色譜分離技術(shù)

1、第八章 色譜分離技術(shù)1主要內(nèi)容色譜分離技術(shù)概述 色譜技術(shù)的基本概念 色譜技術(shù)的理論基礎(chǔ) 色譜法的分類 色譜技術(shù)的操作方法吸附色譜法分配色譜法親和色譜法2 第一節(jié) 色譜分離技術(shù)概要色譜技術(shù)的起源:1903年Tswett首創(chuàng)葉綠素的石油醚溶液通過碳酸鈣管柱,并繼續(xù)以石油醚淋洗,由于碳酸鈣對葉綠素中各種色素的吸附能力不同,色素被逐漸分離,在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶。命名為色譜法(Chromatography)石油醚 白色陽光通過棱鏡后變成紅、 橙、黃、綠、青、藍、紫七色彩帶 光譜（光的色散）31931年 Kuhn 和Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離了-、-、-胡蘿卜素1940年 Martin和S

2、ynge提出了液液分配色譜法1944年 Consden發(fā)展了紙色譜法1949年 Macllean發(fā)展了薄層色譜法1952年 James和Martin發(fā)表了完整的氣液色譜方法, 獲1952年的諾貝爾化學(xué)獎1956年 Van Deemter發(fā)展了描述色譜過程的速率理論1957年 Golay開創(chuàng)了開管柱氣相色譜法60年代末 高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜法，出現(xiàn)了HPLC80年代初 毛細管超臨界液體色譜發(fā)展，毛細管電泳的出現(xiàn) 90年代 結(jié)合 HPLC高選擇性和CE高效的優(yōu)點的毛細管電色譜出現(xiàn)發(fā)展歷史4 色譜技術(shù)的發(fā)展分離對象： 不限于有色物質(zhì)色譜柱： 材料：玻璃、不銹鋼、聚四氟乙烯 形狀：直形、

3、U形、螺旋形 二維平面形（紙、薄層色譜）沖洗劑： 液體、氣體填料： 近千種 固體、液體檢測： 眼睛、各種檢測器操作： 手工 全自動 聯(lián)用技術(shù) 5氣相色譜（1952年）1-載氣鋼瓶；2-減壓閥；3-凈化干燥管；4-針形閥；5-流量計;6-壓力表；7-氣化室；8-色譜柱9-熱導(dǎo)檢測器；10-放大器；11-溫度控制器；12-記錄儀；1. 載氣系統(tǒng)：包括氣源、凈化干燥管和載氣流速控制;2. 進樣系統(tǒng)：進樣器及氣化室；3. 色譜柱：填充柱（填充固定相）或毛細管柱（內(nèi)壁涂有固定液）；4. 檢測器：可連接各種檢測器，以熱導(dǎo)檢測器或氫火焰檢測器最為常見；5. 記錄系統(tǒng)：放大器、記錄儀或數(shù)據(jù)處理儀；6. 溫度控

4、制系統(tǒng)：柱室、氣化室的溫度控制。6色譜系統(tǒng)特點是分離效率高，能分離性質(zhì)極性類似的物質(zhì)，既能用于少量物質(zhì)的分析鑒定，也可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。7一、色譜技術(shù)的基本概念利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性、分子大小、帶電情況、離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(shù)不同，達到彼此分離的目的。加入洗脫劑使各組分分層的操作稱為展開。洗脫時從柱中流出的液體稱為洗脫液。展開后各組分的分布情況稱為色譜圖。將樣品加到柱上的操作稱為上樣或加樣。8A+B+CABCCBACBACCB圖11-1 色譜洗脫過程與色譜圖t，minABC信號9（一）固定相可以是固體

5、物質(zhì)（吸附劑，凝膠，離子交換劑），也可以是液體物質(zhì)（固定在硅膠或纖維素上的溶液）組成： 空間結(jié)構(gòu)部分：決定固定相尺寸與孔隙率； 化學(xué)和生物大分子功能性成分：決定介質(zhì)與目標溶質(zhì)特異性相互作用的能力。 P175表8-110 （二）流動相推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界流體。柱色譜中稱為洗脫劑，薄層色譜中稱為展開劑。11正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性。非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動速度快，先從柱中流出來。反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種色譜過程中，極性大的分子比極性小的分子移動速度快而先從柱中流出。分離純化極性大的分子，采用正相色譜；

6、分離純化極性小的有機分子，采用反相色譜。12（三）分配系數(shù)，分配比和選擇因子1、分配系數(shù)：在一定條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值。它是色譜中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。langmuir無論色譜分離的機理如何，當溶質(zhì)濃度較低時，固定相濃度和流動相濃度成線性的平衡關(guān)系。K的不同是由于各組分在固定相中的溶解度（氣-液色譜）或吸附能力（氣- 固色譜）不同而造成的。13影響因素：1、被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)。K越大，出峰越慢，K0時，最先流出。2、固定相和流動相的性質(zhì)3、色譜柱的溫度溫度升高20，K下降一半，常用恒溫柱14 在實際工作中另一表征色譜分配過程的參數(shù)。是指在一定溫度、壓力下，在兩

7、相間達到分配平衡時，組分在兩相間的質(zhì)量比，用k來表示：式中VM和VS分別為柱中流動相和固定相的體積，為體積比。2、分配比（容量因子或容量比）15 （1）分配系數(shù)是組分在兩相間分配達到平衡時的濃度之比，分配比則是組分在兩相間的分配總量之比。 （2）分配系數(shù)決定于組分和兩相的性質(zhì)，與兩相體積無關(guān)。分配比不僅決定于組分和兩相的性質(zhì)，且與兩相體積比有關(guān)。 （3）對于一給定的色譜體系，組分的分離最終決定于組分在每相中的相對量，而不是相對濃度，因此分配比是衡量色譜柱對組分保留能力的重要參數(shù)。163. 選擇因子 色譜柱對A、B兩組分的選擇因子 定義如下：A為先流出的組分，B 為后流出的組分。17K 或 k

8、反映的是某一組分在兩相間的分配； 是反映兩組分間的分離情況。兩組分 K 或 k 相同時， =1 時，兩組分不能分開；兩組分 K 或 k 相差越大時， 離1越遠，分離得越好。兩組分在兩相間的分配系數(shù)不同，是色譜分離的先決條件。 和 k 是計算色譜柱分離效能的重要參數(shù)！18 （四）阻滯因素(遷移率)指在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。小于1 Rf=溶質(zhì)的移動速度/流動相的移動速度 Rf=溶質(zhì)的移動距離/溶劑前沿（紙層析）相對遷移率：指在一定條件下，在相同時間內(nèi)，某一組分在固定相中移動的距離與某一標準物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值。19（五）檢測方法

9、目標：靈敏度，線性度，重現(xiàn)性，可在線操作在線檢測方法： （P180表8-2） 吸光度、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)、電導(dǎo)率、熒光、紅外吸收光譜、折射率、質(zhì)譜等。20二、 色譜的理論基礎(chǔ)色譜峰的特征值色譜的定性和定量分析塔板理論和速率理論21（一） 色譜圖的特征值221. 基線 當色譜柱沒有組分進入檢測器時，在實驗操作條件下，反映檢測器系統(tǒng)噪聲隨時間變化的線稱為基線。它的平直與否可反應(yīng)出實驗條件的穩(wěn)定情況。穩(wěn)定的基線是一條直線。 基線漂移：指基線隨時間定向的緩慢變化。 基線噪聲：指各種噪聲所引起的基線起伏（波動）。23 2、峰高（h）和峰面積 色譜峰頂點與基線的距離叫峰高。 色譜峰與峰底基線所圍成區(qū)域的面積

10、叫峰面積。 峰高和峰面積的大小反映組分濃度的大小。243. 保留值 保留值是用來表示試樣中各組分在色譜柱中滯留時間的數(shù)值。通常用時間或用組分流出色譜柱所需流動相的體積來表示。a. 死時間(t0) ：不與固定相作用的物質(zhì)從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間，它與色譜柱的空隙體積成正比。由于該物質(zhì)不與固定相作用，因此，其流速與流動相的流速相近。據(jù) t0 可求出流動相平均流速 。25b. 保留時間tr：試樣從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。它包括組份隨流動相通過柱子的時間t0和組份在固定相中滯留的時間。c. 調(diào)整保留時間tr ：某組份的保留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間。即：tr =

11、tr- t0由于保留時間為色譜定性依據(jù)。但同一組份的保留時間與流速有關(guān)，因此有時需用保留體積來表示保留值。 26d. 死體積V0 指色譜柱在填充后柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀管路和連接頭間的空間以及檢測器的空間的總和。當后兩相可以忽略不計時死體積可由死時間與色譜柱出口的載氣體積流速F0(mLmin-1)來計算。 V0 = t0 Fc0Fco為柱出口的流動相流速（mL/min)，其值為：F0-檢測器出口流速；Tr-室溫；Tc-柱溫；p0-大氣壓；pw-室溫時水蒸汽壓。27e.保留體積Vr：指從進樣到待測物在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。 f.調(diào)整保留體積 Vr：某組份的保留

12、體積扣除死體積后的體積。Vr28g.相對保留值r2,1：組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比。注意：r2,1只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱內(nèi)徑、柱長L、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此， r2,1在色譜分析，尤其是GC分析中廣泛用于定性的依據(jù)！ 具體做法：固定一個色譜峰為標準s，然后再求其它峰 i 對標準峰的相對保留值，此時以 表示： 又稱選擇因子。表示固定相對這兩種組分的選擇性。表示固定相（色譜柱）的選擇性。 r21值越大，分離也越好。 r21=1時，兩組分不能被分離。29圖11-2 色譜流出曲線圖hh1/2YY1/20.607hh. 區(qū)域?qū)挾龋?色譜峰區(qū)域?qū)挾仁巧V流出曲線中的一個重

13、要參數(shù)。可用于衡量色譜柱的柱效及反映色譜操作條件下的動力學(xué)因素。寬度越窄，其效率越高，分離的效果也越好。230 標準偏差 即0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半 峰底寬度Y 自色譜峰側(cè)的轉(zhuǎn)折點所作切線在基線上的截距，如圖所示。它與標準差的關(guān)系為 Y=4 半峰寬度Y1/2 又稱半寬度或區(qū)域?qū)挾?，即二分之一峰高處對?yīng)的峰 寬度，它與標準偏差的關(guān)系為 31（二）色譜的定性和定量分析色譜流出曲線的意義： 色譜峰數(shù)樣品中單組份的最少個數(shù)； 色譜保留值定性依據(jù)； 色譜峰高或面積定量依據(jù)； 色譜保留值或區(qū)域?qū)挾壬V柱分離效能評價指標； 色譜峰間距固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。32四種典型情況 分離效果差，

14、柱效低，選擇性（）低 完全分離，柱效高，峰窄，選擇性（）低 ； 完全分離，選擇性（）增加，柱效低，峰寬 完全分離，柱效高，選擇性（）好1、對色譜柱分離效果的評價如何評價？峰型，峰間距33 R值越大意味著分離得越好。分離度是柱效能選擇性影響的總和，可用其作為色譜柱的總分離性能指標。 用數(shù)值來表示分離度（衡量兩個組分分離好壞的程度）：有時也用下式表示： 難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響： 保留值之差色譜過程的熱力學(xué)因素； 區(qū)域?qū)挾壬V過程的動力學(xué)因素，柱效能的高低。Y2Y134R=1.5R=0.75R=1.0響應(yīng)信號保留時間 t, minR =0.8：兩峰的分離程度可達89%

15、；R =1.0：4 分離，裸露峰面積98%；R =1.5： 6 分離，裸露峰面積達99.7%當R=1.5 時，分離程度99.7%，R=1.5 通常用作相鄰兩峰是否完全分開的標準。35對于對稱峰：當Rs1.0時，兩峰總有部分重疊而達到基線分離的分離度Rs 1.5對于不對稱的峰形要達到完全分離需要更高的分離度圖11-6 A、B混合物的色譜分離圖36定性分析的依據(jù)： 1.組分在固定床上的位置（內(nèi)色譜法） 2.組分保留時間或保留體積（外色譜法） 3. 色譜技術(shù)與其它光譜技術(shù)連用。 氣相色譜-質(zhì)譜檢測器（GC-MS） 高效液相色譜-紫外二極管陣列檢測器 -紅外光譜檢測器（HPLC-IR）*雖然保留值與光

16、譜波長精度相比其重現(xiàn)性差些。但是可以通過與標準化合物相比較來定性。2、定性分析(Qualitative Analysis)37 1.用色譜圖上的斑點面積定量（內(nèi)色譜）。 2.用峰高定量 必須保證在改變色譜條件下峰形不變化。另 外，峰高必須與樣品的濃度成正比。 可變的條件如柱溫，流速和進樣體積必須精 確控制。此外，也應(yīng)避免加樣量的超載。 3.用峰面積定量 峰的展寬對定量結(jié)果沒有影響，常用計算機 輔助積分計算。也可以用手工的方法來近似測量 峰高和半峰寬(h12)。但是如果峰很窄，則測定 的峰面積問題較大。3、定量分析(Quantitative Analysis)38（三）色譜理論試樣在色譜中的分離

17、過程的基本理論包括兩個方面：1.試樣中各組分在兩相間的分配情況-熱力學(xué)過程2.試樣中各組分在色譜柱中的運動情況-動力學(xué)過程391、塔板理論 引用了處理蒸餾過程的概念、理論和方法來處理色譜分離過程：將連續(xù)的色譜過程看作是許多小段平衡過程的重復(fù)。塔板理論假定：（1）平衡迅速（2）脈動式進載氣，一次一個板體積（ V）（3）試樣開始加在零號塔板上，縱向擴散可忽略不計（4）分配系數(shù)在塔板上是常數(shù)為討論方便，假設(shè)： 塔板數(shù)為10, 進樣量：1mg, k=1 即p=q。40塔板號 0 1 2 3 4 5 6 7 8 91mg進樣(平衡前)0.5mg(平衡后)0.5mg(平衡前)1V0.5mg0.5mg0.2

18、5mg(平衡后)1V0.25mg0.25mg0.25mg(平衡前)2V0.25mg0.25mg0.25mg0.25mg0.125mg(平衡后)2V0.25mg0.25mg0.125mg0.125mg0.125mg0.125 0.25 0.125 (平衡前)3V0.125 0.25 0.125 (平衡后)3V 0.063 0.187 0.187 0.063 0.063 0.187 0.187 0.063(平衡前)4V 0.063 0.187 0.187 0.063 0.063 0.187 0.187 0.063(平衡后)4V 0.032 0.120 0.187 0.12 0.032 0.032

19、0.120 0.187 0.12 0.032 (平衡前)5V 0.032 0.120 0.187 0.12 0.032 0.032 0.120 0.187 0.12 0.032 (平衡后)5V 0.016 0.076 0.143 0.143 0.076 0.016 0.016 0.076 0.143 0.143 0.076 0.016(平衡前)6V 0.016 0.076 0.143 0.143 0.076 0.016 0.016 0.076 0.143 0.143 0.076 0.016(平衡后)6V 0.008 0.046 0.110 0.143 0.110 0.046 0.008 0.0

20、08 0.046 0.110 0.143 0.110 0.046 0.008(平衡前)7V 0.008 0.046 0.110 0.143 0.110 0.046 0.008 0.008 0.046 0.110 0.143 0.110 0.046 0.008(平衡后)7V0.004 0.027 0.0.078 0.126 0.126 0.078 0.027 0.0040.004 0.027 0.0.078 0.126 0.126 0.078 0.027 0.00441c0為進樣濃度，tR 為保留時間， 為標準偏差， c為時間 t時的濃度。 當ttR時，濃度C有極大值，Cmax就是色譜峰的峰高。

21、因此：當實驗條件一定時（即一定），峰高h與組分的量C0（進樣量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。當進樣量一定時，越?。ㄖг礁撸?，峰高越高，因此提高柱效能提高色譜分析的靈敏度。在理論塔板數(shù)n不變的情況下，峰高與保留體積（時間）t成反比?；蛘哒f：同一次分析中，同樣濃度的不同組分，出峰越晚峰高越小。流出曲線方程42由塔板理論可導(dǎo)出n與色譜峰峰底寬度的關(guān)系： 式中色譜柱的長度L，tR及Y1/2或Y用同一單位（時間或距離)1、在色譜柱不變的情況下，即理論塔板數(shù)n和長度L都不變的情況下，色譜峰寬度與保留時間t成正比。或者說：同一次分析里，色譜峰的寬度與其保留時間成正比。因此出峰越晚，峰寬越大。2

22、、在色譜柱長度固定的情況下，即保留時間相等的情況下，色譜柱寬度Y與理論塔板數(shù)n的平方根成反比。這意味著：在同樣長度的不同色譜柱上，理論塔板數(shù)n越高，色譜峰越尖銳。通常理論塔板數(shù)n即柱效率n。毛細管柱效高，所以色譜峰明顯要尖銳的多。H：塔板高度43 考慮到死時間不參與柱內(nèi)的分配，提出了有效塔板數(shù)的概念：1. 色譜峰越窄，塔板數(shù)n越多，理論塔板高度就越小，此時柱效能越高，因此n和H可以作為描述柱效能的一個指標。2. n有效和H有效能較為真實地描述柱效能的好壞。 *同一色譜柱對不同物質(zhì)的柱效能是不一樣的。44 通常用塔板高度和塔板數(shù)來評估色譜柱的柱效。所以，塔板理論可以近似描述柱內(nèi)過程的實際情況。塔

23、板理論的成功之處： 解釋了流出曲線的形狀（呈正態(tài)分布） 濃度極大點的位置 計算和評價柱效速率理論塔板理論的不完善之處： 忽略了組分在兩相中傳質(zhì)和擴散的動力學(xué)過程 分配系數(shù)與濃度無關(guān) 迅速達到平衡 塔板高度和塔板數(shù)受哪些因素的影響 柱效和流速（流動相的線速度）的關(guān)系不能很好解釋452、速率理論影響柱效的因素 速率方程（也稱范弟姆特方程式）: H = A + B/m + Cm H：理論塔板高度，：載氣的線速度(cm/s) 減小A、B、C三項可提高柱效； 存在著最佳流速； A、B、C三項各與哪些因素有關(guān)？ 1956年荷蘭學(xué)者范弟姆特（Van Deemter)等提出了色譜過程的動力學(xué)理論，他們吸收了塔

24、板理論的概念，并把影響塔板高度的動力學(xué)因素結(jié)合進去，導(dǎo)出了塔板高度H與載氣線速度的關(guān)系。渦流擴散項，分子擴散項，傳質(zhì)阻力項46（1） 渦流擴散項A A = 2dp dp：固定相的平均顆粒直徑：固定相的填充不均勻因子，空心毛細管柱：A=0 固定相顆粒越小dp，填充的越均勻，A，H，柱效n。表現(xiàn)在渦流擴散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。常數(shù)A稱為渦流擴散(Eddy Diffusion)，當流動相碰到填充物顆粒時，不斷的改變流動方向，使試樣組分在流動相中形成類似“渦流”的流動，因而引起色譜峰的擴張。47（2）分子擴散項B B = 2 Dg ：彎曲因子，空心毛細管柱， =1，填充柱色譜， 1。

25、 Dg：試樣組分分子在氣相中的擴散系數(shù)（cm2s-1）。 擴散導(dǎo)致色譜峰變寬，H(n)，分離變差。 分子擴散項與流速有關(guān)，流速，滯留時間，擴散 擴散系數(shù)：Dg （M載氣）-1/2 ； M載氣，B值試樣組分被帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在與色譜柱的很小一段空間中，在塞子的前后存在著濃差而形成濃度梯度，因此使運動著的分子，發(fā)生縱向擴散。B與路徑彎曲因子及組分在流動相中的擴散系數(shù)D有關(guān)。對于氣相色譜：48（3）傳質(zhì)阻力項 C 組分在氣相和液相兩相間進行反復(fù)分配時，遇到阻力。傳質(zhì)阻力包括氣相傳質(zhì)阻力Cg和液相傳質(zhì)阻力CL ，液相傳質(zhì)阻力大于氣相傳質(zhì)阻力。C =（Cg + CL）49（4）載氣流速與柱

26、效-最佳流速 載氣流速高時： 傳質(zhì)阻力項是影響柱效的主要因素，流速，柱效,右圖曲線的右邊。 載氣流速低時： H - u曲線與最佳流速： 流速對柱效的總影響存在著一個最佳流速值 以塔板高度H對應(yīng)載氣流速 作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。 分子擴散項成為影響柱效的主要因素，流速 ，柱效 ，右圖曲線的左邊。H = A + B/ + C50（5）速率理論的要點(1) 指出了影響柱效的原因：組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質(zhì)阻力使氣液兩相間不能瞬間達到分配平衡等因素是造成色譜峰擴展，柱效下降的主要原因。(2) 為色譜條件的選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對柱效及

27、分離的影響；選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速，同時要考慮各種因素的相互制約。可變因素 符號 單位 流動相的流速 u cms在流動相中的擴散系數(shù) DM cm2s在固定相中的擴散系數(shù) DS cm2s填料的直徑 dp cm液膜的厚度 df cm溶質(zhì)的脫附速度 td s柱子的直徑 dc cm51欲使塔板高度H最小，分離效率最高。需選擇以下條件：1、較小的顆?；蜉^薄的液膜厚度；2、柱床填充均勻致密；3、較小的柱直徑；4、在固定相中要有大的擴散系數(shù)Ds，在流動相中要有小的擴散DM。 氣相色譜分析時可用降低柱溫來減小溶質(zhì)在流動相中的擴散系數(shù)。 由于不同大小的分子有不同的擴散系數(shù)，峰的擴展也

28、依賴于相對 分子量的大小，小分子的溶質(zhì)有利于柱效提高。 表 影響峰擴展的各種動力學(xué)因素渦流擴散 A縱向擴散 B/u液體固定相中傳質(zhì)項 Cs.u 流動相中傳質(zhì)阻力項 CM.u 52二、色譜法的分類（一）根據(jù)固定相基質(zhì)的形式紙色譜：以濾紙作為基質(zhì)薄層色譜：將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進行色譜過程。柱色譜：將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進行色譜分離。53 表11-1 柱色譜法的分類 流 動 相 固定相 色譜法 氣 體 固體 GSC(氣-固色譜) 液體 GLC(氣-液色譜) 液 體 固體 LSC(液-固色譜) 液體 LLC(液-液色譜） 超臨界流體 SFC(超臨界流體色譜)（二）

29、根據(jù)兩相所處的狀態(tài)流動相為氣體的稱為氣相色譜流動相為液體的稱為液相色譜54吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜等。1、吸附色譜以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離的目的。（三）根據(jù)分離原理的不同552、分配色譜在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達到分離的目的。相當于連續(xù)性的溶劑抽提方法。3、離子交換色譜以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進行分離的技術(shù)。固定相為離子交換劑，流動相為電解質(zhì)溶液。564、凝膠過濾色譜（分子篩原理）以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進行分離的技術(shù)。小分子物質(zhì)易進入凝膠

30、顆粒內(nèi)部，流出柱子時間長，大分子不易進入凝膠內(nèi)部，先流出色譜柱。5、親和色譜根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進行分離的一種技術(shù)。是分離生物大分子最為有效的色譜技術(shù)。57三、色譜系統(tǒng)的操作方法略（P183-P186）58第二節(jié) 吸附色譜法一、基本原理固體物質(zhì)具有吸附能力，可將物質(zhì)從溶液中吸附到它的表面上。吸附劑從溶液中吸附物質(zhì)的同時，也有部分被吸附的該物質(zhì)從吸附劑上脫離（解吸）。被解吸下來的物質(zhì)向前移動時，遇到前面新的吸附劑會被重新吸附，然后又被后來的洗脫液再次解吸，繼續(xù)向前移動。經(jīng)這樣反復(fù)地吸附-解吸-再吸附-再解吸的

31、過程。物質(zhì)沿洗脫液的前進方向移動，移動速度取決于吸附劑對該物質(zhì)的吸附能力。吸附能力強，則向前移動速度慢，反之則快，不同組分便會逐漸分離開。59 二、吸附薄層色譜法將吸附劑均勻地鋪在一塊玻璃上，形成薄薄的平面涂層，干燥后在涂層的一端點樣，豎直放入一個盛有少量展開劑的有蓋容器中，展開劑接觸到吸附劑涂層，借毛細作用向上移動形成薄層色譜，使混合物得以分離。60 （一）基本原理吸附劑對樣品中各成分吸附能力不同，以及展開劑對它們的解吸附能力的不同，使各成分達到分離。經(jīng)過在吸附劑與展開劑之間多次吸附-溶解作用，將混合物中各組分分離成孤立的樣點，實現(xiàn)混合物分離。611、固定相選擇常用吸附劑（固定相）有硅膠、氧

32、化鋁和聚酰胺等。固定相顆粒的大小對展開速度、遷移率、分離效果有顯著影響。（二）吸附薄層色譜條件622、展開劑選擇主要根據(jù)樣品中各組分的極性、溶劑對于樣品中各組分溶解度等因素來考慮。先用一種極性較小的溶劑為基礎(chǔ)，若展開不好，則用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，再次實驗，直到先出適合的展開劑。633、相對移動值從點樣開始到展開后的溶劑前沿?；旌衔镏懈鹘M分的移動距離不同。4、顯色分離化合物若有顏色，可易識別，無需顯色?；衔餂]有顏色時，要識別點樣，使之顯色。主要有碘蒸氣顯色、紫外線顯色、噴霧顯色。64（三）薄層色譜操作1、制板玻璃板洗凈，硅膠調(diào)成糊，均勻攤在玻璃上，晾干。用前烘干。2、點樣微

33、量進樣器在距底邊1.5-2.0cm處點樣，直徑小于3mm。653、展開吹干樣點，豎直放入層析缸中。展開劑要接觸到吸附劑下沿，但不接觸樣點。蓋上蓋子，展開。待展開劑上行到一定高度，取出板，畫出展開劑前沿線。4、顯色、計算遷移率吹干展開劑，合適方法顯色，測量移動距離，計算相對移動值。66三、吸附柱色譜法（一）基本原理在一定條件下，吸附劑與被分離物質(zhì)之間產(chǎn)生作用，這種作用主要是物理和化學(xué)作用。物理作用來自于分子間的范德華力，化學(xué)作用主要是氫鍵作用。67 （二）吸附柱色譜條件1、色譜柱選擇通常使用玻璃柱，可直接觀察色帶移動情況。工業(yè)大型色譜柱可用金屬制造，在柱壁嵌一條有機玻璃帶。682、吸附劑的選擇所

34、選吸附劑應(yīng)有最大的比表面積和足夠的吸附能力，對欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)有不同的溶解和解吸能力。與洗脫劑、溶劑及樣品組分不發(fā)生化學(xué)變化顆粒均勻，操作過程中不破裂。693、洗脫劑的選擇洗脫劑純度較高，不與樣品和吸附劑起化學(xué)反應(yīng)。對樣品溶解度大，黏度小，易流動，容易與洗脫劑組分分開。70（三）吸附色譜應(yīng)用主要體現(xiàn)在對生物小分子物質(zhì)的分離，在生物化學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域有比較廣泛的應(yīng)用。71第三節(jié) 分配色譜法一、基本原理分配色譜法是利用被分離物質(zhì)中各成分在兩種不相混溶的液體之間分布情況不同而使混合物得到分離。相當于一種連續(xù)性的溶劑提取方法。是把其中一種溶劑固定，用另一種溶劑沖洗。這種分離不經(jīng)過吸附程序，僅由溶劑提取而

35、完成，因此叫分配色譜法。72固定在柱內(nèi)的液體稱固定相，需一種固體吸附它，此固體只起支撐作用，而不起分離作用。用作沖洗的液體稱流動相。流動相與固定相發(fā)生接觸，樣品中各成分在兩相間的分布不同，因此移動速度不同。易溶于流動相的成分移動快，而在固定相中溶解度大的成分移動慢，依此得到分離。73二、分配色譜條件1、載體的選擇惰性的，沒有吸附能力的，能容留較大量固定相的物質(zhì)。主要有硅膠、硅藻土、纖維素等。742、固定相的選擇常用的固定相有水、緩沖溶液、酸的水溶液、甲酚胺、丙二醇、有機溶劑等。3、流動相選擇一般選用為水所飽和的有機溶劑或水-有機溶劑互溶的混合液。如石油醚、醇類、酮類、苯類等。75三、分配色譜基

36、本操作1、裝柱固定相與載體混合后裝柱。2、加樣被分離物配成濃溶液，加到固定相載體上端；被分離物溶液用含固定相載體吸收，溶劑揮發(fā)后，加在載體上端；濾紙吸附被分離物，溶劑揮發(fā)后，放在載體上。3、洗脫76四、分配色譜法應(yīng)用適用于分離極性大，在有機溶劑中溶解度小的成分，或極性很相似的成分。77第五節(jié) 親和色譜一、親和色譜概述親和色譜是利用親和作用分離純化生物物質(zhì)的液相色譜法，它根據(jù)生物分子與特定的固定配基之間的親和力不同而使生物分子得以分離。78二、親和色譜原理1、原理主要應(yīng)用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價鍵牢固結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對它的配

37、基的空間結(jié)構(gòu)的識別。792、親和色譜優(yōu)點高選擇性，待分離物質(zhì)與配基專一性結(jié)合，分辨率高。具有濃縮作用，可純化幾千倍，適用于含量極少的活性物質(zhì)分離操作條件溫和，有效保持樣品原有的生物學(xué)活性，適用于不穩(wěn)定的活性物質(zhì)的分離。80三、親和色譜介質(zhì)（一）親和配基1、配基應(yīng)具備的條件必須具有適當?shù)幕瘜W(xué)基團以利于固定在載體上配基的分子大小合適，以減小分離過程中的空間位阻效應(yīng)配基與被分離物質(zhì)之間有足夠大的親和力，復(fù)合物能穩(wěn)定一定時間配基與被分離物質(zhì)之間具有合適的特異性（專一性配基與特異性配基）。配基與待分離物之間的結(jié)合具有可逆性812、親和配基的分類按照配基的特性可分為有機小分子類、生物大分子類和染料化合物三

38、類。按照配基的選擇性，親和色譜為配基又可分為專一性配基（僅對某種生物物質(zhì)具有特別強的親和性）和基團特異性配基（對某類化學(xué)基團或某一類生物分子具有結(jié)合作用）兩類。823、幾類常用的親和配基（1）抗體與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，因此可利用抗體或抗原為配基分離純化相應(yīng)的抗原或抗體，此種親和色譜法又稱免疫親和色譜。利用免疫親和色譜法，特別是以單抗為配基的免疫親和色譜法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。83（2）蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G，它們與抗體的結(jié)構(gòu)非常相似，可做為各種抗體的親和配基。蛋白質(zhì)A來源于金黃色葡萄球菌，蛋白質(zhì)G分離自G群鏈球菌，與許多動物的免疫球蛋白的Fc片段具有很強的親和結(jié)合作用

39、。它們與抗體的結(jié)合并不影響抗體與抗原的結(jié)合，因此它們也可用于分離抗原-抗體的免疫復(fù)合體。蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G與不同種屬來源的各種免疫球蛋白的親和性不一。84A蛋白與抗體、抗原結(jié)合的示意圖85（3）凝集素外源凝集素是一種天然蛋白質(zhì)，含有糖結(jié)合部位，與一些糖的殘基或鏈段具有高度親和力，可結(jié)合糖基。不同凝集素與糖結(jié)合的特異性不同。伴刀豆球蛋白A是常用的親和配基，可用作糖蛋白、多糖、糖脂、各種含糖配基的生物大分子物質(zhì)以及整個細胞、細胞表面受體蛋白和細胞膜片段的分離純化。86（4）酶抑制劑：蛋白酶均存在抑制其活性的物質(zhì)稱酶抑制劑。具有特殊的結(jié)構(gòu)，能夠與酶的活性中心結(jié)合，從而抑制酶的活性。酶的抑制劑可以作為

40、配基用于酶的分離純化。87（5）輔酶和磷酸腺苷某些酶需要在輔酶存在的情況下才能表現(xiàn)出催化活性，即輔酶能與脫氫酶和激酶之間通過親和作用相互結(jié)合，因此這些輔酶可用作脫氫酶和激酶的親和配基。主要的輔酶有NAD、NADP、ATP88（6）過度金屬離子銅、鎳、鋅等可與氮、硫、氧等供電原子產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用。許多蛋白質(zhì)和肽類分子表面都不同程度地含有暴露的組氨酸、半胱氨酸和色氨酸，這些氨基酸能與二價金屬離子發(fā)生螯合作用。因此可利用金屬螯合色譜得以分離純化。89（7）組氨酸具有比較獨特的性質(zhì)，可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用。在低鹽和pH約等

41、于目標蛋白質(zhì)等電點的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附最強，隨鹽濃度的增大，親和吸附作用降低。根據(jù)此特性，利用組氨酸為配基可親和分離等電點相差較大的蛋白質(zhì)。90（8）色素配基三嗪類色素是一類分子內(nèi)含有三嗪環(huán)的合成活性染料，與各種需要在NAD的存在下表現(xiàn)其生物活性的脫氫酶和激酶具有結(jié)合作用。這類色素與NAD的結(jié)合部位相同，具有抑制酶活性的作用。利用色素為配基的親和色譜法一般稱作色素親和色譜。91（9）其它配基肝素：為酸性多糖，具有抗凝血作用。與脂蛋白、脂肪酶、限制性內(nèi)切酶、甾體受體、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。多聚腺苷酸：用于信使RNA的結(jié)合蛋白、病毒RNA、與DN

42、A有關(guān)的NRA酶、核酸抗體等生物活性物質(zhì)的色譜分離。92（二）載體1、載體應(yīng)具備的條件不溶于水，但具有高度親水性化學(xué)惰性，沒有或極少的物理吸附或離子交換等非特異性結(jié)合作用。具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有利于溶液的流動和滲透。必須具有足夠的可同配基結(jié)合的化學(xué)基團具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性具有良好的物理穩(wěn)定性均勻性好，最好是均勻的球形結(jié)構(gòu)，對不同分離產(chǎn)物具有不同的分離效果932、常用載體瓊脂糖凝膠、交聯(lián)瓊脂糖、葡聚糖凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃除此之外，還有一些合成的高分子材料，具有剛性良好，粒度均勻，孔徑較大，pH適用范圍廣等優(yōu)點。94（三）活化劑載體上的化學(xué)基團是不活潑的，不能與配基直接偶聯(lián)，通過化

43、學(xué)反應(yīng)介質(zhì)上化學(xué)基團處于活化狀態(tài)。能使載體發(fā)生產(chǎn)生自由基與配基結(jié)合的化學(xué)物質(zhì)稱為活化劑。95四、親和色譜制備選擇合適的配基、載體和間隔臂選擇合適的活化劑和活化方法活化載體配基偶聯(lián)封閉未偶聯(lián)配基的活化基團9697（一）配基的選擇目標產(chǎn)物與配基之間的親和力的大小和專一性。它們之間的結(jié)合常數(shù)應(yīng)在104-108mol/l之間.如果配基與生物分子之間的結(jié)合作用過強，需要強烈的洗脫條件才能將給合物洗脫，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。98（二）載體的選擇應(yīng)具有高的比表面積，親水凝膠較為適合做親和色譜的載體。不同的載體適合分離不同的生物分子。99（三）載體偶聯(lián)1、偶聯(lián)條件的選擇pH緩沖液溫度和時間配基濃度1002、偶聯(lián)

44、反應(yīng)（1） 溴化腈法用于多糖凝膠的活化，固定活性基團為氨基的配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）對多糖類載體的活化在堿性（pH10）條件下數(shù)分鐘即可完成，之后的配基修飾亦需在堿性條件進行，一般使用碳酸鹽緩沖液。反應(yīng)過程為： 101 （2） 環(huán)氧基活化法可用于固定分子結(jié)構(gòu)為R-NH2、R-OH和R-SH的配基。常用的活化試劑為1,4-丁二醇-二縮水甘油醚（BGE）和環(huán)氧氯丙烷。以活化羥基為例：或引入活性基團環(huán)氧基后，可采用直接法或間接法（氧化法、碳二亞胺法、戊二醛法）固定配基。 102 （3）硅膠的活化活化硅膠常采用硅烷化試劑，如-氨丙基三甲（乙）氧硅烷和環(huán)氧丙基三甲基硅烷等，反應(yīng)為：引入活性

45、氨基或環(huán)氧基后，在酸性溶液中環(huán)氧基可發(fā)生二醇化反應(yīng)：103（4）碳二亞胺交聯(lián)法（P217圖8-15）將氨基類配基偶聯(lián)到具有羧基末端的間隔臂或載體上，或?qū)Ⅳ然惻浠悸?lián)到具有氨基端的間隔臂或載體上。104（5）有機磺酰氯法（P217圖8-16）將含氨基和巰基的配基偶聯(lián)到瓊脂糖上。105（四）間隔臂當配基較小時，將其直接固定在載體上，會由于載體的空間位阻，配基大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。 這時，需要在配基 與載體之間連接一 個“間隔臂”，使其發(fā) 生有效的親和結(jié)合。間隔臂的作用106間隔臂應(yīng)滿足以下條件：發(fā)生作用的活性位點必須位于配基分子的內(nèi)部，并且不能影響配基與目標產(chǎn)物結(jié)合；長度適當，不能過短，否則難以和配基有效結(jié)合，不能太長，以免自身某些基團發(fā)生相互作用，同時結(jié)合能力下降；必須在某種特定的分離條件下能被洗脫107（五）封閉活化結(jié)束后有少部分活化基團未被配基偶聯(lián)，需要將其封閉。可加入過量的能與活化劑反應(yīng)的試劑封閉多余的活化基團，或水解活化基團。108（六）親和色譜介質(zhì)的技術(shù)指標配基偶聯(lián)量：適于小分子質(zhì)量配基樣品吸附量：適用于大分子質(zhì)量配基化學(xué)穩(wěn)定性：抗氧化能力，配基不