基因工程實(shí)驗(yàn)

1、基因工程實(shí)驗(yàn)1.動(dòng)物細(xì)胞DNA提取原理是什么答：先用SDS裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸。然后用等體積酚/氯仿/異戊醇抽提，使蛋白質(zhì)變性沉降到酚與水相的界面DNA則留在水相中，離心后在上清液中加入醋酸鈉和兩倍體積無水乙醇，除去多糖物質(zhì)和沉淀DNA，然后離心后沉淀用70%乙醇洗滌，最后用ddH20溶解沉淀DNA,20C保存。2.DNA提取中用到了哪些試劑？有什么作用？EDTA:二價(jià)金屬離子螯合劑，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。因?yàn)镸g離子是DNA酶的輔因子。SDS:一種陰離子去污劑，在高溫(55C65C)條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸。酚:使蛋白質(zhì)變性。

2、氯仿:作為除雜劑，除去糖、脂等雜質(zhì)；加速有機(jī)相與液相分離；抽提核酸溶液中殘留的酚。乙丙醇:作為消泡劑；降低DNA的水溶性，讓DNA從溶液中析出；有利于分層，使離心后的上層含DNA水相，中間的蛋白質(zhì)相及下層有機(jī)溶液相維持穩(wěn)定。無水乙醇:降低DNA的水溶性，沉淀DNA。醋酸納:調(diào)PH，中和Tri-Buffer，形成中性環(huán)境，利于DNA沉淀。Tri-Buffer(PH8.0):提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。70%乙醇：清洗溶液中離子及其他雜質(zhì)。NaCl:提供高鹽環(huán)境，使DNA溶解于液相中。2.有機(jī)溶劑使用注意事項(xiàng)？答：有機(jī)溶劑的容器，不論是否在使用中，都應(yīng)隨手蓋緊。盡可能在通風(fēng)位置工作，以避免吸

3、入有機(jī)溶劑的蒸汽。盡可能避免皮膚直接接觸。3.PCR原理？答：將目的基因DNA在高溫（94C）下解鏈成為單鏈模板;人工合成的一對(duì)與目的基因兩側(cè)序列相互補(bǔ)的寡核苷酸引物在低溫（4060C）下分別與變性的目的基因片段兩側(cè)的兩條鏈的部分序列互補(bǔ)結(jié)合；在中等溫度（6575C）下，由耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）將dNTP，中的脫氧單核甘酸加到引物3-OH末端，并以此為起點(diǎn)，沿著模板以5-3方向延伸，合成一條新的互補(bǔ)鏈。4.PCR類型？反轉(zhuǎn)錄PCR怎么做的答：反向PCR、巢式PCR、錨定PCR、數(shù)字PCR、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫捕捉PCR等。RT-PCR的原理：提取組織或細(xì)胞中的總RNA

4、，以ployA（A）+選擇性RNA為模板采用oligo（dT）、隨機(jī)引物或基因特異性的引物GSP經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。5.PCR影響因素？答：引物；模板；DNA聚合酶；Mg2+；底物；反應(yīng)緩沖液。6.PCR體系有什么物質(zhì)？作用？答：引物：是兩段與待擴(kuò)增目的DNA序列側(cè)翼片段具有互補(bǔ)堿基特異性的寡核苷酸，使DNA聚合酶以其3-OH末端為起點(diǎn)合成互補(bǔ)鏈，決定了特定基因的擴(kuò)模板：提供DNA復(fù)制的模板，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子。，TaqDNA聚合酶：將dNTP中的脫氧單核甘酸加到引物3-0H末端，并以此為起

5、點(diǎn)，沿，著模板以5-3方向延伸，合成一條新的互補(bǔ)鏈。底物dNTPmi某：4種脫氧核苷酸，提供PCR反應(yīng)的原料和能量。反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含有Tri-HCl、KCl和適當(dāng)?shù)腗g2+。Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，Tri-HCl起緩沖作用，KCl有利于引物的退火。7.怎樣提高PCR產(chǎn)物的特異性？引物:a.典型的引物18到24個(gè)核苷長(zhǎng)。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(zhǎng)度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。b.選擇GC含量為40%到60%或GC含量映像模板G

6、C含量的引物。c.設(shè)計(jì)5端和中間區(qū)為G或C的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。d.避免引物對(duì)3末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體，抑制擴(kuò)增。e.避免3末端富含GC。設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或Tof.避免3末端的錯(cuò)誤配對(duì)。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。g.避免存在可能會(huì)產(chǎn)生內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，這會(huì)破壞引物退火穩(wěn)定性。Mg2+:濃度通常為0.52.0mmol/l,過高或過低均影響產(chǎn)物的特異性。模板:模板量應(yīng)適宜，過量則可能增加非特異性。延伸時(shí)間:應(yīng)適宜，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。循環(huán)次數(shù):一般為30個(gè)（2530個(gè)）周期，如果循環(huán)次數(shù)過高，會(huì)

7、增加非特異性產(chǎn)物及其復(fù)雜度。8.PCR都有哪些酶可以用？答：TaqDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；Vent聚合酶；PfuDNA聚合酶。見實(shí)驗(yàn)書69頁。9.T4DNA連接酶連接的原理？答：T4DNA連接酶作用機(jī)制:酶先與ATP形成酶-AMP共價(jià)復(fù)合物，再與DNA作用、AMP，轉(zhuǎn)移至DNA缺口5-磷酸基上形成焦磷酸鍵而活化5-磷酸基，然后再與3-羥基形成磷酸酯鍵，完成連接過程。PCR產(chǎn)物與T載體怎樣連接的？答：PMD18-T質(zhì)粒0.5uL，PCR產(chǎn)物4.5uL，2某olution（含T4DNA連接酶）5uL，混勻后16C水浴過夜。DNA用試劑盒是怎么回收純化得到的？答：依據(jù)吸附柱中的硅膠膜在高鹽

8、濃度下特異性吸附DNA，在低鹽濃度下可被洗脫的原理。按照100mg膠塊加入700uL溶膠液的比例，55C溶膠。將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，離心后倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一收集管，加漂洗液離心洗滌，重復(fù)漂洗一次，去掉廢液后放回吸附柱空轉(zhuǎn)，盡量去除多余溶液。再將吸附柱放入新的收集管中加入洗脫液，靜置離心后去掉吸附柱，即為純化產(chǎn)物12.DNA回收的注意事項(xiàng)答:加入的膠塊溶化液的量要足量，保證膠能完全溶解，避免堵塞硅膠模確保WB液中已經(jīng)加入了酒精把膠液倒入柱子后要靜止加in以后再離心，使DAN完全吸附于膜上洗脫液要滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合在膜上的DNA。將離心后的洗脫液倒掉后，要在空離心

9、。13.連接為何在16C?答：因?yàn)轲ば阅┒说腄NA雙鍵間有氫鍵的作用，溫度過高使氫鍵不穩(wěn)定，但連接的最適溫度恰為37C，所以經(jīng)綜合考慮，采用16C較為合適。載體與目的基因連接時(shí)各自的量有什么講究?答：連接時(shí)外源基因的量要多一些，載體的量要少一些，這樣碰撞的機(jī)會(huì)就會(huì)多，否則載體自身環(huán)化就嚴(yán)重，一般載體DNA與目的基因連接采用1:(1-3)的比。連接酶的用量不宜過多。Cacl2制備感受態(tài)原理?答：將細(xì)胞培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6后放入冰浴中使其停止生長(zhǎng)，然后將菌株置于低溫預(yù)處理的低滲Cacl2溶液中，即造成細(xì)胞膨脹，細(xì)胞通透性發(fā)生暫時(shí)性的改變，從而極易與外源DNA相黏附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物

10、16.轉(zhuǎn)化?感受態(tài)以及其的影響因素?答：轉(zhuǎn)化：是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。感受態(tài)：指宿主細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由宿主菌的遺傳性所決定，同時(shí)也受菌齡；外界環(huán)境因子等的影響。影響因素：細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度、CaCl2處理時(shí)間、熱擊時(shí)間、感受態(tài)細(xì)胞的保存期、質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度、試劑的質(zhì)量、防止雜菌和雜DNA的污染、整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。制備感受態(tài)的方法有哪些？（大腸桿菌、農(nóng)桿菌、酵母）（1）大腸桿菌感受態(tài)制備方法：CaCl2法制備（2）農(nóng)桿菌感受態(tài)制備：CaCl法制備，類似于大腸桿菌的方

11、法。將正在生長(zhǎng)的農(nóng)桿菌細(xì)胞加入到低滲的CaCl溶液中，0oC下處理便會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜的透性發(fā)生改變，此時(shí)的細(xì)胞呈現(xiàn)出感受態(tài)。制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞迅速冷凍于一70oC可保存相當(dāng)一段時(shí)間而不會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)化率有太大影響。（3）酵母感受態(tài)制備：熱擊轉(zhuǎn)化的原理？答：利用CaCl2處理感受態(tài)宿主細(xì)胞，然后通過熱擊法處理，即置于42C高溫6090，細(xì)胞布朗運(yùn)動(dòng)劇烈，膜流動(dòng)性增強(qiáng)，由于感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞膜有受傷，DNA進(jìn)入細(xì)胞，然后降溫在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表達(dá)足夠的蛋白質(zhì)，以使能在抗生素的平板上生長(zhǎng)菌落。19.藍(lán)白斑篩選的原理？答:許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，包含B-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控區(qū)和N

12、端146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），這種載體適合轉(zhuǎn)入可編碼B-半乳糖苷酶C端部分序列的受體細(xì)胞。宿主和質(zhì)粒單獨(dú)編碼的片段僅是B-半乳糖苷酶的部分序列，單獨(dú)存在時(shí)沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)，即為互補(bǔ)。由互補(bǔ)而產(chǎn)生的lacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基-B-D硫代半乳糖苷）的作用下，在無色底物某-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色沉淀底物，使菌落顯藍(lán)色。如果外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，無法實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，使得帶有重組質(zhì)粒菌落形成白色菌落。20.LB的配方答：LB培養(yǎng)基：1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%Nacl。即10g胰化蛋白胨，5g

13、酵母提取物，10g氯化鈉溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH調(diào)至7.2在補(bǔ)足水至1L。固體培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基中添加1.5%2%瓊脂，121C滅菌20min備用。21.滅菌的過程？121C，滅菌20min。首先往高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)添適量水，然后把培養(yǎng)基放入鍋內(nèi)，鍋蓋對(duì)稱擰緊。待壓力升至0.05MPa時(shí)，打開排氣閥，排完氣后，關(guān)閉排氣閥。待壓力再次升至0.1MPa時(shí)，開始計(jì)時(shí)，直至升至0.15MPa時(shí)關(guān)閉電源開關(guān)。待壓力將至0.1MPa時(shí)，打開電源開關(guān)，升至0.15MPa時(shí)關(guān)閉電源。如此循環(huán)，20分鐘后，關(guān)閉電源，直到壓力降至0時(shí)，打開排氣閥，最后打開鍋蓋取出培養(yǎng)基。22.涂板前在LB上37

14、C1h？答：質(zhì)粒只有在大腸桿菌中跟隨其復(fù)制，使拷貝數(shù)增加，轉(zhuǎn)錄翻譯出足夠的酶，才具有抗性。23.轉(zhuǎn)化常見方法？答:大腸桿菌：化學(xué)轉(zhuǎn)化法、電擊法。動(dòng)植物細(xì)胞：顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因搶法。24.質(zhì)粒DNA提取原理?答：基于環(huán)狀質(zhì)粒DNA相對(duì)分子質(zhì)量小，易于復(fù)性的特點(diǎn)。在熱或堿性條件下DNA分子雙鏈解開，若此時(shí)將溶液置于復(fù)性條件下，變性的質(zhì)粒分子能在較短的時(shí)間內(nèi)復(fù)性而染色體DNA不能復(fù)性。經(jīng)過離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀，上清液中的DNA分子則利用無水乙醇與鹽凝聚形成沉淀。25.溶液I、II、III有什么作用？成分是什么？答：olutionl:含葡萄糖，Tri-Hcl(PH8.

15、0),RNA酶和EDTA。葡萄糖使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子底部；Tri-Hcl(PH8.0)提供一個(gè)適當(dāng)?shù)腜H環(huán)境；EDTA螯合二價(jià)金屬離子，抑制DNae的活性;RNA酶降解RNA。olutionll:含NaOH和SDS。NaOH使染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變形形成雜亂無章的片段，同時(shí)使質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵發(fā)生斷裂；SDS用于溶解細(xì)胞膜上的脂肪和蛋白質(zhì)。olutionlll:含NaAc或KAc(PH4.8)，用于中和olutionll中的堿性溶液，使得質(zhì)?？梢詮?fù)性，而染色體DNA則不能復(fù)性，從而經(jīng)離心后把質(zhì)粒分離出來。26.TAKARA公司都有哪些產(chǎn)品？有什么用途？(酶

16、、載體類型等)27.限制性內(nèi)切酶識(shí)別、切割有什么特點(diǎn)？答：識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特殊的核苷酸序列。其切口有兩種類型:平末端和黏性末端。28.星號(hào)活性的影響因素答：甘油體積分?jǐn)?shù)過高(5%)；酶過量(100u/uL)；離子濃度低(25mmoL/L)；PH過高(8.0)等。T載體是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TA的克隆)的專用質(zhì)粒載體，為線性化載體，線性化后兩側(cè)3端各多出一個(gè)脫氧胸苷酸(T),無需酶切可直接與游離A末端的PCR產(chǎn)物連接，屬于非定向克隆。30.酶切體系有哪些成分？答：10uLddH20；2uL10某buffer(高鹽緩沖液Hbuffer；中鹽緩沖液Mbuffer；低鹽緩沖液Lbuffe

17、r)；7uL質(zhì)粒DNA；作用于目的基因兩端的酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶兩個(gè)各0.5uL。31.為什么膠塊能在溶膠液中溶解？答：實(shí)驗(yàn)中所使用到的凝膠回收試劑盒，作用是從瓊脂糖凝膠中回收純化DNA片段，采用了獨(dú)特的凝膠融化液BufferGM，其具有較強(qiáng)的緩沖性能并含有PH指示劑，方便判斷溶液的PH值，是否與DNA制備膜結(jié)合，其溶解能力很強(qiáng)，無需加熱，在室溫(15-25C)條件下可快速溶解凝膠。32.影響連接的因素？答：1.連接酶的用量：酶濃度越高反應(yīng)速度越快，產(chǎn)量也高，但連接酶是保存在50%的甘油中的，甘油濃度過高會(huì)影響連接效果。2.作用的時(shí)間與溫度:一般采用16C，連接12-16h，因?yàn)殡m然DNA連

18、接酶的最適溫度是37C，但在37C時(shí)，黏性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，它不足以抵御熱破裂作用，而反應(yīng)時(shí)間是依據(jù)溫度而定的，所以綜合考慮后采用16C連接12-16h。3.底物濃度:一般采用提高DNA的濃度來增加重組的比例，但底物濃度過高。反應(yīng)體積太小，連接效果也很差。33.回收DNA中空轉(zhuǎn)有什么作用？答：去除吸附柱中多余溶液及雜質(zhì)，保證DNA的純度。34.復(fù)制型載體有哪些系列？表達(dá)型載體分哪些？復(fù)制型載體：質(zhì)粒載體，粘粒載體，噬菌體載體，人工染色體。表達(dá)型載體：大腸桿菌表達(dá)載體，利用T7噬菌體啟動(dòng)子的表達(dá)載體，表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體，分泌型表達(dá)載體，大腸桿菌/革蘭氏陽性菌穿梭載體，大腸桿菌/酵

19、母菌穿梭載體，隨機(jī)插入突變載體，基因插入/基因敲除。目的基因鑒定有哪些方法？是如何實(shí)現(xiàn)的？檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體上的DNA上是否插入了目的基因。采用DNA分子雜交技術(shù)，先將轉(zhuǎn)基因的基因組提取出來；把目的基因的DNA片段用放射性同位素做標(biāo)記作為探針；使探針與基因組DNA雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，則表明目的基因已插入染色體DNA中。檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。采用DNA與RNA雜交技術(shù)。從轉(zhuǎn)基因生物中提取mRNA,把目的基因的DNA片段用同位素標(biāo)記作為探針；使探針與mRNA雜交，如果出現(xiàn)雜交帶就表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA(3)檢測(cè)目的基因是否翻譯出了蛋白質(zhì)。從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)抗體(

20、先進(jìn)行同位素標(biāo)記)進(jìn)行抗原抗體雜交；如果出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定將轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)品與天然產(chǎn)品作比較，以確定是否轉(zhuǎn)入目的基因。Amp、Kan篩選的原理？答：質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性或卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化了這些質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒的大腸桿菌寄主可以在含有氨芐青霉素或卡那霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)化子則不能生長(zhǎng)。從而篩選出含有重組載體的細(xì)胞。瓊脂、瓊脂糖的區(qū)別？答：瓊脂是由瓊脂糖和瓊脂果膠組成的，瓊脂是一種固化劑，本身不提供任何營(yíng)養(yǎng)，是一種高分子的碳水化合物，僅溶于熱水，主要用于細(xì)胞培養(yǎng)。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，由半乳糖及其衍生物構(gòu)成，不帶電荷，主要用于凝膠電泳，凝膠過

21、濾。內(nèi)切酶不同末端連接形成幾種鍵？分別有幾個(gè)答：內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的粘性末端進(jìn)行連接形成兩個(gè)3-5磷酸二酯鍵和若干互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵，若酶切產(chǎn)生的平末端進(jìn)行連接，形成兩個(gè)3-5磷酸二酯鍵。39怎樣研究一個(gè)基因的功能？在基因庫中查找該基因的同源基因或同源物種的該類基因，根據(jù)他們的功能對(duì)欲研究基因的功能作大體的推測(cè)。尋找該基因缺失型的個(gè)體，或?qū)ι飩€(gè)體進(jìn)行該基因的基因敲除，將其與正常含有該基因的個(gè)體進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)對(duì)該基因的功能的推測(cè)進(jìn)行相應(yīng)的性狀，生理方面的差異的觀察。利用基因工程技術(shù)對(duì)生物個(gè)體進(jìn)行該基因的過表達(dá)操作，再將其與正常個(gè)體和基因缺失型個(gè)體進(jìn)行比照，根據(jù)性狀或生理功能的差異從而確定該基因的

22、功能。基因工程期末總結(jié)2022級(jí)生工(七)班王俊基因漂流：轉(zhuǎn)基因生物的外源基因通過花粉傳授等途徑擴(kuò)散到其他物種并轉(zhuǎn)入、整合到其他生物的基因組中，使得其他生物或產(chǎn)品混雜有轉(zhuǎn)基因成分，完成自然界基因庫的混雜和污染。基因工程：基因工程是在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)綜合發(fā)展基礎(chǔ)上，通過在分子水平上對(duì)基因或基因組進(jìn)行改造，使物種獲得新的生物性狀的一種嶄新技術(shù)。pl質(zhì)粒：是細(xì)菌中獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自我復(fù)制的，雙鏈，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子，少數(shù)為線形。p16電泳：帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其自身所帶電性相反的電極移動(dòng)。PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymeraechainreaction),是一種類似于細(xì)胞

23、內(nèi)DNA的天然復(fù)制過程，利用半保留復(fù)制的原理，以待擴(kuò)增的DNA為模板，在體外由引物介導(dǎo)的酶促合成特異DNA片段。(實(shí)驗(yàn)教材p64)半定量PCR:半定量PCR是通過RTPCR最終產(chǎn)物電泳后電泳條帶的明暗來間接反應(yīng)出原始模板的豐度的PCR技術(shù)。反轉(zhuǎn)錄PCR：(RTPCR)將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈擴(kuò)增相結(jié)合的技術(shù)。其原理是提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以poly(A)+選擇性RNA作為模板，采用oligo(dT),隨機(jī)引物或基因特異性的引物GSP(genepecialprimer)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的作用從RNA合成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光

24、定量PCR：通過對(duì)PCR擴(kuò)増反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。P21引物：兩段與待擴(kuò)增目的DNA序列側(cè)翼片段具有互補(bǔ)堿基特異性的寡核苷酸。(實(shí)驗(yàn)教材P65)RACE:cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapidamplificationofcDNAend)。主要通過PCR技術(shù)由已知的部分cDNA序列來獲取完整的cDNA的5、和3、端序列。最終，從兩個(gè)有相互重疊序列的3和5、一RACE產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)cDNA,或者通過分析RACE產(chǎn)物的3、和5、端序列，合成響應(yīng)引物擴(kuò)增出全長(zhǎng)cDNA。P43wetern印跡：即蛋白質(zhì)印跡雜交，將電泳分離后的組織或細(xì)胞總蛋白從凝膠轉(zhuǎn)

25、移到固體支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)?；蛭膸欤菏侵竿ㄟ^克隆方法保存在適當(dāng)宿主中的某一生物體DNA分子的總和，這些插入分子片段和載體連接在一起，代表某種生物的全部基因組序列或全部mRNA序列。P44分子雜交：不同的DNA片段之間，DNA片段與RNA片段之間，RNA片段之間，如果彼此間的核苷酸排列順序互補(bǔ)也可以復(fù)性，形成新的雙螺旋結(jié)構(gòu)。這種按照互補(bǔ)堿基配對(duì)而使不完全互補(bǔ)的兩條多核苷酸相互結(jié)合的過程稱為分子雜交。14.星號(hào)活性：在某些條件下，一種特異性識(shí)別順序的限制性性內(nèi)切酶在酶切同一種DNA片段時(shí)會(huì)產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)而得到不同的酶切片段的酶活性叫做

26、星號(hào)活性。15.藍(lán)白辬篩選：許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，包含B-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控區(qū)和N端146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）,這種載體適合轉(zhuǎn)入可編碼P-半乳糖苷酶C端部分序列的受體細(xì)胞。宿主和質(zhì)粒單獨(dú)編碼的片段僅是B-半乳糖苷酶的部分序列，單獨(dú)存在時(shí)沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)，即為互補(bǔ)。由互補(bǔ)而產(chǎn)生的lacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG（異丙基-B-D硫代半乳糖苷）的作用下，在白色底物某-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色沉淀底物，使菌落顯藍(lán)色。如果外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，無法實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，使得帶有重組質(zhì)粒菌落形成

27、白色菌落。16.目的基因：在基因工程實(shí)踐中，研究者所感興趣和想研究的基因就是目的基因17.Taq聚合酶：從溫泉中的水生棲熱菌中分離出TaqDNA聚合酶。該酶具有5、T3、聚合酶活性以及依賴于聚合作用的外切酶活性，不存在3、T5、外切酶活性，是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶。P5518轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化。P6919.啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5、端上游區(qū)，基因轉(zhuǎn)錄起始所必須的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。20.限制酶：（限制性內(nèi)切酶）是能夠識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一

28、類內(nèi)切酶。（限制限制外源DNA進(jìn)入；內(nèi)切：切DNA內(nèi)堿基）限制性內(nèi)切酶：一類能夠針對(duì)特定核苷酸序列進(jìn)行特定位點(diǎn)的切割，產(chǎn)生特定的粘性末端或平末端的酶。P51載體：把攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具叫做載體。在基因工程中，最常用到的是質(zhì)粒載體。P57感受態(tài)細(xì)胞：是指最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)的細(xì)胞。（實(shí)驗(yàn)教材P153）轉(zhuǎn)基因技術(shù)：轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾，這一技術(shù)稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Trangenetechnology）。轉(zhuǎn)基因食品：又稱基因改良食品或基因工程食品，是利用基因工程技術(shù)將一些微

29、生物、動(dòng)物或植物的基因植入另一種微生物、動(dòng)物或植物中，接受的一方面由此獲得了一種它所不能自然擁有的品質(zhì)。P138粘性末端：經(jīng)酶切后，切口處留下沒有配對(duì)的單鏈尾巴即為粘性末端。粘性末端可以分為5磷酸突出的末端，3羥基突出的末端。（實(shí)驗(yàn)教材P136）DNA連桿：連桿又叫銜接物，是指用化學(xué)法合成的由1012個(gè)核苷酸組成，具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段。P6828.基因藥物：基因工程藥物是指用現(xiàn)代基因重組技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行克隆，通過重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌、酵母或動(dòng)物細(xì)胞成功構(gòu)建工程菌株或細(xì)胞株，在工程菌株、細(xì)胞中所表達(dá)產(chǎn)生的新型藥物包括細(xì)胞因子、激素、溶血栓藥物、疫苗、抗體、反義RNA及基因

30、治療藥物等多種難治疾病的基因工程藥物。P14829.基因診斷：基因診斷即DNA診斷或分子遺傳學(xué)診斷，是指利用標(biāo)本中的DNA或RNA作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行疾病診斷的方法。P161基因治療：基因治療是指通過基因水平的改變來治療疾病的方法。P168T-DNA:它是在農(nóng)桿菌侵染細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，與腫瘤形成有關(guān)，包括左邊界和右邊界。農(nóng)桿菌：從土壤中分離出來的革蘭氏陰性菌，主要有兩種：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，其中研究最多也最徹底的是根癌農(nóng)桿菌，他能將自身Ti質(zhì)粒的一段DNA(T-DNA)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，從而使至于受傷部位形成冠癭瘤。基因工程在各領(lǐng)域中的應(yīng)用(舉例說明)(教

31、材P6P11)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用：在大田作物、園藝作物中應(yīng)用，如培育作物新品種、品質(zhì)改良、作物增產(chǎn)、防除雜草、防治病蟲害等。在林木花卉中的應(yīng)用：在花卉產(chǎn)業(yè)中為定向育種提供了技術(shù)保障。在畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因牛，豬，魚等動(dòng)物獲得優(yōu)良性狀。工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用：影響最為深遠(yuǎn)的為食品工業(yè)，基因工程技術(shù)涉及在食品領(lǐng)域中的作用目前涉及對(duì)食品資源的改造、新產(chǎn)品的開發(fā)、食品添加劑的生產(chǎn)以及食品衛(wèi)生檢測(cè)等方面。(5)在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域中的應(yīng)用通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)制造基因工程藥物，現(xiàn)已成功開發(fā)了人血球蛋白、干擾素、乙肝疫苗等令人鼓舞的新藥。(6)在環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域中的應(yīng)用：采用基因工程的方法可對(duì)不同菌株中的特異性降解基因進(jìn)行修飾、累加、轉(zhuǎn)移，提高微生物凈化環(huán)境的能力，吞噬和分解多種污染環(huán)境的物質(zhì)?；蚬こ讨醒芯恳粋€(gè)基因能有哪些技術(shù)運(yùn)用到其中？(l)DNA的提取技術(shù)a.基因組DNA提?。篊TAB法，SDS法等b.質(zhì)粒DNA提取：堿裂解法、煮沸法c.線粒體、葉綠體DNA的提?。翰钏匐x心結(jié)合SDS裂解法(2)DNA的凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(3)基因擴(kuò)增技術(shù)：PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))LP-PCR、錨定PCR、RT-PCR、熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)等(4)DNA印跡雜交技術(shù)：Southern雜交DN