實驗技術原理

1、WesternBlot原理、顯色分類及操作步驟一、 原理與Southern或NorthernWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物WesternBlot原理、顯色分類及操作步驟一、 原理與Southern或NorthernWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白探針”是顯色”用標記的二抗可以定性又可以半定量的 Western 是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法western 顯色的方法主要有以下幾種底物化學發(fā)光底物熒光DAB現(xiàn)常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB文章通常是用底物化學發(fā)光 ECL盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記+

2、，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠二、操作步驟(一配分離膠及濃縮膠均可事先配好（AP TEMED 外液 3 分鐘10%AP（0.70.8:100, AP 濃度越低，15%的分離0.5:100）TEMED（0.4:1000, 15%0.3:1000，濃縮2、封膠2/3的分離膠后應立即封膠，膠濃度10%0.1%SDS封，濃度10%0.1%SDS。封膠后切記，ddH2O沖洗干凈，然后加少量 0.1%的 SDS，目的是通過降低張力清除殘留水滴。片刻后倒掉 SDS，將玻3、灌好濃縮膠后 1h 拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形撥出梳子后用 ddH2O 沖洗膠孔兩遍以去除殘膠

3、隨后用 SDS (二) 樣品處1培養(yǎng)的細胞（定性去培養(yǎng)液后用溫的PBS23遍（冷的PBS有可能使細胞脫落200300l(二) 樣品處1培養(yǎng)的細胞（定性去培養(yǎng)液后用溫的PBS23遍（冷的PBS有可能使細胞脫落200300l，60801loading buffer100，1min用細胞刮刮下細胞后在EP10min，期間vortex 23EP 01400016000g 2min，再次挑絲。若無團塊也1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，2培養(yǎng)的細胞（定量 去培養(yǎng)液后用溫的PBS23遍（冷的PBS有可能使細胞脫落1020min用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后超聲（100200w）3s，212000g離

4、心，4，2min。將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loadingbuffer4 12 98，3min。3 50100mg 1ml 1ml 12000g離心，4，2min。loadingbuffer12 98，3min。(裂解液配方：Tris-Cl 議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM 及NaF 25mM1loadingbuffer配方：10% 甘油，50mMTrisCl6.8)，2% -10%。對于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用 5%的SDS，肝腎等組織 2%即可。(三) 電所有蛋白樣品調(diào)至等濃度后上樣，樣品兩側的泳道用等體積的 1loading buffer

5、上樣，Marker 1loading buffer 調(diào)整至與樣品等體積。45V 65V 時改為穩(wěn)壓1cm glycine0.1% SDS（10ml10%glycine0.1% SDS（5ml10%(四) 轉(zhuǎn)120濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris3.0g，Gly14.4gM-OH 200ml1,000ml50ml 180ulNC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細作用自然吸水后再完全浸入水(四) 轉(zhuǎn)120濕轉(zhuǎn)使用常規(guī)電轉(zhuǎn)液：Tris3.0g，Gly14.4gM-OH 200ml1,000ml50ml 180ulNC膜：將NC膜平鋪于去離子水面，靠毛細作用自然吸水后再完全浸入水中 10min 以排除氣

6、泡，隨后浸泡入轉(zhuǎn)移液中。PVDF 膜則在M-OH 中浸泡 20min的過多部分（尤其是干轉(zhuǎn)，以防止短路溫，將電泳槽置于冰水混合物中。恒流 100mA 過夜，或 400mA，4h。注意不同1-21V/cm2Tris-baseglycine200ml 甲醇(五1PBST或TTBS的水溶液TTBS 將239cm2 2ml閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室3一抗孵育結束后，用PBST或TTBS5-10min。 （1:10001:100005二抗孵育結束后，用PBST或TTBS5-10minPBST：TTBS：Tris-7.40.01% 5%脫脂奶粉的PBST或TTBS

7、200ml TTBS10g(六) 發(fā)光鑒HRP-ECL發(fā)TTBS10g(六) 發(fā)光鑒HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP 顯1HRP-ECL 發(fā)光法將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，A、B 混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min 左右）后濾。取出膠片立即完全浸入顯影液中 1-2min2AP-NBT/BICP 顯色法：每片NBT/BICP30ml30EP管中，39cm 1ml 即可。將PBST 或TTBS 洗滌過的膜用去離子NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）20s 10s 觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)將膜在PBST或TTBS30min2次液。4060min1h。37 1h PBST或TTBS20min2次液。二抗雜交，37 1h。PBST或TTBS20min2次液。PBST或TTBS20min2次液。 10三抗雜交，室溫 1h。37 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗11PBST 或TTBS 20min2 次液。120.2% 42（(七NCNC膜可使用多次，對多種蛋白進行雜交，步驟與“七增強敏感性”