量子點免疫層析檢測技術(shù)

1、量子點免疫層析檢測技術(shù)方興未艾免疫層析技術(shù)是一種快速、簡便、靈敏、直觀、價格低廉、可真正實現(xiàn)現(xiàn)場 檢測的檢測方法。具有很多氣相色譜、高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用色譜、液質(zhì)聯(lián)用 色譜、毛細(xì)管電泳等儀器檢測方法以及其他傳統(tǒng)方法無法企及的優(yōu)點。在檢測領(lǐng) 域中處于特殊重要的地位，同時也是傳統(tǒng)檢測和儀器檢測的良好補(bǔ)充。尤其在經(jīng) 濟(jì)高速發(fā)展，生活水平提高的今天，人類重大疾病，環(huán)境污染，食品安全等問題 日益受到極大的關(guān)注，讓免疫層析檢測技術(shù)更具有巨大的潛力和蓬勃的生命力。目前，免疫層析產(chǎn)品主要為膠體金免疫層析試紙條，其最早應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗， 在早孕檢測中的應(yīng)用取得了極大的成功，隨后在各個領(lǐng)域迅速滲透漫延，其在毒 品

2、檢測、環(huán)境檢測、以及食品安全檢測領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展，但是又出現(xiàn)新的 問題，在很多方面，尤其是食品安全檢測領(lǐng)域，有些農(nóng)獸藥殘留限度極度苛刻， 甚至要求0.1 ng/ml的檢測限度，同時食品類物質(zhì)如肉類、禽類、果蔬、谷物等 成分復(fù)雜，前處理難度也很大，造成膠體金免疫層析檢測靈敏度無法勝任。除了 進(jìn)一步提高前處理方法以外，尋求高靈敏度的免疫層析方法也顯得尤為重要。量子點是近20年來發(fā)展起來的半導(dǎo)體納米晶材料，因為它的優(yōu)良特性，受 到了很大的關(guān)注，并且已經(jīng)顯示出一定的潛力，近幾年來從細(xì)胞標(biāo)記等應(yīng)用已逐 漸開始向多個領(lǐng)域的檢測與診斷方向滲透。一、量子點特性量子點（簡稱QDs,又稱半導(dǎo)體納米粒子）是由I

3、I丑族或IIIV族元素組成 的，半徑小于或接近于激光玻爾半徑，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的一類半導(dǎo)體納 米顆粒，其中研究較多的主要是CdX（x=S、Se、Te），直徑約為2nm-6nm。量子 點由于存在顯著的量子尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，從而使它具有常規(guī)材料所不具備的 光吸收特性，使其應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛，特別是其在免疫生物學(xué)和臨床檢驗學(xué)等 研究中的潛在的應(yīng)用價值，已引起了廣大科學(xué)工作者的極大關(guān)注，發(fā)光量子點作 為熒光試劑探針標(biāo)記生物大分子，正是近年來迅速發(fā)展的納米材料在生物分析領(lǐng) 域的重要應(yīng)用之一。與普通的熒光染料相比較，量子點具有以下特點：（1）有機(jī)染料熒光分子激光譜帶較窄，每一種熒光分子必須用合適能

4、量的光來激 發(fā)，而且產(chǎn)生的熒光峰較寬，不對稱，有些拖尾。這給區(qū)分不同的探針分子帶來 困難，很難利用有機(jī)染料分子同時檢測多種組分。量子點由于量子限域效應(yīng)使其 激發(fā)波長的范圍很寬，可以被波長短于發(fā)射光的光（一般短10nm以上）激發(fā)，并 產(chǎn)生窄（半波寬約13nm）而對稱的發(fā)射光譜，從而避免了相鄰探測通道的串?dāng)_。（2）量子點具有調(diào)色”功能，不同粒徑大小的量子點具有不同的顏色，激發(fā)量子 點的激發(fā)波長范圍很寬，且連續(xù)分布，所以可以用同一波長的光激發(fā)不同大小的 量子點而獲得多種顏色標(biāo)記，是一類理想的熒光探針。（3）量子點的熒光強(qiáng)度強(qiáng)，穩(wěn)定性好，抗漂白能力強(qiáng)，Chan和Nie通過實驗證明 ZnS包覆的CdSe

5、比羅丹明6G分子要亮20倍和穩(wěn)定100-200倍，可以經(jīng)受多次 激發(fā)，且標(biāo)記后對生物大分子的生理活性影響很小，因此為研究生物大分子之間 的長期作用提供了可能。生物相容性好，尤其是經(jīng)過各種化學(xué)修飾之后，可以進(jìn)行特異性連接，細(xì)胞 毒性低，對生物體危害小，可進(jìn)行生物活體標(biāo)記和檢測，而傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料 一般毒性較大，生物相容性差。熒光壽命長，典型的有機(jī)熒光染料的熒光壽命僅為幾納秒(ns)，這與很多樣本 的自發(fā)熒光衰減的 時間相當(dāng)。而量子點的熒光壽命可持續(xù)長達(dá)數(shù)十 納秒 (20ns-50ns)，這使得當(dāng)光激發(fā)數(shù)納秒以后，大多數(shù)的自發(fā)熒光背景已經(jīng)衰減，而 量子點熒光仍然存在，此時即可獲得無背景干擾的熒光

6、信號。圖1.量子點二、量子點的合成方法 目前合成量子點的方法主要有兩種，一種是在有機(jī)體系中合成，即用金屬有機(jī)化 合物在具有較強(qiáng)配位能力的有機(jī)溶劑中制備；另一種是在水溶液中直接合成。有機(jī)相合成法量子點最早采用膠體化學(xué)方法在有機(jī)體系中制備的方法，將金屬和有機(jī)化合 物混合在有配位性質(zhì)的有機(jī)溶劑中，在一定的溫度條件下就能生長出納米晶體。 這類方法制備的量子點分散性、穩(wěn)定性都較好，不容易聚沉，表面修飾容易。早 期合成的量子點往往存在量子點粒徑分布較廣、熒光產(chǎn)率偏低等缺點。1993年， Bawendi及其同事用二甲基鎘和硒的三辛基膦(TOP)配合物作為前驅(qū)體，將其依次注入劇烈攪拌的三辛基氧化膦(TOPO)

7、溶液中，合成了高熒光產(chǎn)率的CdSe 量子點，這種方法合成的量子點結(jié)晶性好、尺寸單分散、量子產(chǎn)率約為10%。這種方法較以前來說是一種突破，但當(dāng)量子點制成水溶性時，其熒光產(chǎn)率會大大下圖 2. 1996 年，HinesWaveiglh Lnm；IilTHreX liMircEnr-E nl iJic-iLdScirLMR I Iiik i jnd i：1 IiikI nuiuu、imiiidunl tlKir sdixnpliun-Enniivfi DiHrIriiijiti if JTH nm)成功合成了 ZnS包覆的CdSe量子點降。后來人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把ZnS或CdS包覆在CdSe納米晶體表面后，

8、熒光產(chǎn)率會 大大提高。1996年，Hines等就用二甲基鋅和六甲基二硅硫烷作為量子點殼層前 驅(qū)體制備了 CdSe/ZnS核殼式量子點，其量子熒光產(chǎn)率在室溫可達(dá)50%。但上述 合成方法均采用(CH3)2Cd作為原料，而(CH3)2Cd的毒性很大，具有易燃、昂貴、 室溫下不穩(wěn)定等特性；且當(dāng)(CH3)2Cd注入熱的TOPO后，可能產(chǎn)生金屬沉淀， 這些缺點限制了上述方法的推廣使用。2001年P(guān)eng等對以前的方法進(jìn)行了改進(jìn)， 用毒性低安全友好的CdO代替原來有機(jī)相法中的劇毒原料二甲基鎘，在溫和的 條件下制備了 CdS包覆的CdSe量子點，并且其熒光量子產(chǎn)率可以達(dá)到50%以上。 雖然有機(jī)相法合成的量子點

9、有尺寸單分散，熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點，但是因為油 性量子點與生物環(huán)境不相容，并且制備方法不環(huán)保。如果要用在生物分析領(lǐng)域需 要將油相量子點轉(zhuǎn)相為水溶性量子點。油相量子點經(jīng)過水溶性基團(tuán)飾轉(zhuǎn)移到水相 中后，其量子產(chǎn)率會降低，因而在生物分析 領(lǐng)域的應(yīng)用甚少。水相合成法目前，多利用水溶性巰基試劑作為穩(wěn)定 劑直接在水相中合成量子點。巰基試劑對量 子點的穩(wěn)定性及功能化起重要的作用，選擇 帶有適當(dāng)官能團(tuán)的巰基化合物作為穩(wěn)定劑， 對于控制量子點的表面電荷與表面特性極 其重要，尤其當(dāng)需要水溶性量子點做熒光標(biāo) 記時，穩(wěn)定劑的選擇就更為重要了。1994年，Vomeyer提出用巰基為穩(wěn)定劑合成CdS。這 是首次提出用巰基

10、為穩(wěn)定劑合成量子點。1996年Rogach等用水相法成功合成了巰基 乙醇和巰基甘油包覆的CdTe量子點，并得 到了較高發(fā)光效率。1998年Gao等用巰基 乙酸(TGA)作穩(wěn)定劑，制備出水溶性CdTe 量子點。后來Zheng等首先采用水熱法在溫 和條件下合成了水溶性CdTe量子點，大大 縮短了水相法制備CdTe量子點的時間，其 熒光量子產(chǎn)率也超過了 30%。目前水熱法已 經(jīng)成為直接用做生物熒光探針的量子點的 主要合成方法。水相合成量子點CdTe的典 型方法是首先將鎘鹽和巰基穩(wěn)定劑配成溶 液，調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)膒H值，倒入三頸燒瓶中。AFig. 1. QD-nnicelle formation and

11、characterization. (A) Schematic of single-QD encapsulalion in a phospholipid blcck-copolymer micelle. (E) TEM image of QD-micelles dried on a carbon- Formvar-coated 200-mesh nickel grid. Only the QDs inside the miceLLe core are visible. The particles appear evenly spread on the surface. Although som

12、e clusters of two to four QDs are visible, most of the QDs are isolated, suggesting that a majority of micelles contain a single QD. (C)TEM image of the phospholipid layer obtained by negative staining with 1 % PTA (phosphotungstic acid) at pH 7. With this technique, both the QD and the micelle can

13、be visualized at the wme time. The QD (dcirk spot) appears surrounded by wlhite disk of jn- tained phospholipids that stands out against the stained background. A JECL 100CX TEM vva? operated at 80 kV.碲氫化鈉前驅(qū)液的制備是通過硼氫化鈉還原碲粉反應(yīng)而得到的，然后將碲氫化鈉 倒入配好的鎘鹽和巰基穩(wěn)定劑的溶液中，形成CdTe單體，不斷的加熱，CdTe逐漸長大，通過控制加熱時間，可得到不同粒 徑的量子點

14、。水相合成量子點，不僅解決了量子點的水溶性問題，而且采用帶羧 基、氨基等的巰基穩(wěn)定劑對其表面進(jìn)行修飾，使得量子點能與生物分子上的氨基 直接偶聯(lián)，因而可以直接用于生物醫(yī)學(xué)檢測。隨著水溶性量子點的性能不斷提高， 良好的生物相容性的水溶性量子點有望成為新一代生物熒光探針。三、量子點在免疫層析技術(shù)中的應(yīng)用量子點免疫層析技術(shù)利用量子點熒光探針做為標(biāo)記物，不僅充分體現(xiàn)了免疫 層析技術(shù)的簡便，快速，特異性強(qiáng)的優(yōu)點，而且展示了量子點的高靈敏度，以及 它的熒光特性，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。目前深圳市金準(zhǔn)生物 醫(yī)學(xué)工程有限公司開發(fā)的量子點免疫熒光層析定量測試平臺-干式熒光免疫分 析儀（KF-Q001

15、-A）是國內(nèi)首創(chuàng)。在此平臺上研發(fā)的降鈣素原（PCT）定量測定 試劑盒一一量子點（QD）免疫熒光層析法也是國內(nèi)唯一一家成功實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化并 取得注冊證號（粵械注準(zhǔn)20152400386）的量子點診斷試劑。隨著發(fā)展和應(yīng)用趨勢， 越來越多的生物診斷試劑公司加入了量子點這個新興行業(yè)。與此同時，量子點免 疫分析技術(shù)也在不斷地發(fā)展與改進(jìn)，就其發(fā)展趨勢來看，主要有以下幾個方面：優(yōu)化量子點熒光探針的制備，得到熒光強(qiáng)度高的QDs，檢測信號會隨著QDs 的熒光增強(qiáng)而大大提高。單獨的量子點顆粒容易受到雜質(zhì)和晶格缺陷的影響，熒 光量子產(chǎn)率很低，目前廣泛應(yīng)用的是以QDs為核心，用另一種半導(dǎo)體材料包覆 形成核殼結(jié)構(gòu)后，如CdTe/ZnS，可將量子產(chǎn)率提高到約50%甚至更高，并在消 光系數(shù)上有數(shù)倍的增加，因而有很強(qiáng)的熒光發(fā)射，可大大提高檢測靈敏度，有利 于信號的檢測。實現(xiàn)定量檢測。至今已有部分實驗室或公司研制出QDs熒光定量的儀器，從 而可以定量檢測出待測物的濃度，這將使量子點免疫層析技術(shù)得到更廣泛的應(yīng) 用，打破了傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)不能定量的限制。量子點的多色檢測。QDs其中一個優(yōu)點就是具有可精確調(diào)諧的發(fā)射波長?？?以通過調(diào)整粒子尺寸來得到不同發(fā)射的熒光QDs，無需改變粒子的組成和表面性 質(zhì)。使得量子點可以用于多種組分的多色標(biāo)記，實現(xiàn)多組份的同時檢測。這將