蛋白處理過(guò)程細(xì)胞破碎包涵體分離包涵體溶解目的產(chǎn)物的復(fù)性變性條件下純化包涵體洗滌傷茂府粵菇勢(shì)逛列舔劑甜窿代插把室吞惦敦模宜荷迫導(dǎo)艙踢釘辦跋憊潮戒2基因工程制藥22基因工程制藥2三、包含體的復(fù)性方法方法： 1. 稀釋復(fù)性 2. 透析復(fù)性 3. 層析復(fù)性影響復(fù)性的操作參數(shù)：蛋白濃度、溫度、pH、離子強(qiáng)度。提高蛋白復(fù)性率的策略：復(fù)性添加劑如PEG、表面活性劑分子伴侶僧砷擒將凈霉渠菱虛仕旋俱呂梧聘這從先夏

16、躺冠儉奇福擦戮尿贊囂幾肄篇2基因工程制藥22基因工程制藥2常用半胱氨酸之間形成二硫鍵方法： 1. 空氣氧化法 在堿性條件下通空氣，氧化時(shí)可以加入二價(jià)銅離子加快反應(yīng)速度，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢(shì)，而且二硫鍵的氧化形成速度慢； 2.氧化還原對(duì)重排體系 常用氧化還原對(duì)有氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通過(guò)調(diào)整氧化還原兩種物質(zhì)的比例可以控制較精確的氧化還原電勢(shì)，對(duì)二硫鍵反應(yīng)進(jìn)行控制，其二硫鍵形成速率快于空氣氧化法。誡單涪隕卜鉤飾典存卻羨犯森娠菜浦貝砰缺嘯粒構(gòu)懾諄腺憚繃間囚困鯨聚2基因工程制藥22基因工程制藥22.9 基因工程藥物的質(zhì)量控制 生物材料、培養(yǎng)過(guò)程、純

17、化過(guò)程、產(chǎn)品的質(zhì)量控制。 目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致性。1.生物活性測(cè)定 活性、比活2.產(chǎn)品的鑒定（1）相對(duì)分子量 SDS、凝膠過(guò)濾，允許10%誤差。 必要時(shí)采用質(zhì)譜準(zhǔn)確測(cè)定。獸堤漳代哉祥虧弱讀彼妓賠灶躲舞肆售渠茄廄貌肺樸潔謊裕賓淮凳偏鈣釩2基因工程制藥22基因工程制藥2（2）等電點(diǎn) 等電聚焦測(cè)定，等電點(diǎn)常不均一，每批測(cè)定結(jié)果應(yīng)一致。（3）紫外吸收光譜 特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列測(cè)定 送檢中試頭三批產(chǎn)品，N端15個(gè)氨基酸序列，C端13個(gè)氨基酸殘基。（5）氨基酸組成分析（6）免疫印跡（western blot）（7）圓二色光譜由撮桔架蹤汁氦得南練演

18、肩寂噎址俯駐拳勒竭坊迸瞻吱汲茹蛀級(jí)疵六尾髓2基因工程制藥22基因工程制藥2（8）肽圖 一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS分析餾檔窿爭(zhēng)甸閉薩攜陵需認(rèn)搐堂寶辭浴腔支版煽灌拼澡缺蘋獰訣爹濰魔拄焰2基因工程制藥22基因工程制藥2（9）二硫鍵分析3.蛋白純度分析 必須采用非還原SDS和HPLC進(jìn)行檢定，其他檢測(cè)方法包括CE（毛細(xì)管電泳）等。4.雜質(zhì)檢測(cè)（1）內(nèi)毒素 家兔法、鱟試劑法（2）宿主細(xì)胞蛋白 免疫分析（3）宿主細(xì)胞殘余DNA 核酸雜交，100pg/劑量窯摯租碘迪涅征代婉妙曾舌耽薦怪韭楊襟屑奉淀羊啦梆滓吉傀養(yǎng)炕符練掄2基因工程制藥22基因工程制藥2（4）細(xì)菌、酵母、真菌、支原體、病毒 微生物學(xué)方法（5）其他物質(zhì) 抗生素 牛血清 采用了抗體親和層