中華蜜蜂鐵代謝相關(guān)蛋白及蛋氨酸甲基亞砜還原酶B基因的生物學(xué)功能分析

1、中華蜜蜂鐵代謝相關(guān)蛋白及蛋氨酸甲基亞砜還原酶B 基因的生物學(xué)功能分析近年來 , 自然環(huán)境破壞嚴(yán)重, 蜜蜂的飼養(yǎng)環(huán)境持續(xù)惡化 , 蜂群崩潰失調(diào)現(xiàn)象(Colony collapse disorder,CCD) 頻發(fā)。美國、歐洲部分地區(qū)的西方蜜蜂(Apismellifera Linnaeus) 損失量超過30%,因此造成的直接蜂群損失和繼發(fā)的作物損失不可估量。CCD勺原因尚未明確,各種疾病的肆虐和農(nóng)藥的大量使用均成為了學(xué)者們的猜測對象。西方蜜蜂和東方蜜蜂(Apis cerana Fabricius) 均屬于蜜蜂屬 , 親緣關(guān)系較近 , 意大利蜜蜂(A.m.ligustica, 簡稱意蜂 ) 和中華蜜

2、蜂(Apis cerana cerana,簡稱中蜂 ) 分別是其中的代表。意蜂在我國的飼養(yǎng)量遠(yuǎn)超中蜂, 在部分地區(qū)甚至出現(xiàn)混養(yǎng)現(xiàn)象, 可是意蜂出現(xiàn)的CC網(wǎng)象并未在中蜂群中出現(xiàn)，其中緣由尚未可知，因此探究中蜂自身的免疫機(jī)理勢在必行。 蛋氨酸甲基亞砜還原酶B 具有清除機(jī)體自由基、 保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷、抵御外源毒物的作用 ; 鐵代謝相關(guān)蛋白則通過調(diào)節(jié)體內(nèi)游離鐵水平避免產(chǎn)生自由基, 清除體內(nèi)已有活性氧、防止病原微生物侵染作用。本研究以中華蜜蜂(A.c.cerana) 為實(shí)驗(yàn)材料, 開展了蛋氨酸甲基亞砜還原酶B(methionine sulfoxide reductase B,MsrB) 和鐵代謝相關(guān)

3、蛋白 ( 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin) 、鐵蛋白 (Ferritin) 基因的功能研究 , 從分子水平上探討中蜂自身免疫力與中華蜜蜂蛋氨酸甲基亞砜還原酶B 及鐵代謝相關(guān)蛋白基因的聯(lián)系。 具體研究結(jié)果與主要結(jié)論如下 :(1) 中蜂 Acc MsrB 基因的分子特性和功能分析根據(jù)意蜂(A.melliferaligustica)的同源序列，利用RT-PC序口 RACE-PCR方法,首次克隆了中蜂 MsrB基因，命名為AccMsrB(GenBan電冊號:KP317814)。序列分析表明,其cDNAlr長為757 bp,包括138 bp的5非翻譯區(qū)（UTR）、205 bp的3非翻譯區(qū)（UTR）和4

4、14 bp的開放閱讀框（ORF）,編碼一段137個氨基酸的多肽 ,分子量和等電點(diǎn)分別為 15.5 kDa 和 7.77。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)AccMsrB的氨基酸序列與其他昆蟲，特別是蜜蜂科昆蟲MsrBs有較高的同源性，并 具有 MsrBs 中保守的功能區(qū)域。用TFSEARCH件分析AccMsrB啟動子，預(yù)測到兩個與調(diào)節(jié)環(huán)境應(yīng)激有關(guān)的轉(zhuǎn) 錄因子（HSF和Dfd）。表明,AccMsrB基因可能參與發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激響應(yīng)。采用qRT-PCRffi免疫組織化學(xué)的方法研究了 Acc MsrB在不同發(fā)育時期和組織中的時空表達(dá)特性, 結(jié)果表明 ,AccMsrB 在整個變態(tài)發(fā)育過程中均表達(dá), 其中在變態(tài)發(fā)育節(jié)

5、點(diǎn) :1 齡幼蟲 （L1） 、預(yù)蛹期 （prepupa,PP） 及 15 日齡成蜂 （A15） 時期表達(dá)量最高 ; 在各組織中表達(dá)量呈現(xiàn)差異, 其中表皮中表達(dá)量最高 , 肌肉中次之 ; 免疫組織化學(xué)結(jié)果也顯示 accmsrb 在體壁和眼部組織存在。 表明 accmsrb 可能與幼蟲發(fā)育階段轉(zhuǎn)換、抵御外界氧化損傷及清除體內(nèi)自由基等功能相關(guān)。應(yīng)用 qrt-pcr 方法探究了 accmsrb 在成蜂中不同應(yīng)激處理下的表達(dá)特性。 結(jié)果表明,accmsrb基因受非適宜溫度、uv、h2o2、農(nóng)藥、重金屬等因素應(yīng)激的誘 導(dǎo)表達(dá)。各因素處理后蜜蜂體內(nèi) h2o2 濃度保持在高濃度, 驗(yàn)證了這種誘導(dǎo)是氧化應(yīng)激的結(jié)

6、果 , 表明 accmsrb 可能在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。 （2） 中華蜜蜂鐵代謝相關(guān)蛋白基因的分子特性和功能分析利用上述方法, 首次克隆了中華蜜蜂鐵代謝相關(guān)基因 , 分別命名為 :acctf（genbank 注冊號 :jf330111.1） 、 accfth 及accftl（genbank 注冊號 :jf330112.1 和 jf340051.1） 。該組基因cdna全長分別2346、1028及1018bp，其中5非翻譯區(qū)分別為74bp、219bp 和 274bp,3 utr 分別為 133bp、134bp 和 90bp,of 分別為:2139bp、675bp和654bp,分別編碼包含71

7、2、219和218個氨基酸殘基的多肽，分子量分別為78.6、25.5 及 25.2kda, 等電點(diǎn)分別為 7.07 、 6.25 及 6.52。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)acctf 、 accfth 及 accftl 的氨基酸序列與其他昆蟲相關(guān)序列同源性較高。對鐵代謝相關(guān)基因進(jìn)行基因序列分析，發(fā)現(xiàn)在accfth的5 utr存在該基因家族的保守序列鐵反應(yīng)元件 (ire), 該元件可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu) , 是鐵調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn) , 在調(diào)控鐵吸收與釋放代謝過程起重要作用 ; 通過分析啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域含有部分與免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(hsf、ap-1、nrf2、nf b等)；分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)鐵蛋白

8、n-端含有該基因家族的保守氨基酸構(gòu)成的鐵結(jié)合位點(diǎn) ; 鐵蛋白重鏈中含有構(gòu)成鐵氧化中心的保守氨基酸及保守的半胱氨酸; 輕鏈序列中存在保守的糖基化位點(diǎn) (n-e-f) 及保守的半胱氨酸。表明 acctf 、 accfth及 accftl 是典型的轉(zhuǎn)鐵蛋白及鐵蛋白 , 可能參與蜜蜂的鐵代謝和應(yīng)激保護(hù)機(jī)制。利用 qrt-pcr 方法研究了 acctf 、 accfth 基因在不同發(fā)育時期和組織中的時空表達(dá)特性。 結(jié)果表明 , 該基因分別在l4 及 pp 高水平表達(dá), 表明轉(zhuǎn)鐵蛋白及鐵蛋白可能參與蜜蜂發(fā)育時期的轉(zhuǎn)換。在不同組織間 ,acctf 主要在蜜蜂脂肪體內(nèi)生成, 鐵蛋白則在各個組織中均有表達(dá) ,

9、其中中腸組織為主 , 均與其他物種中該組基因的表達(dá)模式相近。應(yīng)用qrt-pcr 的方法研究了 acctf 和 accfth 基因在不同條件下的表達(dá)特性。表明 ,acctf 在受到非適宜溫度、各種氧化應(yīng)激和農(nóng)藥處理后均出現(xiàn)誘導(dǎo)上調(diào) ,accfth 基因則只是在部分條件下出現(xiàn)表達(dá)上調(diào) , 在4、42 及農(nóng)藥處理時出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象。表明 , 中華蜜蜂轉(zhuǎn)鐵蛋白和鐵蛋白可能在中華蜜蜂應(yīng)對大多數(shù)不 利因素的應(yīng)激保護(hù)中發(fā)揮重要作用。用 FeCl3 處理后 , 隨著蜜蜂體內(nèi)鐵離子濃度上升, 轉(zhuǎn)鐵蛋白 AccTf 和 AccFTH基因都出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào) , 說明它們受到體內(nèi)游離鐵的誘導(dǎo) , 能夠起到儲存和轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子的作用 , 以此抑制體內(nèi)氧自由基的形成, 起