免疫熒光技術(shù)

1、關(guān)于免疫熒光技術(shù)第一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月主要內(nèi)容技術(shù)原理1實驗流程2注意事項3常見問題4第二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence)技術(shù)原理將免疫學方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術(shù)測定含量，從而可對抗原進行細胞定性和定位分析。第三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)實驗方法分類： 直接法 間接法 補體法 其他第四張，PP

2、T共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月補體法：利用補體反應(yīng)，通過形成 抗原-抗體-補體復(fù)合物發(fā)射熒光。第六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月其他免疫熒光技術(shù)： 時間分辨免疫熒光分析 熒光偏振免疫分析技術(shù)第七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月時間分辨免疫熒光測定時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。 第八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年

3、6月熒光偏振免疫分析技術(shù)熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)是一種定量免疫分析技術(shù)，其基本原理是熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525nm)。偏振熒光的強弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時轉(zhuǎn)動的速度呈反相關(guān)。FPIA最適宜檢測小至中等分子物質(zhì)，常用于藥物、激素的測定。第九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM） 用激光作掃描光源，逐

4、點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態(tài)，也可以用于細胞內(nèi)生化成分的定量分析、光密度統(tǒng)計以及細胞形態(tài)的測量, 配合焦點穩(wěn)定系統(tǒng)可以實現(xiàn)長時間活細胞動態(tài)觀察。第十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光顯微鏡的不足之處：1、無法實現(xiàn)對熒光、透射光的同時采集，無

5、法實現(xiàn)多重熒光的同時采集和共定位。2、熒光的散射光太強，造成實際分辨率的大大下降。3、熒光漂白及對細胞組織的照射損傷。4、無法對樣品進行斷層掃描，完成3D的工作。5、濾鏡對熒光信號衰減大，靈敏度和熒光強度不夠。6、可以觀察活細胞和組織，但是細胞或組織內(nèi)機構(gòu)高度重疊。7、只能在二維壞境下觀察。8、樣品不能太厚。9、放大倍率小。第十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 熒光常見基礎(chǔ)術(shù)語：熒光物質(zhì)：某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光長的光線，即熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光物質(zhì)或熒光素。激發(fā)光：能特異性地激發(fā)某種熒

6、光素的一定波長范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。熒光探針：能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI，DAPI）、標有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）。自發(fā)熒光：組織和細胞中某些成分受激發(fā)時可發(fā)出熒光，即自發(fā)熒光。漂白：熒光物質(zhì)受激發(fā)時，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失，即漂白現(xiàn)象。第十四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月多激光器系統(tǒng)（多通道激光檢測）：在可見光范圍內(nèi)使用多譜線氬離子激光器，發(fā)射波長為457nm、488nm和514nm的藍綠光，氦氖綠HeNe（G）激光器提供發(fā)射波長為543nm的綠光，氦氖紅HeNe（R）激光器發(fā)射波長為633

7、nm的紅光，新的405nm的半導(dǎo)體激光器的出現(xiàn)可以提供近紫外譜線。第十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 目前常用于標記抗體的熒光素有以下幾種：異硫氰酸熒光(fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長為520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人

8、眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明(rhodamine, RB200) RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為 570nm，最大發(fā)射光波長為595600nm，呈現(xiàn)橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧Ｒ蚱錈晒獯銣缏?，也可用于單獨標記染色。第十八?/p>

9、，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如，4-甲基傘酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。鑭系鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。藻紅蛋白（P-phycoery

10、thrin，PE）PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸收峰為564 nm，當使用488 nm激光激發(fā)時其發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對于單激光器的流式細胞儀來說，推薦使用58521nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細胞儀推薦使用57513nm的帶通濾光片。FL2探測器檢測PE。第十九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月多甲藻葉綠素蛋白 （PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學合成器中發(fā)現(xiàn)的，是一種蛋白復(fù)合物，分子量約為35kD，最大激發(fā)波長的峰值在490nm附近，當被488nm氬離子激光激發(fā)后，發(fā)射光的峰值約為677nm。FL3探

11、測器檢測PerCP。碘化丙啶（ propidium iodide，PI）可選擇性地嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對中。在對DNA染色時，需用RNase對細胞進行處理，以排除RNA對DNA熒光定量精度的影響。在488nm波長激發(fā)下，PI的發(fā)射光譜為610-620nm。 FL2探測器檢測PI。第二十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 細胞爬片免疫熒光實驗流程1. 細胞爬片的制作； 2. 固定（4%的多聚甲醛）； 3. 細胞膜通透（0.

12、5%Triton X-100，20min）；4. 封閉（6%山羊血清，30min）； 5. 一抗孵育（一抗?jié)舛龋瑵窈校?過夜，PBS漂洗）； 6. 二抗孵育（二抗種屬，濕盒，室溫1h，避光，PBS漂洗）；7. 復(fù)染核（DAPI，避光，5min，PBS漂洗）；8. 封片（熒光淬滅劑的封片液）；9. 熒光顯微鏡下觀察采集圖像。第二十四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 細胞的固定【固定的定義】將新鮮的活體組織或細胞，立即加入固定液中，以此使細胞保持原有形態(tài)、結(jié)構(gòu)的一種方法?！竟潭ǖ囊饬x】1、組織和細胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反

13、應(yīng)，原位保存抗原，避免抗原失活或彌散。2、停止細胞中的生化反應(yīng)，固定其中的各種生化物質(zhì)狀態(tài)，防止細胞死亡后出現(xiàn)自溶分解。3、使細胞中蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持生前形態(tài)。4、固定細胞形態(tài)，防止其變形或破裂。5、使組織內(nèi)各種物質(zhì)產(chǎn)生不同的折光率，便于觀察和鑒定。6、使不同組織成分對染料有不同的親和力，便于染色。免疫熒光實驗流程中一些注意事項第二十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【固定液的選擇】第二十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂

14、片和脫片嚴重。 3、血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。封閉是血清與非特異性位點結(jié)合，以消除非特異性染色，提高目的蛋白的準確性和降低背景。血清封閉的時間是可以調(diào)整的，一般30min。 第二十八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 4、一抗孵育條件：在免疫熒光實驗中最重要，包括孵育時間和抗體濃度；一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min；具體條件還要摸索。 第二十九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6

15、月6、復(fù)染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位；一般常用DAPI復(fù)染。 7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液；避免產(chǎn)生氣泡。第三十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索；而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度；切記要避光反應(yīng)；但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間；最后，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時小包裝和并進行適當?shù)碾x心。第三十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于202

16、2年6月 8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當?shù)丶訌娗逑矗ㄑ娱L時間和增多次數(shù)）尤為重要，一般在一抗的清洗是5min*3次；注意（1）單獨沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。 （2）溫柔沖洗，防止切片的脫落； （3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。 （4）PBS的PH和離子強度的使用和要求，建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解； 低離子強度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強度則有利于分解）第三十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 9、拍照：封好片和用指甲油封固，保持避

17、光和濕度；正確使用熒光顯微鏡，防止紫外線對眼睛的損害；檢查時間每次以12h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降，熒光減弱；激發(fā)光長時間的照射，會發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過23h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。后欲再啟用時，須待燈光充分冷卻后才能點燃，一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源，關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；時效性：標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝

18、穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。第三十三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫熒光技術(shù)常見問題1、石蠟切片和冰凍切片的比較？ （1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因為作石蠟切片時要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。 （2）冰凍切片的優(yōu)點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫熒光時不需抗原修復(fù)這一步。缺點是細胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當你買一抗時，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，

19、如寫著兩者都可，那就都能做。 （3）石蠟切片的優(yōu)點可以保持組織細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中。由于石蠟切片可以切到4微米左右，抗體容易滲透到組織中去，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。 第三十四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月2、一抗的選擇要點和技巧是什么？ （1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原

20、抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。 （2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。 第三十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）種屬反應(yīng)性的選擇（species reactivity）。這一點很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內(nèi)的抗原。 （4）種屬來源，一般兔來源的多是多克?。欢∈髞碓吹亩嗍菃慰寺?，但也有另外。根據(jù)此來源來

21、選擇相應(yīng)的二抗。 （5）生產(chǎn)廠家的選擇。如santa Cruz公司抗體一般1ml，價格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，價格2800元左右。這兩個廠家的同一種抗體它的實際效價穩(wěn)定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Western blotting效果還可以。 第三十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月3、在什么情況下使用Triton-X100 （1）Triton X-100化學名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學（10um厚切片）和免疫細胞化學中一般用Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。 （2）其作用原理：T

22、riton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進入胞漿和胞核內(nèi)，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。 （3）Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。第三十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月4、封閉血清的選擇原則是什么？ （1）膜上或切片上有剩余的位點可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性！ （2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會造成背景。 （3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等

23、，但不能與一抗來源一致。第三十八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月5、抗體孵育條件的比較？ （1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。 （2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。 6、一抗4度孵育后為什么要進行37度復(fù)溫？ （1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片； （2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了

24、并易造成非特異染色。第三十九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月7、如何最大限度地降低組織非特異性染色？ （1）縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。 （2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。 （3）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果； （4）適當增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時間，在一抗、二抗孵育之后的浸洗尤為重要； （5）防止標本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強非特異性著色。第四十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月8、背景染色較深的原因有哪些？ （1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是