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1、豬瘟兔化弱毒細胞苗生產(chǎn)工藝(內(nèi)蒙古通遼岳泰集團付海江028000)一、 細胞培養(yǎng)1、 制苗用細胞牛睪丸細胞或羊腎細胞。2、 生長培養(yǎng)液目前的細胞培養(yǎng)液為乳漢(歐)液,或MEM10%新生牛血清+1%雙抗(青/鏈霉素),pH7.07.2左右。3、 維持液目前的維持液為乳漢(歐)液,或MEM25%新生牛血清+1%雙抗(青/鏈霉素),pH7.47.6。4、 細胞生長良好的幾個注意事項1)制苗用細胞應(yīng)選用非豬瘟疫區(qū),無口蹄疫、粘膜病等傳染病地區(qū)的14日齡健康小公牛或10日齡以內(nèi)的健康羔羊。其家H健康生長的2)培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定。應(yīng)確保無外源病毒、支原體、細菌等污染,無牛病毒性腹瀉病毒(BVDV
2、)及其抗體。用于生產(chǎn)豬瘟細胞苗的牛血清都要事先檢測有無BVDV中和抗體的存在。3)制備原代牛睪丸細胞時,防止細胞消化過度。4)合適、營養(yǎng)豐富的細胞培養(yǎng)基。豐富的營養(yǎng)成分對細胞的生長、帶毒狀態(tài)維持和毒價的提高有直接影響。5)轉(zhuǎn)瓶的洗滌應(yīng)遵循嚴格的清洗程序。轉(zhuǎn)瓶洗滌不干凈,容易導致細胞不貼壁生長。二、 病毒感染、維持和收獲生產(chǎn)用毒種有脾毒和細胞毒,脾毒是用選擇定型熱反應(yīng)兔脾臟冷凍或凍干保存制備的;細胞毒是將用新鮮脾毒制成0.3%0.5%的病毒懸液接種生長良好的牛睪丸細胞或羊腎單層細胞,取二收、三收的細胞培養(yǎng)液作為生產(chǎn)用毒種。脾毒應(yīng)選擇兔體反應(yīng)在36小時之前,同時防止脾毒采集過程的污染。該病毒不產(chǎn)生
3、細胞病變效應(yīng)(CPE),可連續(xù)多次收液。取已形成良好單層的牛睪丸細胞(或羊腎細胞),棄去培養(yǎng)液,接種含3%5%細胞毒種或0.2%0.3%脾毒種的維持液。接毒后4或5日第一次收獲換液,以后每46日收獲換液1次,可連續(xù)1215收左右,有的廠家可收更多。一般來說,1215收前的毒價合格率高,疫苗質(zhì)量好。接毒時,細胞生長狀態(tài)的好壞影響細胞產(chǎn)毒。也可對細胞帶毒分散,分散比率1:4左右,可增加收次和產(chǎn)量。將檢驗合格的病毒培養(yǎng)液和5%蔗糖脫脂牛奶穩(wěn)定劑按一定比例混合,分裝,進行凍干。三、 病毒特征1、 豬瘟病毒(HCV)感染細胞超薄切片的電子顯微鏡觀察表明,該病毒顆粒在膜結(jié)合的胞漿內(nèi)空胞中裝配并成熟,然后經(jīng)
4、胞外釋放。2、 56處理60分鐘或6010分鐘可滅活細胞培養(yǎng)液中的HCV。HCV在pH510時穩(wěn)定,pH5.2時最適宜生長,但在低于pH4或高于pH11時快速滅活。3、 豬瘟病毒的抗原性和血清學與牛粘膜/病毒性腹瀉病毒(MD/BVDV)密切相關(guān),兩者同源性很高,能互相誘導一定程度的同源病毒抗體,細胞或培養(yǎng)液中若存在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及其抗體,可與豬瘟病毒發(fā)生中和反應(yīng),造成疫苗生產(chǎn)的失敗。四、 病毒收獲液毒價不高的可能原因如果病毒收獲液毒價不高,即病毒家兔感染量(RID)較低,制成的疫苗易造成免疫失敗。豬瘟疫苗生產(chǎn)中毒價不高的可能原因:1)細胞培養(yǎng)液(乳漢液)營養(yǎng)不足,尤其是使用高壓滅
5、菌液,高溫可使一些營養(yǎng)成分損失,造成細胞生長狀態(tài)不良;2)細胞培養(yǎng)液較多存在外源病毒,尤其是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)會直接造成病毒滴度降低;3)成熟釋放的病毒在維持液中耐受性較差,造成病毒滴度較低;4)病毒毒種毒力較低,并在傳代過程中弱化。舊規(guī)程要求每1 ml病毒原液含病毒50,000個家兔感染量(RID)方可配苗,現(xiàn)要求提高至每1 ml含病毒500,000個家兔感染量。所以,提高疫苗單位毫升病毒量是提高疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵,進行豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝的改進或者濃縮疫苗,顯得非常必要、急迫?!靖健浚河貌煌瑒┝康腃株苗免疫豬,證實免疫劑量與保護水平密切相關(guān)。我國豬瘟細胞苗出廠檢驗以5萬倍稀釋能致兔體熱反
6、應(yīng)為合格,即每毫升原液含5萬RID。規(guī)定的免疫劑量為150RID(37PD50)。劑量不足時,攻毒后不能阻止強毒在體內(nèi)復(fù)制和帶毒。免疫劑量提高到80100PD50(約320400RID),攻毒后能制止亞臨床感染,所有耐過豬均不帶毒。目前歐洲為消滅HC亞臨床感染,多采用加大免疫劑量的方法。歐洲藥典規(guī)定用C株疫苗免疫時,肌肉注射劑量為100PD50(400RID)。五、 豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝改進的幾點考慮1、 使用化學成分明確的細胞培養(yǎng)基化學成分明確的細胞培養(yǎng)基一方面能提供足夠的營養(yǎng),供細胞生長,同時避免動物來源成分(如由水解乳蛋白)帶來外源病毒(如BVDV)及其抗體的污染。2、 使用低血清細胞培養(yǎng)基
7、,減少血清使用量,提高細胞維持時間清大天一有適合細胞培養(yǎng)生長的低血清MEM(MD611)細胞培養(yǎng)基,可使血清使用量減少50左右,減少了外源因子污染的幾率;并且由于該細胞培養(yǎng)基營養(yǎng)成分較傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)基豐富,可提高細胞活力水平,增加細胞維持時的營養(yǎng)供給。3、 使用改良的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞使用多層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細胞可使單位體積溶液內(nèi)的細胞數(shù)量增加,一方面提高了細胞密度,病毒增殖數(shù)量較大;另一方面也對病毒液進行了濃縮,提高了病毒原液的病毒量。4、 盡量減少水解乳蛋白的批間差,防止疫苗生產(chǎn)過程的不穩(wěn)定情況。5、 使用質(zhì)量保證的牛血清血清是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的主要來源,使用質(zhì)量可靠、無外源病毒的血清可減少此類污染。6
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