因工程制藥工藝

1、關于因工程制藥工藝第一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第六章 基因工程制藥工藝6.1 基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)6.2 基因工程大腸桿菌的構建6.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制第二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程技術基因重組示意圖DNA片段經(jīng)酶切、連接，形成重組DNA分子導入宿主細胞系統(tǒng)中擴增目標基因表達，生成新產(chǎn)物，出現(xiàn)新性狀第三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2 基因工程大腸桿菌的構建技術6.2.1 構建流程6.2.2 目標基因的克隆6.2.3 表達載體構建6.2.4 工程菌構建第四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2.1 工程菌構建流

2、程目標基因克隆PCR、文庫，化學合成表達載體構建酶切、連接遺傳轉化與篩選外源基因導入與培養(yǎng)工程菌新性狀、功能、物質工作內容方法第五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2.2 目標基因的克隆策略目標基因：編碼蛋白質或多肽的DNA序列正確克隆的重要性： 只要有一個堿基發(fā)生（錯義、無義、移碼）突變，就導致編碼氨基酸的變化，影響產(chǎn)物蛋白質的功能和生物學活性。 只要一個堿基發(fā)生同義突變，就可能導致生產(chǎn)過程和效率變化。第六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月基因克隆方法的選擇方法優(yōu)點缺點PCR擴增簡便快速，高效，數(shù)kb，單基因克隆DNA聚合酶活性和保真性限制文庫篩選長片段，無堿基錯誤，未知

3、序列基因克隆繁瑣，過程復雜，耗時，昂貴化學合成簡便，準確，已知序列，引物合成受合成儀器性能限制，長度很短第七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR技術PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應）：由DNA聚合酶催化下，對特定DNA序列進行的復制反應。本質：生物體的DNA復制原理在體外合成基因。發(fā)明者：Mullis，生物技術革命性象征，1993年獲得諾貝爾化學獎。第八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月在引物指導下，以DNA為模板，由DNA聚合酶催化的擴增特定DNA序列聚合延伸形成互補序列的反應。3AGCGAGGCATCG55TCGCTCCGTAG

4、C3第九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR單反應原理與過程(1)變性（94）(2)退火（55）(4)完成一個循環(huán)(3)延伸（72）第十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR擴增的反應體系組成成分濃度用量作用緩沖液10 x5 ul提供反應環(huán)境dNTPs20 mmol/L1 ul反應的底物正向引物20 umol/L2.5 ul擴增的起始點反向引物20 umol/L2.5 ul擴增的終止點DNA聚合酶1-5 U/ul1-2 U催化，熱穩(wěn)定性MgCl21.5-5.0 mmol/L1 ulMg2+是輔酶模板DNA5-10 ul含目標基因序列H2O27-33 ul稀釋總體積50 u

5、l第十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR擴增產(chǎn)物電泳PCR儀水平電泳槽凝膠電泳第十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程提取RNA轉 cDNA設計合成引物基因片段的3/5末端擴增RT-PCR擴增全長基因基因片段擴增第十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程第十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1 提取RNA從表達基因的組織中提取總RNA，或mRNA可以用RNA提取kit, Unizol, Trizol大量提取時可以用傳統(tǒng)的一步法提取-Unizol 或 Trizol 是總RNA提

6、取試劑，在配制過程中加入了異硫氫酸胍，能夠在組織勻漿過程中迅速滅活RNA酶，保持RNA的完整性。第十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月總RNA提取操作步驟 ：1、細胞或組織加Trizol后，室溫放置5 min，使其充分裂解。注：此時可放入-70長期保持。 2、12,000 rpm 離心5 min，棄沉淀。 3、按200 l氯仿/ml Trizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。 4、4 12,000 g離心15 min。 5、吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面；若同時提取DNA和蛋白質，則保留下層酚相存于4冰箱，

7、若只提RNA，則棄下層酚相。 第十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6、按0.5 ml異丙醇/ml Trizol 加入異丙醇混勻，室溫放置510 min。 7、4 12,000 g離心10 min，棄上清，RNA沉于管底。 8、按1 ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。 9、 4 8,000g離心5 min，盡量棄上清。 10、室溫晾干或真空干燥510 min。 注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。 11、可用50 l H2O，TE buffer溶解RNA樣品，5560,510min。注：H2O、TE須用DEPC處理并高壓。 第十七張，

8、PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月RNA提取注意事項嚴格防止RNA酶污染1. 佩戴一次性手套 2. 玻璃器皿可以在250烘箱中烘烤3小時 3. 槍頭、Eppendorf管用0.1%DEPC（攪拌攪勻）水中浸泡。通風櫥中室溫過夜，扣去液體，高壓滅菌30分鐘。 DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)為劇毒物，活性很強，小心在通風柜中使用。4. DEPC處理的水：0.1%DEPC處理，高壓滅菌30分鐘脫毒5. 防止環(huán)境中RNA酶污染第十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 轉cDNA（防RNA酶）逆轉錄: 將mRNA轉錄成為cDNA逆轉錄酶：依賴于RNA 的

9、DNA聚合酶(反轉錄酶) 禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶 鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶, 降解RNA DNA雜交體中的RNA 的能力較弱, 對熱的穩(wěn)定性較AMV反轉錄酶差cDNA合成: 1. 總RNA 2. 底物，dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP 3. 引物,起始DNA的合成, oligo(dT) 4. 逆轉錄酶 5. DEPC處理水 溫浴 ，按試劑盒說明書。 第十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 引物設計特異性引物設計Specific primer簡并引物設計Degenerated primer嵌套引物Nested Primer第二十張，PPT共

10、六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1）長度1530 bp2）AT:GC 約50%， 兩引物Tm值接近，5588之間。退火溫度 Tm (4GC2AT)53）引物3末端以G/C結尾較好4）不形成引物二聚體5）特異性, 作BLAST搜索6）簡并引物：保守序列；簡并度低；具單一密碼子 的氨基酸放在3 端7）逆向引物要用互補序列引物設計原則第二十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 1）特異性引物設計基因序列已知時, 可以設計特異性引物特異性引物：有準確的堿基序列第二十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2

11、022年6月 F：XXXF，5- XXXXXX atggccgcttcgcgtgcaacg-3 atggccgctt cgcgtgcaac gtttgttgcg ctcgtgtgcg ctctcgcgct cgccgccgcc gatgtgcaga atccgctcag tgacgatttc atcaatctca tcaacacaaa gcaaaactct aacgaagtca gggaccaggg atcttgtggt agctgctggg gttcggtgc tgtggaggcc atgaccgacc ggtactgtac atactccaat ggaactcaac acttccattt

12、ctccgctga tcagcggagaaatggaagtgt-3R：XXXR，5- XXXXXX第二十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2） 根據(jù)蛋白質同源序列設計簡并引物DNAMAN當基因序列未知時,利用軟件進行同源比對,設計間并引物第二十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月用DNAMAN進行同源比對,設計引物將蛋白質序列保存為seq文件格式比對、系統(tǒng)樹拷貝、保存第二十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月4. RT-PCR 擴增目的基因cDNA模板RNA/mRNAPCR擴增目的基因cDNAPrimer FPrime

13、r R第二十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR循環(huán)94 C 294 C 3055 C 4572 C 172 C 10 25 l volume10 X buffer(含MgCl2)，2.5 l 2.5 mM dNTP， 2 lTemplate cDNA， 1 lForward Primer， 1 l Reverse Primer ， 1 lDistilled Water，17.375 l Taq 酶， 0.125 l 35第三十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2.3 酶切、連接、轉化、篩選1.酶切反應概念：在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應的限制性片段。

14、5突出端3突出端平末端第三十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月分析基因的限制性內切酶譜，確定插入質粒的限制性內切酶位點 atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc

15、tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg cccccgctgg cgc

16、ccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg第三十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月/第三十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月酶切反應操作酶切體系組成：DNA，緩沖液，限制性內切酶反應條件：適宜溫度（37），1小時以上終止反應：加熱，加入EDTA，螯合鎂離子電泳檢查：酶切完全性超螺旋第三十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3.連

17、接反應概念：在連接酶的催化下，將DNA雙鏈上相鄰的3羥基和5磷酸基團共價結合形成3-5磷酸二酯鍵，使兩條斷開的DNA鏈重新連接起來。 第三十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月連接反應操作連接體系：載體片段與基因片段，緩沖液，連接酶連接反應：1626，數(shù)小時，或過夜終止反應：在70加熱10分鐘第三十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 轉化概念：把外源基因導入宿主細胞的過程。第三十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌轉化CaCl2法感受態(tài)細胞融化：置冰上，緩慢加入連接反應產(chǎn)物：混勻，置冰上30min熱擊：42，90s置冰上，12min擴增培養(yǎng)：加入LB培養(yǎng)基

18、，37，45min涂平板：含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)：倒置平板，37，出現(xiàn)菌落。第三十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 篩選與鑒定轉化后的細胞類型非轉化子：沒有導入外源DNA的非轉化宿主細胞轉化子：導入外源DNA的轉化細胞非重組子：僅含有空載體分子的轉化子重組子：含有重組DNA分子的轉化子非目標重組子：連接不正確的重組子目標重組子：含有連接正確的重組子（目的）第四十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）篩選策略與方法基于載體抗生素篩選法抗生素抗性基因氨芐青霉素被Bla基因編碼產(chǎn)物-內酰胺酶分泌到培養(yǎng)基水解。衛(wèi)星菌落：大菌落具有抑制抗性，周圍產(chǎn)生了相對抗性區(qū)，

19、允許一些沒有抗性的原菌生長。第四十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月藍白斑篩選-互補原理質粒lacZ標記基因，編碼產(chǎn)物為 -半乳糖苷酶N端146aa，無活性，受體。大腸桿菌染色體DNA：編碼C端部分序列，無酶活性，供體。受體與供體結合，恢復-半乳糖苷酶的活性，從而將無色X-gal底物水解成藍色產(chǎn)物。有外源基因， 白色菌落；無外源基因， 藍色菌落.第四十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）鑒定方法菌落PCR：含有目標基因載體大小：電泳檢測酶切鑒定：目標基因插入及插入方向測序驗證：目標基因的序列準確無誤，閱讀框通讀。第四十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2.

20、3 表達載體構建表達載體設計目標基因的定位克隆DNA重組篩選與鑒定 這里重點介紹表達載體的設計（構建過程與技術與目標基因克隆相似）。第四十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月表達載體的設計表達載體概念：在質粒載體的基礎上，在多克隆位點處插入外源基因表達盒所構成。外源基因表達盒（操縱子模型）：啟動子目標基因終止子第四十五張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌lac啟動子受環(huán)腺苷酸（cAMP）激活蛋白（CAP）的正調控和lac 負調控。CAP-cAMP復合物與操縱子結合，促進了RNA聚合酶與啟動子結合，開啟基因轉錄。lac 形成四聚體，與操縱基因結合，阻止轉錄起始。lac操縱子

21、的誘導物：IPTG（異丙基-D-硫代半乳糖苷）等乳糖類似物IPTG與lac 結合，解除了lac 的阻遏作用，激活基因轉錄。LacCAP-BSPromoterOperatorlacZlacYlacATerminatorRNA聚合酶lac糖苷酶，轉移酶，透過酶阻遏蛋白第四十六張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月啟動子功能：啟動子與RNA聚合酶結合，起始基因轉錄最關鍵的元件：決定著表達的類型和產(chǎn)量序列特點：-35位，TTGACA序列；-10位，TATAAT序列；強啟動子：UP元件第四十七張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月終止密碼設計UAA/TAA，UAG/TAG，UGA/TGATAA：

22、真核和原核，廣泛使用，高效TGA：高效過量表達時，能被tRNAtrp通讀。TGAT可阻止通讀。為了防止通讀，在終止密碼子之后的加強序列，成為四聯(lián)終止密碼子：TAATTAAGTAAA和TAAC第四十八張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2.4 基因工程菌的建立過程： 適宜宿主菌的轉化 篩選鑒定，遺傳穩(wěn)定性等目標： 獲得質粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達的載體，確保藥物的生物活性。第四十九張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月表達篩選與產(chǎn)物鑒定不同菌種的表達篩選誘導表達時間和誘導強度的篩選產(chǎn)物存在形式和存在場所的鑒定 -胞外，周質，胞內；包涵體，可溶性蛋白表達產(chǎn)物結構與活性鑒定 -

23、電泳，SDS，等電點電泳 -免疫雜交，末端測序，質譜分析 -分析與目標產(chǎn)物的同一性第五十張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1、不同菌株的表達能力不同同一菌種的不同轉化細胞之間存在表達差異。對宿主菌必需進行篩選目的：獲得最大表達量的菌種對轉化細胞的對數(shù)期進行誘導，收集菌體，裂解，提取總蛋白質，進行SDS電泳。第五十一張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2、不同誘導時間下的表達在不同誘導時間，取樣，電泳隨著誘導時間的延長，表達量增加第五十二張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3、蛋白質存在形式分析大腸桿菌M109結果： 在上清，可溶性蛋白質可溶性表達第五十三張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌DH5結果：蛋白質存在于沉淀中，以包涵體形式表達第五十四張，PPT共六十一頁，創(chuàng)作于2022年6月6.2.5 工程菌構建的質量控制為了確保工程菌構建的有效性，必須遵循GMP及其