綜述藥品生產(chǎn)車間污染菌溯源技術(shù)

1、藥品生產(chǎn)車間污染菌溯源技術(shù)綜述前言：微生物包括：細(xì)菌、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體，它微小，生存能力強(qiáng)，蹤跡遍布全球各個(gè)角落。涵蓋了有益跟有害的眾多種類，廣泛涉及食品、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領(lǐng)域。200年前列發(fā)現(xiàn)微生物世界以后的間，微生物學(xué)的研究基本上停留在形態(tài)描述和分門別類階段。顯微鏡技術(shù)使人類開始認(rèn)識(shí)了微生物，然而在對(duì)微生物的生 命活動(dòng)和功能有所知曉之前，微生物學(xué)并沒(méi)有誕生。直到19世紀(jì)中期，以法國(guó)斯德和德國(guó)的為代表的科學(xué)家才將微生物的研究從形態(tài)描述推進(jìn)到生理學(xué)研究階段，了微生物是造成發(fā)酵和人畜疾病的原因，并建立了分離、培養(yǎng)、接種和滅菌等一系列獨(dú)特的微生物技術(shù)。從

2、而奠定了微生物學(xué)的基礎(chǔ)，促使微生物學(xué) 迅速誕生，同時(shí)開辟了醫(yī)學(xué)和工業(yè)微生物等分支學(xué)科。無(wú)菌藥品是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的特殊商品，微生物是無(wú)菌產(chǎn)品主要污染來(lái)源?？稍?、物料、公用系統(tǒng)、工藝流程設(shè)計(jì)、操作設(shè)計(jì)、包裝系統(tǒng)、測(cè)試方式方法等各個(gè)環(huán)節(jié)產(chǎn)生。發(fā)現(xiàn)異常物質(zhì)時(shí)，首先要確定異常物質(zhì)是不是微生物？是的話，是什 么微生物？它從哪里來(lái)的？如何去除方法？鑒別微生物是任何有關(guān)環(huán)境或事件 中的基礎(chǔ)部分。國(guó)內(nèi)外動(dòng)態(tài)：2015版中國(guó)藥典全面與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌，建議對(duì)受控環(huán)境收集到的微生物進(jìn)行適當(dāng)水平的鑒定，以掌握微生物菌群信息，有助于制定有效的清潔、及微生物檢測(cè)方法。通則9204對(duì)檢出微生物的鑒定已做了明確規(guī)定，當(dāng)微生物的鑒定

3、結(jié)果有爭(zhēng)氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè) (Bergeys Manual of Systematic議時(shí)，以Bacteriology)現(xiàn)行版的鑒定結(jié)果為準(zhǔn)。微生物鑒定是指借助現(xiàn)有的分類系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)未知微生物的特征測(cè)定，對(duì)其進(jìn)中分離的微生物進(jìn)行鑒定，以判定試驗(yàn)是否重試；藥品潔凈微生物監(jiān)測(cè)和控制指導(dǎo)原則（通則 9203）中建議對(duì)潔凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進(jìn)行鑒定，以掌握環(huán)境微生物污染情況，有助于污染。此外，在藥品生產(chǎn)中，有時(shí)亦需對(duì)藥物原料、輔料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)品中檢出的微生物進(jìn)行適 當(dāng)水平的鑒定。微生物鑒定系統(tǒng)是基于不同的分析方法，其局限性與方法和數(shù)據(jù)庫(kù)的局限息相關(guān)，未知菌鑒定時(shí)通過(guò)與

4、微生物鑒定系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配來(lái)完成。如果數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有此模式菌株，就無(wú)法獲得正確的鑒定結(jié)果。在日常的微生物鑒定試驗(yàn)中，用戶應(yīng)明確所采用鑒定系統(tǒng)的局限性及所要達(dá)到的鑒定水平(屬、種、菌株)，選用最適合要求的鑒定技術(shù)，必要時(shí)采用多種行細(xì)菌、酵母菌和霉菌大類的區(qū)分，或?qū)佟⒎N及菌株水平確定的過(guò)程，它是藥品微生物檢驗(yàn)中的重要環(huán)節(jié)，藥典通則相應(yīng)章節(jié)中對(duì)檢出微生物的鑒定做了明確規(guī)定，如“非無(wú)菌藥品的微生物檢查:控制菌檢查”（通則 1106）中選擇培養(yǎng)基或指示培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)的疑似菌落需進(jìn)行鑒定； 對(duì)“無(wú)菌檢查法”（通則 1101）的陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果鑒定方法確定。目前微生物鑒

5、定方法主要有以下幾點(diǎn)：（1）常規(guī)鑒定 常規(guī)鑒定內(nèi)容有形態(tài)特征和理化特性.形態(tài)特征包括顯微形態(tài)和培養(yǎng)特征；理化特性包括營(yíng)養(yǎng)類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應(yīng)、酶反應(yīng)和學(xué)反應(yīng)等.（2）BIOLOG碳源自動(dòng)分析鑒定 BIOLOG鑒定系統(tǒng)以微生物對(duì)不同碳源的利用情況為基礎(chǔ),檢測(cè)微生物的特征圖譜,建立與微生物種類相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù).通過(guò)將待測(cè)微生物與數(shù)據(jù)庫(kù)參比,得出鑒定結(jié)果.該系統(tǒng)已獲FDA認(rèn)可,已逐步應(yīng)用于食品和飲品企業(yè)、環(huán)保、海洋生物/水產(chǎn)品、制藥、農(nóng)業(yè)微生物、生物治理、化妝品、臨床等領(lǐng)域的微生物鑒定試驗(yàn)中.CICC擁有國(guó)內(nèi)最全的BIOLOG數(shù)據(jù)庫(kù),涉及革蘭氏菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、厭氧菌、酵母、絲狀真菌在內(nèi)

6、近2000種微生物.（3）分子生物學(xué)鑒定 由于大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的，所以 DNADNA 雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、16S rRNA 序列和 18S rRNA 序列、多位點(diǎn)序列分型、焦磷酸、DNA 探針和核糖體分型分析等型微生物鑒定方法從遺傳進(jìn)化角度闡明微生物種群之間的分類學(xué)關(guān)系,是目前微生物分類學(xué)研究普遍采用的鑒定方法.CICC擁有微生物菌種分類鑒定的分子生物學(xué),配有PCR儀、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、HPLC、凝膠成像系統(tǒng)、紫外控溫分析系統(tǒng)等先進(jìn)儀器設(shè)備,以及DNAMAN、BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列.（4）API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)API鑒定系統(tǒng)涵蓋15個(gè)

7、鑒定系列,約有1000種生化反應(yīng),目前已可鑒定超過(guò)600種的細(xì)菌.鑒定過(guò)程中,可根據(jù)細(xì)菌所屬類群選擇適當(dāng)?shù)纳砩b定系列,通過(guò)將待測(cè)細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫(kù)參比,得出鑒定結(jié)果.CICC目前可應(yīng)用API 50CH系列、API 20 E系列、API Sta系列對(duì)乳酸桿菌（Lactobacillus sp.）和相關(guān)細(xì)菌、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌屬（Staylococcus sp.）、微球菌屬（Micrococcus sp.）和菌屬（Locuria sp.）進(jìn)行鑒定.（5）TLC薄層層析CICC將TLC薄層層析技術(shù)應(yīng)用于微生物菌種鑒定,進(jìn)行細(xì)菌、放線菌細(xì)胞壁化學(xué)組分分析（氨基酸、糖）,作為

8、劃分屬特征的重要鑒定技術(shù),起到了良好的輔助作用.（6）全細(xì)胞脂肪酸分析鑒定系統(tǒng) 采用Sherlock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng),通過(guò)對(duì)不同菌株的脂肪酸圖譜進(jìn)行分析,并 與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),來(lái)鑒定細(xì)菌及酵母.該技術(shù)是細(xì)菌或酵母種水平鑒定的有效之一.微生物常規(guī)鑒定技術(shù)簡(jiǎn)介：為了迅速而簡(jiǎn)單地鑒定一個(gè)有機(jī)體，鑒定時(shí)，一般先將待檢菌進(jìn)行初步的分類。在鑒定工作中所應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)保持最少，這是很重要的。為做到這一點(diǎn)，首先必須明確鑒定目的。大多數(shù)非無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程和部分無(wú)菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，對(duì)所檢出微生物鑒定需達(dá)到的水平視情況而定，包括種、屬鑒定和菌株分型。微生物的常規(guī)特征包括菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)(桿狀、球

9、狀、細(xì)胞群、孢子形成模式等)、革 蘭染色或其它染色法、及某些能夠給出鑒定結(jié)論的關(guān)鍵生化反應(yīng)(如氧化酶、過(guò)氧化氫酶和凝固酶反應(yīng))進(jìn)行分析，一般即可滿足需要；非無(wú)菌產(chǎn)品的控制菌檢查一般應(yīng)達(dá)到種屬的水平；無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性和無(wú)菌生產(chǎn)模擬工藝（如培養(yǎng)基灌裝）失敗時(shí)，對(duì)檢出的微生物鑒定至少達(dá)到種屬水平，必要時(shí)需達(dá)到菌株水平。微生物鑒定的操作技術(shù)1、待檢菌的分離純化微生物鑒定的第一步是待檢培養(yǎng)物的分離純化，微生物在自然界中呈混雜狀態(tài)存在，每種微生物有不同的形態(tài)和生理特征，要了解某種微生物，就必須單獨(dú)2、表型試驗(yàn)表型微生物鑒定通常需要大量的純培養(yǎng)物，而微生物的恢復(fù)、增殖和鑒定易受性。因此，在表型鑒定時(shí)應(yīng)注意采

10、用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和傳代次數(shù)對(duì)鑒定結(jié)果的影響。目前已有的基于碳源利用和生化反應(yīng)特征的鑒定方法，如氣相色譜法分析微生物的脂肪酸特征、MALDI-TOF質(zhì)譜法分析微生物蛋白等微生物鑒定系統(tǒng)，在進(jìn)行結(jié)果判斷時(shí)需借助于系統(tǒng)自身的鑒別數(shù)據(jù)庫(kù)，還依賴特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法以確保鑒定結(jié)果的一致性。 表型微生物鑒定方法已廣泛應(yīng)用于藥品微生物。根據(jù)微生物表型鑒定所提供的信息可以判斷藥品中污染的微生物種類，也可掌握環(huán)境微生物菌群的變化，并進(jìn)行產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。在許多質(zhì)量控制中，單獨(dú)的表型鑒定結(jié)果就能給出充足的信息幫助進(jìn)行深入，并按需要制定適宜的糾正措施。初篩表型試驗(yàn) 常規(guī)的微生物鑒定，一般要先進(jìn)行初篩試驗(yàn)確定待檢

11、菌的基本微生物特征，將 待檢菌做初步分類。常見(jiàn)的初篩試驗(yàn)包括：培養(yǎng)物： 菌落形態(tài)、菌落顏色、形狀、大小和產(chǎn)色素；形態(tài)學(xué)： 細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞大小、細(xì)胞形狀、鞭毛類型、內(nèi)容物、革蘭氏染色、 芽孢和抗酸染色、孢子形成模式 ；生理學(xué)： 氧氣耐受性、 范圍、最適溫度和范圍、耐鹽性；生態(tài)學(xué)：微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件等。培養(yǎng)時(shí)間影響，事實(shí)上許多環(huán)境微生物在普通的微生物增殖培養(yǎng)基中是無(wú)法恢復(fù)的；此外，一些從初始培養(yǎng)物中剛分離出的受損微生物還可能不能完整的表達(dá)其表型屬把這種微生物分離出來(lái)研究。微生物分離和純化的方法很多，最常用的分離純化方法是挑取待檢菌在適宜的固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化，以獲取待檢菌的

12、純培養(yǎng)物（單個(gè)菌落）必要時(shí)可進(jìn)一步進(jìn)行純培養(yǎng)，也可采取稀釋分離法，即將待分離的樣品進(jìn)行一定的稀釋，并使微生物的細(xì)胞(或孢子)盡量以分散狀態(tài)存在，然后使其長(zhǎng)成一個(gè)個(gè)純種單菌落。微生物的生長(zhǎng)條件也是準(zhǔn)確測(cè)定微生物的重要前提條件，應(yīng)選擇能使特定樣品中微生物生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基，可通過(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)試驗(yàn)證實(shí)。使用培養(yǎng)基前要檢查其靈敏度和無(wú)菌性。根據(jù)不同的檢查項(xiàng)目選用各類培養(yǎng)基，確定培養(yǎng)溫度和時(shí)間。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的采用的培養(yǎng)條件要與實(shí)際檢測(cè)的條件相一致， 以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性與重現(xiàn)性。從藥物原材料、制藥用水、及生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)物和終產(chǎn)品的樣品中檢出的受損微生物，經(jīng)分離純化程序使其由不利生存易產(chǎn)生變化的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵跔I(yíng)養(yǎng)富集

13、和最佳培養(yǎng)溫度條件下生存的穩(wěn)定狀態(tài)，以保證鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性。初篩試驗(yàn)可為評(píng)估提供有價(jià)值的信息，對(duì)于微生物鑒定方法來(lái)說(shuō)，初篩試驗(yàn)是最關(guān)鍵的一步，若給出了錯(cuò)誤的結(jié)果，將影響后續(xù)試驗(yàn)，包括微生物鑒定試劑盒和 引物的選用。 進(jìn)一步表型鑒定 通過(guò)比較微生物的理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異的進(jìn)一步進(jìn)行鑒別。生化反應(yīng)： 碳源的利用、碳水化合物的氧化或發(fā)酵、酶的模式 抑制性： 膽鹽耐受性、抗生素敏感性、耐受性 學(xué)： 凝集反應(yīng)、熒光抗體 化學(xué)分類： 脂肪酸、微生物毒素、全細(xì)胞組分 生態(tài)學(xué)：細(xì)胞成分、表面抗原、生化反應(yīng)和對(duì)抗菌劑的敏感性等表型的表達(dá)， 微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件等。4、型（分子遺傳

14、學(xué)）微生物鑒定傳統(tǒng)的細(xì)菌分類一直以分離培養(yǎng)為前提，然后再依據(jù)其形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)特征以及免疫學(xué)特征加以鑒定。只能反映極少數(shù)微生物的信息。20世紀(jì)6O年代末 Woese CR開始采用寡核苷酸編目法對(duì)生物進(jìn)行分類。分子生物學(xué)理論與技術(shù)的迅速發(fā)展給傳統(tǒng)微生物分類鑒定帶來(lái)了巨大的革新.當(dāng)代微生物分類學(xué)利用遺傳學(xué)原理和方法分析微生物種、屬間的親緣關(guān)系.遺傳分類法是根據(jù)核酸分析得到的遺傳相關(guān)性(genectic relatedness)所做的分類.因?yàn)檫@種分類方法是以決定生物表型特征的遺傳物質(zhì)-核酸作為比較的準(zhǔn)繩,所以它是一種客觀和度較高的分類方法1.目前較常使用的方法有：1 、DNA 中 G+Cmol

15、%分析每一個(gè)微生物種的 DNA中 GCmol% 的數(shù)值是恒定的，不會(huì)隨著環(huán)境條件、培養(yǎng)條件等的變化而變化，而且在同一個(gè)屬不同種之間，DNA中 GCmol%的數(shù)值不會(huì)差異太大，可以某個(gè)數(shù)值為中心成簇分布，顯示同屬微生物種的 GCmol%范圍。 DNA 中GCmol%分析主要用于區(qū)分細(xì)菌的屬和種，因?yàn)榧?xì)菌 DNA中 GC含量的變化范圍一般在 25 75 ；而放線菌 DNA 中的 GC 比例范圍非常窄 (37 51%) 。一般認(rèn)為任何兩種微生物在 GC 含量上的差別超過(guò)了10 ，這兩種微生物就肯定不是同一個(gè)種。因此可利用 G+Cmol來(lái)鑒別各種微生物種屬間的親緣關(guān)系及其遠(yuǎn)近程度。共有兩種方法可測(cè)，溶

16、解溫度（Tm）法*和浮力密度法*。溶解溫度（Tm）法的操作步驟菌株培養(yǎng)和收集DNA 提取和純化Tm 測(cè)定計(jì)算2 、16SrRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析DNA 提取從平板中直接挑取一環(huán)分離菌株細(xì)胞,破壁，抽提得到 DNA，加通用引物， PCR擴(kuò)增，（3）( )，計(jì)算機(jī)自動(dòng)開始搜索核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中序列并進(jìn)行序列比較，根據(jù)同源性高低列出相近序列及其所屬種或?qū)?，以及菌株相關(guān)信息，從而初步判斷 16SrDNA鑒定結(jié)果。3 、DNA-DNA雜交* 結(jié)雙鏈 DNA后根據(jù)能生成雙鏈的情況，檢測(cè)雜合百分?jǐn)?shù)。（4）迅速將比色杯內(nèi)的溫度上升到 50左右，取出比色杯檢查有無(wú)氣泡，氣泡用手指輕（6）測(cè)定

17、終點(diǎn)判斷 從 50開始繼續(xù)加熱，同時(shí)變性曲線，當(dāng)溫度增加到 A260 吸收不再任何微生物鑒定都應(yīng)從微生物形態(tài)學(xué)、生理要求和微生物來(lái)源等方面判斷鑒定結(jié)果是否合理。錯(cuò)誤的鑒定會(huì)導(dǎo)致不恰當(dāng)?shù)募m正和預(yù)防措施及產(chǎn)品處置。 微生物鑒定方法的確認(rèn)應(yīng)包括準(zhǔn)確度、專屬性、重現(xiàn)性、靈敏度、陽(yáng)性值、值。型鑒定與表型鑒定的結(jié)果差異的情況相對(duì)比較少見(jiàn)，例如，具有相同或非常相似的微生物具有不同的表型、具有相似表型的卻具有不同的以及型距離很遠(yuǎn)的微生物不能被歸為同種或同屬。多相分類學(xué)的概念是匯集和吸收了分子生物學(xué)、生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、學(xué)或生態(tài)學(xué)資源的多層信息進(jìn)行微生物分類，例如，微生物特征描述、表型和數(shù)據(jù)及微生物來(lái)源等，都可被成

18、功的應(yīng)用于微生物鑒定中，以避免因使用單一鑒定方法做出毫無(wú)意義的結(jié)論。 菌株水平的鑒定在污染過(guò)程中非常重要，尤其適用于產(chǎn)品中的微生物數(shù)量物進(jìn)行評(píng)估。 同一地點(diǎn)的同種菌其表型特征和型特征是基本一致的。不同地點(diǎn)的同種菌表型特征可能基本一致，但保守及可變區(qū)域的特征會(huì)有一定的差異性。因此污染等應(yīng)以型特征鑒定為主，表型特征鑒定為輔。 實(shí)際工作中無(wú)菌試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果中分離出的微生物，經(jīng)對(duì)其溯源分析，確認(rèn)污染歸因于無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中所使用的材料或無(wú)菌技術(shù)的差錯(cuò)，該試驗(yàn)可判無(wú)效，否則判該產(chǎn)品不符合要求。對(duì)潔凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進(jìn)行適當(dāng)比率的鑒定，高于建議水平或出現(xiàn)異常高的微生物檢出情況時(shí)。菌株水平的鑒定在無(wú)

19、菌工藝中也很重要，在無(wú)菌試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性和培養(yǎng)基灌裝等模擬工藝失敗時(shí)，必須對(duì)檢出的微生增加時(shí)即為測(cè)定終點(diǎn)。（7）GC 含量計(jì)算在 0.1SSC 溶液中，G+C mol%的計(jì)算公式為： G+C mol%=51.2+2.08（Tm（X）- Tm（R）其中 Tm（X）為待測(cè)菌 Tm 值，Tm（R）為 E.coli K-12 的的 Tm 值總結(jié)：彈除去。（5）設(shè)置測(cè)定程序 按照每分鐘升溫 1的速度設(shè)置升溫程序，具體的設(shè)置方法按儀器使用說(shuō)明進(jìn)行。DNA 提取將帶測(cè)菌株的 DNA 分別裝入兩只石英比色杯中，塞好帶有晶體管點(diǎn)溫度計(jì)熱敏電阻探頭的塞子，另一帶塞子的石英比色杯裝入 0.1SSC 作空白對(duì)照。比色杯放入分光光度計(jì)的帶有加熱裝置的比色架內(nèi)，固定波長(zhǎng)在 260nm。DNA雜交法的基本原理是用 DNA解鏈的可逆性和堿基配對(duì)的專一性，將不同來(lái)源的 DNA在體外加熱解鏈，并在合適的條件下，使互補(bǔ)的堿基重新配對(duì)（4） 將所得序列通過(guò) Blast 程序與 GenB中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析掌握環(huán)境微生物污染情況，有助于污染。 為了確證微生物為同種中的兩個(gè)相同株，需比對(duì)的序列和特征片段，甚至是全的比對(duì)，實(shí)現(xiàn)既鑒定又溯源的目的，同時(shí)保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，有些微生物的溯源還需結(jié)合表型特征鑒定，如沙門菌屬（ 型的鑒定）