超臨界CO2萃取天然產(chǎn)物

1、使用超臨界二氧化碳從向日葵葉提取具有生物活性的天然化合物L(fēng). Casasa, C. Mantella, M. Rodrf gueza, A. Torresb, F.A. Macf asb, E. Martf nez de la Ossaa化學(xué)工程系，食品技術(shù)和環(huán)境技術(shù)，科學(xué)學(xué)部，University of Cadiz, Box 40, 11510 Puerto Real, Cadiz,西班牙摘要超臨界二氧化碳在提取油葵（向日葵）生物活性化合物的應(yīng)用中進(jìn)行了研究。 含有不同的變量，包括前處理的樣品，溫度和壓力。將樣品干燥或凝結(jié)的提取條 件如下：35，40，45和50C的溫度下，壓力為100，20

2、0，300，400和500bar。 使用干燥后的樣品，在溫度為50C和壓力為500bar達(dá)到最好的萃取率。根據(jù)不 同的條件集合得到的提取物的生物活性進(jìn)行了比較。關(guān)鍵詞 向日葵；天然產(chǎn)物超臨界二氧化碳萃取；生物活性化合物1引言天然產(chǎn)物的復(fù)雜性往往需要最大效能的從樣品制備、分離和鑒定使用方法。 天然產(chǎn)品往往是通過以下常規(guī)方法提取和分離技術(shù)獲得，如使用有機(jī)溶劑提取物 質(zhì)和柱色譜法，高速液相色譜（HPLC ）純化法。這些技術(shù)涉及使用環(huán)境不友好的有機(jī)溶劑，常規(guī)的分離方法通常是繁瑣，費(fèi) 時，需要多個步驟，更糟的是，樣本被不可逆地吸附到固定相。在天然產(chǎn)物領(lǐng)域 微波輔助萃取、加速溶劑萃取法和超臨界流體萃?。⊿

3、FE）新技術(shù)利用少量的有 機(jī)溶劑。超臨界二氧化碳可以替代不具有任何相關(guān)的傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑1的負(fù)面影 響。在最佳條件下，超臨界流體萃取提供有效，重復(fù)性好，快速萃取2。這種技 術(shù)已被證明產(chǎn)生比索氏提取，超聲處理，加速溶劑萃取同等或更好的結(jié)果。超臨界條件下二氧化碳提取在環(huán)境影響方面構(gòu)成一個新興的技術(shù)。在使用二 氧化碳的優(yōu)點(diǎn)包括其無毒性，化學(xué)惰性，成本低和隨時可用的。此外，使用二 氧化碳也有利于提高獲得的產(chǎn)品品質(zhì)，因為這種技術(shù)并不引起過度加熱，加熱對 熱不穩(wěn)定的化合物通常具有負(fù)面影響。使用二氧化碳超臨界流體萃取代替有機(jī)溶 劑，二氧化碳具有不尋常的性能，如高的可壓縮性，液體狀的密度，高擴(kuò)散性， 低粘度和低

4、表面張力。其結(jié)果是，超臨界流體中顯示了比常規(guī)的有機(jī)溶劑從復(fù)雜 基質(zhì)的材料更大的超細(xì)矩陣擴(kuò)散能力，從而提高了提取率。由于眾多的參數(shù)：提 取時間，壓力，溫度，流量，攻絲技術(shù)和超臨界流體組合物，其他萃取方法相比， 超臨界流體萃取過程的優(yōu)化是一個復(fù)雜的過程。除了大量的參數(shù)，每個因子也可 以對提取效率有顯著影響。因此，建立的最佳設(shè)置既是一個非常重要的又有可能 是很費(fèi)時的過程。幾種統(tǒng)計技術(shù)，如因子設(shè)計與多直系回歸，在優(yōu)化分析方法已 經(jīng)采用。因子設(shè)計有一定的優(yōu)勢，可以提供全局最佳條件，大量的定量信息可以 得到和可估計離散和連續(xù)的因素。已被用于因子設(shè)計，以確定影響上的過程中有 許多參數(shù)，包括溫度，壓力，前處理

5、的樣品，提取時間，流體流速，加入改性劑5。幾項研究已經(jīng)表明，向日葵屬（向日葵）含有具有生物活性性質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)， ，10，11。這種植物的提取物可以作為一種天然的除草劑使用，以減少控 制作物對合成除草劑的依賴。向日葵是其生物活性方面的研究最廣泛的植物之 一，第一參考關(guān)于它的化感效應(yīng)于1931年發(fā)表。然而，在這些絕大多數(shù)情況下， 葉子的水提取物的生物活性被研究和非極性溶劑的萃取極少被研究6，12。在以往的工作中，我們開始著手解決向日葵的葉子中提取生物活性物質(zhì)。前 處理樣品和助溶劑的存在下，對所得到的提取物的產(chǎn)率和生物活性的影響進(jìn)行了 以下研究。實驗涉及低和高極端的溫度和壓力，即100和500bar

6、的壓力下，35和50C 之間。然而，對于研究壓力和溫度的中間值也是重要的?；谝郧暗墓ぷ髦械玫?的有希望的結(jié)果，決定使用二氧化碳作為提取溶劑，12。前處理的向日葵葉提 取物在收率和生物活性方面是一個關(guān)鍵因素。當(dāng)在極端的溫度和壓力值時進(jìn)行提 取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干燥的樣品給出了最好的產(chǎn)率和凝結(jié)的樣品的最佳生物活性數(shù)據(jù)。 因此，對前處理兩種類型的壓力和溫度的影響進(jìn)行更深入的研究。在異種抑制作用研究方面，對于異種抑制作用的植物物種的篩選和生物活性 粗提物，分離部分和純化合物而言，生物分析是有用的工具。異種抑制作用的發(fā) 現(xiàn)策略涉及粗提物的篩選和純化生物活性的化合物。最初的生物測定必須要快、 經(jīng)濟(jì)和系統(tǒng)問題與

7、相關(guān)的。一個為純化合物的隔離生物活性導(dǎo)向的分餾過程之后 是通過生物測定；因此，全過程（提取，分離和純化步驟）取決于生物測定結(jié)果。 在這個階段，我們是在第一層次;研究高效提取新技術(shù)用于固體物提取，而不會 失去活性。下一個層次的研究將涉及化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，并發(fā)現(xiàn)最終生物活性化合物 和比較這些結(jié)構(gòu)與先前使用常規(guī)提取方法分離化合物的生物活性的數(shù)據(jù)。這里進(jìn) 行的工作涉及多項實驗數(shù)據(jù)，為了分析對采用超臨界二氧化碳時生物活性物質(zhì)的 提取率的效果，進(jìn)行一個多層次的階乘設(shè)計的溫度和操作壓力，隨后使用該程序 STATGRAPHICS大5.1 （統(tǒng)計Graphics公司）開發(fā)的經(jīng)驗公式來預(yù)測的提取過程 中得到的產(chǎn)率。2

8、材料與方法2.1樣品和化學(xué)品葉向日葵屬（品種艾塔娜）在2005年7月期間收集的第三家工廠的發(fā)展階 段（植物1.2米高的花，收獲前1個月）和植物提供：默塞德牧場，農(nóng)業(yè)研究 站（CIFA），軍政府的安達(dá)盧西亞，西班牙赫雷斯。將樣品存儲兩組條件下，以評估每個提取物的提取率和生物活性方面的行 為：樣品凝結(jié)在-25C。樣品在室溫下干燥（251C），直至達(dá)到恒重。其它化學(xué)所用的試劑的式樣頃中給定的于表1。表1ReagentPurityCompanyCarburosUseExtraction atCarbon dioxide99.995%Metallichigh pressureWaterMilli QCo

9、solventMethanolPAPanreacCollection ofextracts andReagentPurityCompanyUsecosolventCitric acid monohydratePotassium phosphatePAPanreacPreparation of bufferDi-basic 3-hydratePAPanreacPreparation of bufferSucrosePAPanreacPreparation of bufferDissolution ofDimethyl sulfoxidePAPanreacthe extractsand cosol

10、vent2.2高壓提取提取物在伊斯科進(jìn)行了提?。▋?nèi)布拉斯加州，美國，220模型SFX）。該設(shè)備 包括一個提取器，一個SFX200控制器，限流器和一個注射器泵。在以前的出版 物12中可以找到的設(shè)備的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)的示意圖。操作系統(tǒng)方法裝載約2克樣品萃取小柱，在所有的實驗中先前已均勻化以保 持恒定的表觀密度。卡盒然后引入到提取器中，并放置15分鐘以達(dá)到工作溫度。 該泵用二氧化碳加載，直到達(dá)到泵的工作壓力。自動提取的減壓閥被關(guān)閉，打開 泵連接的閥被和打開提取閥。然后用二氧化碳加壓提取，允許經(jīng)過一段時間的 15分鐘靜態(tài)萃取。微米閥已達(dá)到平衡狀態(tài)時，打開微米閥恒溫控制的節(jié)流閥（40C時），直 到一個恒定的

11、流量達(dá)到7.03mmol/min。然后進(jìn)行5小時的提取。對每個樣品的 實驗進(jìn)行了一式兩份，以評估測量的變異性。將萃取液收集在含有甲醇的玻璃試管中，并儲存在4T下的光照條件下，直 到隨后的分析中排除。提取過程完成后，在40r的溫度下用氮?dú)饬鞒ト軇?。中間的壓力條件進(jìn)行了測試，用的下限為100bar，因為它附近的二氧化碳 的臨界壓力（72bar）壓力上限被所使用的設(shè)備（500bar）限制?？赡艿臒峤到?的物質(zhì)在相對低的溫度，35，40，45和50C進(jìn)行實驗。2.3實驗設(shè)計a多層次的因子設(shè)計為了確定因素影響的過程和它們之間的關(guān)系，進(jìn)行一個多層次的因子設(shè)計。 選擇的變量進(jìn)行實驗設(shè)計如下：樣品的前處理，

12、提取溫度和提取壓力物理值示于 表2在此設(shè)計基礎(chǔ)上，一共有40個實驗，在一個隨機(jī)的方式進(jìn)行，以減少錯誤。表2中實驗設(shè)計的物理值LevelsFactor Experimental variableAPre-treatmentCongealed DryTTemperature (C)35 4045 50PPressure (bar)100 200 300 400 500對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行用于連同程序STATGRAPHICS+ 5.1 （1994-2001，統(tǒng)計 Graphics公司）開發(fā)的經(jīng)驗關(guān)系式，預(yù)測的提取中獲得的產(chǎn)率。2.4生物測定胚芽鞘生物測定構(gòu)成一個重要的工具，根據(jù)上一節(jié)中所描述的條件，來評估

13、所提取 的物質(zhì)的生長抑制或刺激的活動。在黑暗中小麥（普通小麥品種杜羅）種子播種 在直徑15厘米的培養(yǎng)皿蘸清水生長，221C下為3天。從芽的根和穎果被拆 除。后者被放置在一個鍘和心尖部2毫米的部分被切斷，并丟棄。在接下來的4 毫米長的胚芽鞘被拆除，并用于生物測定。所有的操作均根據(jù)綠色安全燈。化合 物溶解于DMSO中，并稀釋到最終的生物測定濃度。平行控制，也可以運(yùn)行7在2.2節(jié)中所描述的條件下稱量得到的各提取物的樣品（16mg）。用來測定 生物活性的提取物加入到試管中，并溶解在16毫升含有2%蔗糖的水溶液的磷 酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液（pH5.6）中。因此，加入的提取物是不溶于水和DMSO， 以確保完

14、全溶解。對每個提取物用以類似的500，250和125 ppm方案方式制備。在22C下黑暗中，五胚芽鞘被放置在每個試管中的樣品以每分鐘6轉(zhuǎn)的旋 轉(zhuǎn)的輥管裝置旋轉(zhuǎn)24小時。胚芽鞘長度通過圖像的數(shù)字化進(jìn)行測量。數(shù)據(jù)從控 制的百分比差異表現(xiàn)出來。每次檢測進(jìn)行四次，并每隔一天檢測。2.5集群分析使用SPSS10.0程序（社會科學(xué)統(tǒng)計軟件包）進(jìn)行統(tǒng)計處理?；谏锘钚詫γ恳粋€的不同組提取條件的數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。為了進(jìn)一步 分析簇之間的關(guān)系，形成集群那些個體，樹狀圖生成的聚類分析之間的歸一化數(shù) 據(jù)的平方歐氏距離，用于測量樣本之間的相似性。3實驗結(jié)果十葉的萃取率示于圖中。1在不同的壓力，溫度和樣品的預(yù)處理條件

15、下，提 取時間為5小時。Sample congealed ai -25 父Sample driedJJdulus .MPbl- ME800- 圖f購從實同的操作i 3結(jié)果示于表3。圖用圖形來表示方程。圖2干樣品在不X 500 barts p-valUe35 CPressure (P) 390.69 0.0000Temperature0.0010(T)47.29Pre-treatment(A)399.28 0.0000PP-6.38 0.5049PT212.95 0.0000PA184.08 0.0000TT12.990.5739TA8.420.5413.100在-300一和50喚的壓力得到的提

16、取物的生物活性測定的結(jié)果示于圖3中。數(shù)據(jù)表示為控制的百分比差異，一個零值代表一個相同值的控制。另方面，正值表示刺激參數(shù)和一個負(fù)值表示根據(jù)給定的實驗條件下小麥胚芽鞘的生長抑制。Dendrogram4討論結(jié)果4.1提取率根據(jù)我們的實驗數(shù)據(jù)（圖1）,從干燥的樣品，得到最佳的萃取率。一旦葉 子已被切斷，原料的存儲是一個基本因素，關(guān)鍵是要知道他們經(jīng)過處理如何影響 提取率和生物活性物質(zhì)。此外，研究了提取過程同時顯著影響的兩個變量是選擇 性的壓力和溫度。其中的水分凝結(jié)樣品似乎是一個削弱了提取率的因素，水作為 溶劑與超臨界CO競爭。如果過量的水保留在萃取容器中，高水溶性的溶質(zhì)進(jìn)行 分區(qū)到水相中，因此，超臨界流

17、體萃取回收將是低的。從圖1中可以看出，在一個恒定的溫度，提高壓力增加超臨界流體的密度。 即，其溶劑化功率變大，更多的物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到超臨界CO，這意味著有利于提取 過程。出于這個原因，在升高的壓力下進(jìn)行提取看來有利的。溫度上升，在恒定壓力下（100至200bar），證明是不利的提取過程。例如， 在壓力為100和200bar時，溫度增加導(dǎo)致提取率的下降。這種現(xiàn)象被歸因于在 超臨界流體的密度減少，它的溶解力下降。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，50C和100bar 是不可取的，因為它的收益率是非常低的。然而，在較高壓力下（400和500bar） 溫度上升，有利于提取過程的物質(zhì)的蒸汽壓力的增加，由于提取的改變超過補(bǔ)

18、償 在超臨界CO的密度的減少。超臨界流體萃取，在溫度高于50C不進(jìn)行，以便避 免熱降解的化合物。這些結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致13，14。300bar時提取率與溫度無關(guān)。超臨界二氧化碳濃度的減少和化合物的蒸氣 壓的增加隨著溫度的升高之間有補(bǔ)償。出于這個原因，在此壓力下，研究系統(tǒng)的 行為是非常重要的。同時牢記上述結(jié)果，進(jìn)行一般相關(guān)的生物測定，對在300bar得到的提取物， 和在500bar所獲得的提取物給定的溫度對提取率的影響非常小，因為這些提取 率最高。4.2實驗設(shè)計分析實驗設(shè)計的分析結(jié)果示于表3。給出估計影響和研究變量范圍的相互作用和 提取過程的方差分析。每個相關(guān)聯(lián)的符號的效果表示一個正或負(fù)的對產(chǎn)率

19、的影響, 各因素的重要性的程度由它的p值表示在表3中，當(dāng)一個因素具有一個p-值小于 0.05，在0.95置信水平的顯著影響的過程。所獲得的結(jié)果表明、壓力、溫度、前處理和組合的相互作用壓力/溫度和壓 力/前處理有顯著的影響（95%置信水平），對過程的影響為正。使用的實驗數(shù)據(jù)和程序STATGRAPHICS得到經(jīng)驗關(guān)聯(lián)。這些相關(guān)性與變量 相關(guān)影響超臨界臨界二氧化碳的生物活性化合物的提取工藝。下面給出了得到的 表達(dá)（式（1）。（1）R=10.02 X 210- 1.91P- 27.96T- 37.73A- 2.04 X 10- 4P2+7.09 X 10- 2PT+ 0.46PA+0.11T2+0.5

20、6TA其中R是提取率毫克extract/100克十樣品A的前處理， T為溫度 C，P為壓力bar。將所得的相關(guān)系數(shù)為0.97。（1）在圖中以圖形方式表示，在不同的操作條件下，干樣品。圖表的詳細(xì)分 析表明，產(chǎn)量最高的是在50 C和500bar;其他方面，如生物活性和經(jīng)濟(jì)方面需 要考慮，對一個過程還必須考慮到選擇合適的壓力。4.3生物測定為了選擇提供提取液最好的生物活性的條件，需要進(jìn)行一般的生物測定。因 為，在一般情況下，提取物的生物活性越強(qiáng)，化感作用越大7。這項研究的目的 不是確定具體值，而是試圖獲得的活性曲線，基于提取物將會有更多的生物活性， 當(dāng)隨樣品稀釋其活性水平持續(xù)存在。關(guān)于對照活性的數(shù)據(jù)

21、，測定得到的提取物在 300和500bar的凝結(jié)和十的樣品表示在圖3中。實驗的誤差為5.9%左右。它也 可以從圖3得到，選擇在不同的壓力下的得到的提取物的活性水平，有一個明顯 的區(qū)別。在500bar十樣品中得到的提取物在1000ppm表現(xiàn)出-100 %的活性和稀釋250 ppm約有-50%的活性。獲得的提取物與凝結(jié)的樣品在500bar和50C下1000ppm 也表現(xiàn)出-100%的活性和稀釋為125 ppm約-50%的活性。這些表現(xiàn)出最好的活 性數(shù)據(jù)的提取物的活性水平經(jīng)稀釋后沒有明顯下降。在500bar35C得到的提取物，凝結(jié)樣品表現(xiàn)出出了不同類型的特性。在這些 情況下，活動水平經(jīng)稀釋后大大下降

22、。在300bar得到的提取物活性曲線也顯示 稀釋后活性水平顯著降低。聚類分析中得到的結(jié)果表示在圖4中。一般的生物活性分析的8個試驗次序 而分組。不存在一個單一的標(biāo)準(zhǔn)來選擇聚類數(shù)目，但大多數(shù)研究者同意當(dāng)觀察到 顯著的距離變化時，過程應(yīng)停止。樹形圖中bar變得越來越大15，在300bar提 取的樣品和在35 C和500bar凝結(jié)提取樣品形成了綜合結(jié)果，它顯示了活性隨 稀釋增加明顯降低。5結(jié)論實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，所有這里使用超臨界二氧化碳作為提取溶劑進(jìn)程報告可 以得出結(jié)論，在500bar的壓力下，以50C的溫度下干燥樣品，得到最佳的萃取 率。然而，對500bar和50C之間凝結(jié)萃取的樣品，得到的最佳活

23、性的數(shù)據(jù)進(jìn)行 了聚類分析，以評估結(jié)果細(xì)分成組是否是可能的。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個實驗在500bar 干燥的樣品與在500bar和50 C下從萃取液中獲得的凝結(jié)樣品得到類似的結(jié)果。 干燥樣品是可取的做法，基于萃取率是較高的，活性數(shù)據(jù)是可以接受的。在實地 葉子是干燥的，其結(jié)果是，這樣一個過程從工業(yè)的角度來看是可行的。凝結(jié)樣品 的實驗室規(guī)模的研究，另一方面仍是有價值的，因為在50C, 500bar獲得的提 取物著重指出更好的生物活性數(shù)據(jù)。這個方面對物質(zhì)的提取鑒定具有特殊意義。參考文獻(xiàn)B.E. Berg, H.S. Lund, A. Kringstad, A.L. Kvernheim.Routine anal

24、ysis of hydrocarbons PCB and PAH in marine sediments using supercritical CO2 extraction .Chemosphere, 38 (1999), pp. 587-599M. Manilla, J. Koistinen, T. Vartiainen.Comparison of SFE with Soxhlet in the analysis of PCDD/PCDFs and PCBs unsediment.J. Environ. Monit., 4 (2002), pp. 1047-1053K. Hartonen,

25、 S. Bowadt, H.P. Dybdahl, K. Nylund, S. Sporring, H. Lund, F. Oreld.Nordic laboratory intercomparison of supercritical fluid extraction for the determination of total petroleum hydrocarbon, polychlorinated biphenyls and polycyclic aromatic hydrocarbons in solid.J. Chromatogr. A, 958 (2002), pp. 230-

26、248S.B. Hawthorne, D.J. Miller, M.S. Krieger.Rapid and quantitative extraction of trace organics using directly coupled SFE-GC.J. High Resolut. Chromatogr., 12 (1989), pp. 714-720M. Bravi, R. Bubbico, F. Manna, N. Verdone.Process optimisation in sunflower oil extraction by supercritical CO2.Chem. En

27、g. Sci., 57 (2002), pp. 2753-2762L. Casas, C. Mantell, M. Rodriguez, A. Torres, F.A. Macias, E. Martinez de la Ossa.Effect of the addition of cosolvent on the supercritical fluid extraction of bioactive compounds from Helianthus annuus L.J. Supercrit. Fluids, 41 (2007), pp. 43-49F.A. Macias, J.M.G.

28、Molinillo, A. Torres, R.M. Varela, D. Castellano.Bioactive flavonoids from Helianthus annuus cultivars.Phytochemistry, 45 (1997), pp. 683-687F.A. Macias, J.M.G. Molinillo, A. Torres, R. Varela, D. Castellano.Bioactive flavonoids from Helianthus annuus cultivars.Phytochemistry, 45 (1997), pp. 638-687

29、F.A. Macias, R. Varela, A. Torres, R.M. Oliva, J.M.G. y Molinillo.Bioactive norsesquiterpene from Helianthus annuus with potential allelopathic activity.Phytochemistry, 48 (1998), pp. 631-636F.A. Macias, R.M. Oliva, R.M. Varela, A. Torres, J.M.G. Molinillo.Allelochemicals from sunflower leaves cv. Peredovick.Phytochemistry, 52 (1999), pp. 613-621F.A. Macias, A. Torres, T. Galindo, R. Varela, J