生物反應工程原理

1、.微生物反應與酶促反應的主要區(qū)別？答：微生物反應與酶促反應的最主要區(qū)別在于，微生物反應是自催化反應， 而酶促反應不是。此外，二者還有以下區(qū)別：(1)酶促反應由于其專一性，沒有或少有副產(chǎn)物，有利于提取操作，對于微生物反應而言，基質不可能全部轉化為目的產(chǎn)物，副產(chǎn)物的產(chǎn)生不可避免，給后期的提取和精制帶來困難， 這正是造成目前發(fā)酵行業(yè)下游操作復雜的原因之一。(2)對于微生物反應，除產(chǎn)生產(chǎn)物外，菌體自身也可是一種產(chǎn)物，如果其富含維生素或蛋白質或酶等有用產(chǎn)物時，可用于提取這些物質。(3)與微生物反應相比，酶促反應體系較簡單，反應過程的最適條件易于控制。微生物反應是利用活的生物體進行目的產(chǎn)物的生產(chǎn)，因此，產(chǎn)

2、物的獲得除受環(huán)境因素影響外，也受細胞因素的影響，并且微生物會發(fā)生遺傳變異，因此，實際控制有一定難度。(4)酶促反應多限于一步或幾步較簡單的生化反應過程，與微生物反應相比，在經(jīng)濟上有 時并不理想。微生物反應是生物化學反應，通常是在常溫、常壓下進行；原料多為農(nóng)產(chǎn)品， 來源豐富。(5)微生物反應產(chǎn)前準備工作量大，相對化學反應器而言，反應器效率低。對于好氧反應，需氧，故增加了生產(chǎn)成本，且氧的利用率不高。(6)相對于酶反應，微生物反應廢水有較高BOD值。dx ds dp=-=- 0.何為連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)？當 dt dt dt 時，一定是微生物連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀 態(tài)嗎？答：連續(xù)培養(yǎng)是將細胞接種于一定體積的

3、培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)， 在細胞達最大密度之前，以一定速度向生物反應器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；與此同時，含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)時，此時反應器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達到恒定，細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。在穩(wěn)定狀態(tài)下細胞所處的環(huán)境條件如營養(yǎng)物質濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率可維持不變。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。細胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特 別是生物反應器的主要營養(yǎng)物質葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個較低的水平， 從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減

4、少。當 時，不一定是連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)。最主要的是菌種易于退化?？梢栽O想，處于如此長期高速繁殖下的微生物，即使其自發(fā)突變幾率極低，也無法避免變異的發(fā)生， 尤其發(fā)生比原生產(chǎn)菌株生長速率高、 營養(yǎng)要求低和代謝產(chǎn)物少的負變類型。其次是易遭雜菌污染?？梢韵胂螅陂L期運轉中，要保持各種設備無滲漏，尤其是通氣系統(tǒng)不出任何故障，是極其 困難的。在高的稀釋率下，雖然死細胞和細胞碎片及時清除，細胞活性高，最終細胞密度得 到提高；可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并未提高；尤其是細胞和產(chǎn)物不斷的稀釋,營養(yǎng)物質利用率、細胞增長速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。此時，即使?jié)M足公式條件， 也不再是連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)了。因此，不能

5、完全以此來觀測連續(xù)培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)。.葡萄糖為碳源進行釀酒酵母培養(yǎng)，呼吸商為1.04 ,氨為氮源。消耗 100mol葡萄糖和48mol氨，生成菌體 48mol、二氧化碳312mol和水432mol 。求氧的消耗量和酵母菌體的 化學組成。解：根據(jù)題意，可假定反應的質量平衡式為：工。& + 方。工 +4&VH3 f 48co+3】2cd +432/0RQ =ACO,-AO,312解得，300 = b ,即氧的消耗量為 300mol。根據(jù)元素平衡，有C； 600 = 48a 4-312H： 1200 + 48xS= 48p +432x2N： 48 = 48y0= 600 + 2x300= 485+31

6、2x2 + 432聯(lián)立方程求解,得a = 6p= 10= 1*3酵母菌體的化學組成為3 g微生物反應過程反應方程式：碳源+氮源+氧=菌體+有機產(chǎn)物+CO2+H2O為了表示出微生物反應過程中各物質和各組分之間的數(shù)量關系，最常用的方法是對各元素進行原子衡算。如果碳源由C、H、O組成，氮源為 NH3,細胞的分子式定義為 CHxOyNz ,忽略其他 微量元素P、S和灰分等，此時用碳的定量關系式表示微生物反應的計量關系是可行的。CHmOn aO2 bNH3 cCHxOyNz dCHuOvNw eH20 fCO2式中CHmOn為碳源的元素組成，CHxOyNz是細胞的元素組成，CHuOvNw為產(chǎn)物的 元素組

7、成。下標 m、n、u、v、w、x、y、z分別代表與一碳原子相對應的氫、氧、氮的原 子數(shù)。 對各元素做元素平衡，得到如下方程：C :1 =c d fH : m 3b = xc ud 2eO : n 2a = yc vd e 2fN :b = zc wdO2的消耗速率與CO 2的生成速率可用來定義好氧培養(yǎng)中微生物生物代謝機能的重要指標之COc一的呼吸商(respiratory quotient ),其te義式為：RQ =2O2平衡生長條件下微生物細胞的生長速率rx的定義式為dX二丁 二at式中X為微生物的濃度，科為微生物的比生長速率，其除受細胞自身遺傳信息支配外，還受環(huán)境因素所影響。由上式可知，與

8、倍增時間(doubling time) td的關系為：,ln 2 0.693l =tdtd.提高好氧發(fā)酵供氧能力的手段有機械攪拌，通風等方法，這倆種方法那種更有利于提高供氧？為什么？答：兩種供氧方式各有長處和不足，適當選取供氧方式能提高供氧效率。影響發(fā)酵罐中氧氣傳遞的因素有三個：(1)操作條件(攪拌轉速，通氣量)；(2)發(fā)酵罐的結構和幾何參數(shù)；(3)物料的物化性質。機械攪拌可以從下列幾個方面改善溶氧速率：(1)把大的空氣氣泡打成微小氣泡，增加了接觸面積，而且小氣泡的上升速度要比大氣泡 慢，因此接觸時間就增長。(2)使液體作渦流運動，氣泡作螺旋運動上升，延長了氣泡的運動路線，即增加了氣泡的接觸時

9、間。(3)使發(fā)酵液呈湍流運動，從而減少氣泡周圍液膜的厚度，減少液膜阻力，因而增大KLa值。(4)使菌體分散，避免結團，有利于固液傳遞中的接觸面積的增加，使推動力均一。同時， 也減少菌體表面液膜的厚度，有利于氧的傳遞。優(yōu)點：攪拌功率高，具有良好的氣液分散功能，因而溶氧速度高。缺點： 過度強烈的攪拌，產(chǎn)生的剪切作用大，對細胞損傷，特別對絲狀菌的發(fā)酵類型，更應考慮到剪切力對菌體細胞的損傷。對于單細胞生物如球狀或桿狀的細菌、 酵母、等耐受剪切力比較強，宜采用機械攪拌供氧； 通氣供氧：把無菌的空氣通過噴嘴或噴孔噴射進發(fā)酵液中，通過氣液混合物的湍流作用而使空氣泡分割細碎，同時由于形成的氣液混合物密度較低故

10、向上運動， 而上部的發(fā)酵液則下沉， 形成循環(huán)流動，實現(xiàn)混合和傳質。優(yōu)點：反應溶液分布均勻，綜合循環(huán)速率高；較高的溶氧速率和溶氧效率較高的氣含量和比氣液接觸面積；剪切力小沒有機械攪拌葉輪，故剪切力小。缺點：通風的增加也是有限的；蒸發(fā)量大；中間揮發(fā)性代謝產(chǎn)物帶走 對于絲狀菌的耐受能力弱；動物細胞對剪切特別敏感。所以宜采用通氣供氧。5.水-有機溶劑構成的雙液相生物反應體系在生物反應體系中占有重要位置，具有廣泛的應 用領域。雙液相生物反應體系中除酶促反應體系外，還有微生物反應體系。以C113-羥基化反應的研究為例，該反應中不僅需要0113 -羥基化酶，還需要輔酶和細胞膜的磷脂雙分子層的協(xié)同作用。這樣的

11、生物轉化反應是不能通過將酶提純后再進行的。因此，直接利用微生物反應體系更具優(yōu)勢。 因此，此時采用溫和壓力技術進行 C113-羥基化反應是否可行？ 答：溫和壓力技術是根據(jù)微生物本身特性，通過在生物反應的一定階段施加溫和壓力（0.11.0Mpa）,使細胞代謝通量沿著目的產(chǎn)物方向加強，或者提高特定酶促反應效率的一種新的 生物加工方法。溫和壓力催化改變了傳統(tǒng)微生物發(fā)酵和生物催化過程中壓力作為常量的做 法。由于該技術整合了高壓技術與生物催化兩項技術的優(yōu)點，從而提高生物催化效率。通過選擇適宜的加壓介質和加壓方式，可以使微生物活性基本不受影響。壓力可以改善難溶底物在水相中的溶解性， 增進微生物細胞膜的通透性

12、，提高基質、產(chǎn)物的傳質速率，改變微生物胞內(nèi)代謝流，最終達到提高產(chǎn)物發(fā)酵水平的目的。目前，開展溫和壓力生物催化的報道甚少。天津科技大學生化工程研究室在國家自然 基金及天津市自然科學重點基金的資助下完成的相關研究結果表明：溫和壓力生物催化在理論和技術上是可行的，其中利用溫和壓力提高生物產(chǎn)物一一海藻糖的專利已獲得授權；在0.11.0MPa溫和壓力條件下氫化可的松的轉化率較常壓提高了15%左右（發(fā)明專利），并且能夠有效降低副產(chǎn)品的生成。這些為溫和壓力的商業(yè)化提供了必要的技術保證。藍色犁頭霉是生物法轉化生產(chǎn)氫化可的松的常用菌種之一，由于管體生物轉化過程中管體底物與犁頭霉生物酶系分別位于油-水兩相，從而大

13、大降低了氫化可的松的轉化效率。氫化可的松的生產(chǎn)是一種典型的生物催化反應，該反應不但涉及反應底物溶解性低的問題，而且還涉及到高耗氧、輔酶再生等問題，在微生物法轉化生產(chǎn)氫化可的松的過程中，除了微生物自身的轉化能力外，氧氣的供給、底物在水中的溶解性以及輔酶的再生是限制轉化反應的 主要因素，如何有效地解決或緩解以上問題便成了在現(xiàn)有生產(chǎn)菌株基礎上提高氫化可的松轉 化率的關鍵。目前常采用的添加有機溶劑的方法、3環(huán)狀糊精包埋及添加表面活性劑等方法，提高底物在水中的溶解性。采用溫和壓力技術，其優(yōu)勢在于：（1） 溫和壓力技術可以提高底物的溶解速率主要體現(xiàn)在兩方面： 一壓力對底物的影響，物理學上，壓力是獨立于溫度

14、、化學組分的重要參量。壓力可以有效地使物質的原子間距離縮短、相鄰電子的軌道重疊增加，進而改變物質的晶體結構、電子結構和原（分）子間的相互作用，達到溫和壓平衡態(tài)， 形成全新的物質 狀態(tài)。二壓力對細胞膜的影響，使細胞膜通透性增加，從而使一些酶更容易的從胞內(nèi)流向胞 外，加快了與底物的融合和反應。（2）改善了菌絲團結構常壓條件下菌絲球形態(tài)完整、致密，菌絲球邊緣菌絲較短，菌球邊緣較平整，幾乎無游離的菌絲。而在加壓條件下菌絲球 形態(tài)比較松散，菌球外邊緣的菌絲較長，菌球相對比較獨立， 有少量菌絲互相連接，發(fā)酵液中有少量游離的菌絲。以上變化說明溫和壓力可以改變藍色犁頭霉的菌絲形態(tài)?？紤]到氫化可的松前體R.S.

15、A的難溶性，菌絲球之間保持一定的孔隙會增大R.S.A與菌絲球間的有效接觸面積，有助于提高底物與細胞的傳質效率。只要在保證菌絲活力的前提下，溫和壓力處理通過改變菌絲球形態(tài)， 促進培養(yǎng)基中基質的傳遞效率，進而影響菌絲球的氫化可的松轉化能力。（3）增加生產(chǎn)菌株的細胞膜通透性細胞膜主要由磷脂和蛋白質分子組成，通過氫鍵和疏水鍵維持其結構， 在壓力的作用下，細胞膜雙層結構的容積隨著每一磷脂分子橫切面積 的縮小而收縮，使通透性增大。菌絲球在溫和壓力的作用下，胞內(nèi)電解液、內(nèi)容物（蛋白質、核酸）不斷外滲，從而導致細胞懸浮液的電導率、A260,和A280隨壓力變化而變化，在0.5MPa壓力下，細胞膜通透性顯著增強

16、， 各指標均高于常壓對照。 而此時菌絲球仍保持很高的生物 活力（相對生物活力為97.8%） o這就說明，0.5MPa的壓力處理可以在保證菌絲球生物活力的 前提下，顯著提高了細胞膜的通透性。（4）提高了脫氫酶活力和強化了相關途徑加壓后菌絲球脫氫酶活力還略高于常壓對照組，這可能是由于氧分壓的增大，促使培養(yǎng)液中溶氧水平提高，進而影響細胞的代謝水平，最終表現(xiàn)為犁頭霉菌絲球活力增強，胞內(nèi)DHA水平提高。壓力作為脅迫因子，可以改變細胞正常生理狀態(tài)下的代謝通量，刺激細胞發(fā)生應激反應，促進應激產(chǎn)物的生成。從細胞水平上講，應激因子 （生物、生理、物理、化學等）刺激生物個 體時，會激活一些基因的表達， 其細胞和生

17、物體會本能地合成一套保護性的物質，從而保護生物免受應激脅迫的損害，這一系列的代謝變化， 就是生物的應激反應，它是生物在長期的進化過程中保留下來的自我保護機制。在正常情況下，微生物體內(nèi)的新陳代謝活動處于穩(wěn)定狀態(tài)，此時合成代謝與分解代謝之間存在著平衡.當機體受到外界刺激時，會產(chǎn)生各種應激反應，原有的平衡被破壞。結果以空氣為介質，采用分階段加壓的轉化工藝，壓力提高了底 物在水相的溶解性，同時犁頭霉菌絲球在維持原有活力的基礎上，細胞膜通透性顯著增強， 胞內(nèi)DHA7R平提高，這些都促進了氫化可的松兩相生物轉化的進行。因此，通過選取合適的加壓介質、加壓方式，以壓力為手段可以顯著提高藍色犁頭霉氫化可的松生物轉化效率。一定壓力下影響微牛物活性的主要原因是升降壓速度和加壓介質的性質，其次是厭氧環(huán)境。當選擇高純空氣為加壓介質，控制合適的條件，微生物活細胞率不會損失。由于一定壓 力的影響，微生物的代謝通量和相應的酶活性發(fā)生變化。溫和壓力下有的酵母菌的海藻糖合成酶活力較常壓下提高 1倍，相應的酵母菌海藻糖生物合成能力最高提高200%,酵母菌代謝過程分析表明，一定壓力下與海藻糖生物合成相關的代謝分