營養(yǎng)缺陷型菌株篩選方法

1、關(guān)于營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選方法第一張，PPT共九頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是營養(yǎng)缺陷型菌株？經(jīng)過人工誘變或自然突變失去合成某種營養(yǎng)（氨基酸，維生素，核酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長的野生型菌株。它是一種生化突變株，它的出現(xiàn)是由基因突變引起的。遺傳信息的載體是一系列為酶蛋白編碼的核酸系列，如果核酸系列中某堿基發(fā)生突變，由該基因所控制的酶合成受阻，該菌株也因此不能合成某種營養(yǎng)因子，使正常代謝失去平衡。超阻遏突變體（表現(xiàn)為營養(yǎng)缺陷型）第二張，PPT共九頁，創(chuàng)作于2022年6月 營養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選4個步驟：1、誘變培養(yǎng)2、淘汰野生型3、檢出營養(yǎng)缺陷型4、鑒別缺陷種

2、類，確定生長譜一、誘變培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型的誘變方法和誘變因子與普通誘變育種基本相同。用于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型的誘變劑有亞硝基胍,紫外線,亞硝酸等,其中亞硝基胍的誘發(fā)突變率極高,一般可達10%以上,另外,隨著誘變劑量的提高突變頻率也追加。第三張，PPT共九頁，創(chuàng)作于2022年6月二、淘汰野生菌株在誘變后的存活菌體中營養(yǎng)缺陷型菌株的數(shù)量很少，一般僅占存活菌體的百分之幾或千分之幾，而野生型細胞卻大量存在，因而要采取一些措施，盡量淘汰野生型細胞，使缺陷型菌株得以富集，以利于檢出。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。1、抗生素法：細菌用青霉素法：細菌細胞壁的主要成分為肽聚糖，而青霉

3、素能抑制細胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細胞壁。處在生長繁殖過程的細菌對青霉素十分敏感，因而被抑制或殺死，但不能抑制或殺死處休止狀態(tài)的細菌。將誘變處理后的菌懸液分離加有抗生素的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后野生型細胞由于正常生長繁殖而被殺死，營養(yǎng)缺陷型細胞因不能生長而被保留下來，達到富集目的。酵母菌用制霉素法：制霉素作用于真菌細胞膜上的甾醇，引起細胞膜的損傷，殺死生長繁殖過程的真菌，起到富集營養(yǎng)缺陷型的作用。第四張，PPT共九頁，創(chuàng)作于2022年6月2、菌絲過濾法真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養(yǎng)基中能萌發(fā)長成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子則不能萌發(fā)。把誘變處理后的孢子移入到基本培養(yǎng)液中，振蕩

4、培養(yǎng)10h左右，使野生型孢子萌發(fā)的菌絲剛剛?cè)庋劭梢姡脺缇拿撝?、濾紙或玻璃漏斗除去菌絲。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔34h過濾一次，重復34次，最大限度地除去野生型細胞。然后稀釋、涂皿分離。3、高溫殺菌法利用芽孢桿菌類的芽孢和營養(yǎng)體對熱敏感性的差異，讓誘變后的細菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細菌移到基本培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一定時間，野生型芽孢萌發(fā)，而營養(yǎng)缺 陷型芽孢不能萌發(fā)。此時將培養(yǎng)物加熱到80，維持一定時間，野生型細胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用。第五張，PPT共九頁，創(chuàng)作于2022年6月營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出營養(yǎng)缺陷型菌株的檢出方法有：點植對照法、夾層平板法、限量營養(yǎng)法和影印接種法

5、等1、點植對照法：誘變后的孢子或菌體，經(jīng)富集培養(yǎng)，涂布分離在完全培養(yǎng)基平板進行培養(yǎng)，待菌落孢子成熟后，用滅菌的牙簽或接種針把每個菌落上孢子或菌體分別接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基平板上的相應位置，同時培養(yǎng)，然后觀察對比菌落生長情況。如果基本培養(yǎng)基上不生長而完全培養(yǎng)基相應位置上生長的菌落，可能為營養(yǎng)缺陷型。挑取孢子或菌體分別移接到基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基斜面上，進一步復證。該法可靠性強，但工作量大。2、夾層平板法：先在培養(yǎng)皿上倒一薄層基本培養(yǎng)基，凝固后再倒一層經(jīng)過誘變處理的菌液，其上再澆一層基本培養(yǎng)基；經(jīng)培養(yǎng)后，對首次出現(xiàn)的菌落用記號筆在皿底標記，然后再倒一層完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)，出現(xiàn)的形態(tài)較小的新菌落

6、，多為缺陷型。3、限量營養(yǎng)法：如果試驗的目的僅是檢出營養(yǎng)缺陷型菌株，則其該法是將富集培養(yǎng)后的細胞接種到含有0.01%蛋白胨的基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后，野生型細胞迅速地長成大菌落，在平皿底部作好顏色標記，而生長緩慢的小菌落可能是缺陷型，此稱限量培養(yǎng)。如果試驗的目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在基本培養(yǎng)基中加入某種單一的氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)，稱為補充培養(yǎng)。夾層平板法第六張，PPT共九頁，創(chuàng)作于2022年6月4、影印接種法經(jīng)富集后的孢子或菌體分離在完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至菌落成熟（母皿），用滅菌后的特制“絲絨印?！痹谀该笃桨寰渖陷p輕一印，再轉(zhuǎn)印到方位相同的另一基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平板上。培養(yǎng)后

7、觀察比較菌落生長情況，凡是在基本培養(yǎng)基上不生長，而在完全培養(yǎng)基上生長的菌落，分別移接到以上兩種培養(yǎng)基斜面上進一步復證。另外還可采用更簡便的方法，以上印模從母皿中沾上菌體細胞后，僅影印在基本培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后，生長的菌落情況與存放于冰箱的母皿菌落比較即可檢出營養(yǎng)缺陷型。本法適用于細菌、酵母菌，其次對小型菌落的放線菌和霉菌也適用。第七張，PPT共九頁，創(chuàng)作于2022年6月營養(yǎng)缺陷型的鑒定1、缺陷類別的測定通常分別用以下物質(zhì)來代表氨基酸、維生素、核酸堿基：氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸類酵母浸出液，基中氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶均有維生素混合物，代表維生素類核酸堿基混合液，代表嘌呤、

8、嘧啶類。將待測微生物從斜面上用生理鹽水或緩沖液喬洗下來，離心洗滌，制成濃度為 106108ml-1菌懸液，取0.1ml加入到基本培養(yǎng)基中，混勻倒入平皿，制成平板。凝固后，用加圓濾紙分別浸濕沾取以上四類代表物質(zhì)，覆于平板標定的位置上。培養(yǎng)后，觀察圓濾紙片周圍菌株生長情況，如出現(xiàn)混濁的生長圈，就可初步確定缺陷型所需的生長因子屬于哪一類別，進一步復證。2、缺陷型所需生長因子的測定缺陷型菌株和基本培養(yǎng)基混合制成平板，把5組或6組生長因子直接加于同一瓊脂平板上，或用濾紙片沾取后覆于瓊脂平板上，培養(yǎng)后，觀察哪一組或哪兩組區(qū)產(chǎn)生混濁生長圈，即可確定該菌株缺陷的生長因子。如果要測定數(shù)十或上百個缺陷型菌株時，則可改成一個平皿中加入一種生長因子，制成平板，