單克隆抗體與抗體工程

1、單克隆抗體與抗體工程1一：細(xì)胞融合1：細(xì)胞融合技術(shù)定義與應(yīng)用價(jià)值細(xì)胞融合（cell fusion）又稱體細(xì)胞雜交（somatic hybridization）或細(xì)胞雜交（cell hybridization），是指在離體條件下用人工方法將不同種生物或同種生物不同類型的單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。利用細(xì)胞融合技術(shù)使不同的細(xì)胞融合成一個(gè)新的雜合細(xì)胞，這個(gè)新的細(xì)胞就獲得了兩個(gè)親本細(xì)胞的遺傳信息和細(xì)胞質(zhì)，從而具備有兩個(gè)親本細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)。2細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值 細(xì)胞融合能重新組合兩個(gè)親本細(xì)胞的優(yōu)良遺傳信息，是研究細(xì)胞間遺傳信息傳遞、基因在染色體上定位、改良動(dòng)物遺傳特性、及創(chuàng)造新的符合人類

2、需要的新的細(xì)胞系的極為有效的手段。3植物細(xì)胞融合與人造小鼠培育過(guò)程4細(xì)胞融合過(guò)程三個(gè)階段融合前準(zhǔn)備細(xì)胞融合及融合后的細(xì)胞管理5融合前準(zhǔn)備 主要包括細(xì)胞培養(yǎng)材料準(zhǔn)備、選擇免疫動(dòng)物、抗原及免疫方案設(shè)計(jì)等； 6細(xì)胞融合 一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的過(guò)程，包括骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備、脾細(xì)胞分離、融合操作等。用于細(xì)胞融合的融合劑可以是病毒、化學(xué)試劑，或采用電融合技術(shù)進(jìn)行融合。在最近的二十多年來(lái)，細(xì)胞融合技術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，其本身也已成為一們專門的技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮巨大作用。 7融合后的管理 對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選與克隆、優(yōu)良細(xì)胞傳代與保存等； 8細(xì)胞融合的關(guān)鍵技術(shù)方法1） 動(dòng)物選擇、免疫方案設(shè)計(jì)、免疫途徑確定2） 親本細(xì)胞

3、準(zhǔn)備、融合技術(shù)（條件、物質(zhì)手段、融合管理）電融合技術(shù) 細(xì)胞克?。河邢尴♂尫ǎ╨imited dilution technology）和軟瓊脂法（soft agar cloning technology）3） 融合后細(xì)胞管理9細(xì)胞融合技術(shù)最有意義的成果之一就是單克隆抗體的制備。單克隆抗體在生物、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、制藥等眾多領(lǐng)域得到極為廣泛的應(yīng)用；尤其是人源性單克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)展，使單克隆抗體具有更高的實(shí)用價(jià)值。 10單克隆抗體技術(shù)1：抗體的結(jié)構(gòu)與功能11抗體的結(jié)構(gòu)12抗體的功能抗原結(jié)合活性和特異性（Fab）激活肌體免疫反應(yīng)（Fc） 激活補(bǔ)體系統(tǒng) 介導(dǎo)ADCC、K、NK毒性反應(yīng) 與激活Fc-R結(jié)合

4、13雜交瘤技術(shù)原理與過(guò)程 14雜交瘤技術(shù)原理利用兩種細(xì)胞突變株，一株為TK-、HGPRT+，另一株為HGPRT-、TK+。在一般培養(yǎng)條件下，細(xì)胞可利用主要途徑合成DNA，這些突變細(xì)胞能正常生長(zhǎng)。當(dāng)主要途徑被氨基碟呤阻斷時(shí)，這兩株細(xì)胞不能增殖；如將這兩株細(xì)胞融合，則只有異核體雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基上存活，因?yàn)閮煞N細(xì)胞相互補(bǔ)充了另一種細(xì)胞缺失的酶；而未融合的細(xì)胞或自身融合的同核體細(xì)胞仍然是而TK-或HGPRT- 而被淘汰。15雜交瘤技術(shù)過(guò)程16 單克隆抗體的改造與應(yīng)用171：?jiǎn)慰寺】贵w靶向技術(shù)與 靶向單抗應(yīng)用 單克隆抗體靶向制劑利用抗體的特異性，將藥物連接到抗體上，在特定的部位發(fā)揮作用的制劑。

5、制備方法： 與藥物直接連接McAb 小分子 藥物 大分子 藥物18應(yīng)用：特異性溶解血栓藥物抗腫瘤藥物其它藥物192：人源性單抗的制備方法 EBV轉(zhuǎn)化技術(shù) EBV轉(zhuǎn)化-融合技術(shù) 嵌合抗體技術(shù) 改型抗體技術(shù) 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù) 20EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)21EBV轉(zhuǎn)化-融合技術(shù)22嵌合抗體技術(shù)人-鼠嵌合抗體就是用人源性抗體的一部分代替鼠源性抗體的一部分，使之保留對(duì)抗原的特異性，又具備與補(bǔ)體和細(xì)胞結(jié)合的功能，并減少異源性蛋白的抗原性。研究人員設(shè)想，用人源性基因代替鼠源性抗體基因中的Fc區(qū)。因?yàn)镕c區(qū)的主要功能是激活機(jī)體免疫反應(yīng)，也是產(chǎn)生人抗鼠反應(yīng)的部分。研究人員利用編碼人抗體Fc區(qū)的DNA片段替換鼠源性的Fc

6、段DNA。 23嵌合抗體技術(shù)嵌合改型抗體 鼠源性抗原決定簇 鼠源性可變區(qū)人鼠源性抗體高變區(qū)人抗體24改型抗體技術(shù)嵌合抗體由鼠可變區(qū)與人穩(wěn)定區(qū)組合而成，因而仍有一定的免疫原性。為降低來(lái)自小鼠可變區(qū)中骨架區(qū)的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗體中與抗原結(jié)合的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR）基因用以置換人抗體中相應(yīng)序列。由于這種抗體絕大部分為人源性，只有CDR區(qū)來(lái)自小鼠，因而稱為CDR移植抗體（CDR grafted antibody） 。這種抗體在人體內(nèi)免疫性大為降低 25改型抗體技術(shù) 鼠源性基因 人源性基因26噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)將從人或小鼠B淋巴細(xì)胞中分離的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR擴(kuò)增編碼輕鏈

7、和重鏈的cDNA；然后用限制性內(nèi)切酶酶解擴(kuò)增的cDNA片段，克隆到絲狀噬菌體質(zhì)粒載體中，與絲狀噬菌體蛋白基因連接成融合基因，經(jīng)輔助噬菌體感染大腸桿菌后，攜帶有表達(dá)載體的大腸桿菌就會(huì)釋放外殼上帶有抗體片段的噬菌體；再用ELISA或免疫親和層析法篩選出特異性抗體。 27噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)B淋巴細(xì)胞分離的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNAPCR擴(kuò)增編碼輕鏈和重鏈的cDNA限制性內(nèi)切酶酶解克隆到絲狀噬菌體質(zhì)粒載體中感染大腸桿菌釋放外殼上帶有抗體片段的噬菌體篩選出特異性抗體283：免疫學(xué)研究中應(yīng)用294：醫(yī)學(xué)臨床診斷與治療中的應(yīng)用 305：生物大分子分離純化中的應(yīng)用31 細(xì)胞融合技術(shù)最有意義的成果之一就是單克隆抗體的制備。單克隆抗體一在生物、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、制藥等眾多領(lǐng)域得到極為廣泛的應(yīng)用；尤其是人源性單克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)展，使單克隆抗體具有更高的實(shí)用價(jià)值。選擇HGPRT-、TK-、不分泌抗體的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫的B淋巴細(xì)胞融合，用HAT培養(yǎng)基篩選出雜交瘤，再經(jīng)有限稀釋法或軟瓊脂法克隆抗體分泌陽(yáng)性雜交瘤，可在動(dòng)物體內(nèi)或體外大量培養(yǎng)雜交瘤生產(chǎn)單克隆抗體。