病毒的分離培養(yǎng)與動物接種、雞胚接種法

1、 病毒的分離培養(yǎng)與動物接種、雞胚接種法 1練習(xí)內(nèi)容 1小白鼠腦內(nèi)接種法2小白鼠滴鼻感染法3雞胚尿囊腔接種法 2目的要求 1了解病毒分離的方法2了解病毒接種的實驗途徑3掌握雞胚尿囊腔接種的方法與尿囊液收獲的方法 3病 毒 的 分 離 一、標(biāo)本采取的原則 二、標(biāo)本的處理 三、病毒的分離方法4一、標(biāo)本采取的原則 1. 病毒標(biāo)本的采取應(yīng)盡早為好. 2.由于大多數(shù)病毒對熱不穩(wěn)定，應(yīng)該立即接種，如果不能及時接種或需保存，一般置50甘油鹽水4或一20以下保存。 5二、標(biāo)本的處理（一）除菌處理 糞便可加青鏈霉素使最終濃度為10000單位/毫升，置4過夜。 鼻咽拭子一般加抗生素最終濃度為2000單位/毫升，置4

2、作用4小時。 對乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、腸道病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、痘病毒等，則可加入等量的乙醚4過夜除菌。 6（二）研磨和稀釋 對腦、脊髓等組織標(biāo)本首先應(yīng)經(jīng)研磨器或乳缽中充分研磨后，加稀釋液（PH7.6肉湯或10脫脂牛乳生理鹽水或0.5水解乳蛋白Hanks液）制成組織懸液，然后經(jīng)2000轉(zhuǎn)分離心20分鐘。必要時可加抗生素處理（同上）。 7病毒的分離培養(yǎng)的方法動物接種法 雞胚培養(yǎng)及病毒的雞胚接種法組織培養(yǎng)與病毒的細(xì)胞感染法 8動物接種法動物接種是最原始的病毒培養(yǎng)方法，常用的動物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、 家兔，有時也用猴、猿、猩猩等。接種時要根據(jù)病毒對動物，組織細(xì)胞等嗜性不同而選 擇特

3、定的部位，如鼻腔、皮內(nèi)、皮下、腹腔、腦內(nèi)、靜脈等（見表122）。9小白鼠腦內(nèi)接種法（示教） 【材料】 1.腦炎病毒（小白鼠腦脊髓炎）懸液：腦組織先用無菌生理鹽水洗去血液，再加100脫脂奶水研磨成10毫升懸液，離心沉淀30分鐘，吸取上清液。 2.小白鼠：3周齡，體重68克。 10【方法】 11毫升注射器抽取腦炎病毒懸液0.1毫升，去除注射器內(nèi)的氣泡。2取出小白鼠，左手將小白鼠固定，固定時用大拇指和食指握住小白鼠的頭部，左手掌輕輕按住小白鼠的體部。3右手以棉簽蘸以碘酒，消毒小白鼠的右頰部皮毛4右手拿住注射器在小白鼠眼與耳根連線的中點略偏耳朵的方向注入，進(jìn)入顱腔，進(jìn)針23毫米，不要插得太深，注射量為

4、0.020.03毫升。5注射完畢，將用過的注射器煮沸消毒，動物一般在34天開始發(fā)病，食欲減退，活動遲純、聳毛、振顫、慢慢發(fā)展為麻痹癱瘓而死亡。11小白鼠滴鼻感染法（示教） 【材料】小白鼠、流盛病毒的鼠肺適應(yīng)株懸液、無消毛細(xì)吸管、無菌小試管、乙醚、棉球及動物罐等?！痉椒ā?首先將小白鼠1只投于帶蓋的，內(nèi)放有浸蘸乙醚的棉球的容器內(nèi)行全身麻醉。注意麻醉的深度，一般不宜太深或太淺，太深時易遭致麻痹死亡或吸人性肺炎，太淺則易在滴注時打噴嚏。122用左手取出小白鼠握在掌中，大拇指及食指抓住耳部使其頭部朝前并呈仰臥位 置，另一手將吸有病毒懸液的滴管，慢慢滴于管口而不使其自然掉落呈懸滴狀，將懸滴 靠至動物鼻尖

5、，動物在呼吸時帶人，一般滴入0.030.05毫升，不宜過多，感染材料如被吸人肺內(nèi)，容易引起動物肺水腫，往往于接種后一天內(nèi)死亡。3動物慢慢蘇醒，在罐中逐日觀察，通常在數(shù)日后開始發(fā)病，發(fā)病的癥狀常為聳毛，咳嗽、不食、甚至死亡，解剖可觀察到肺臟有肺炎或出血性病灶。 13雞胚培養(yǎng)及病毒的雞胚接種法 一、雞胚的孵育 （一）雞卵的選擇 一般都選新鮮、10天以內(nèi)萊亨雞（Leghorn bird）的受精卵以保證規(guī)格質(zhì)量上的一致 （二）孵育 孵育時可將雞卵放人卵箱內(nèi)進(jìn)行,氣室向上，孵育的最適溫度為38-39，相對濕度為4070，孵育8日后，雞卵應(yīng)每天翻動12次，以幫助雞胚發(fā)育勻稱和防止雞胚膜粘連。 14（三）檢

6、卵 雞卵孵育45天后，即可用檢卵器檢查雞胚發(fā)育情況（二天一次）。1未受精雞卵：在檢卵器上僅見到模糊的陰影。2活雞卵：雞胚發(fā)育4天后，在檢卵器上就可見到清晰的血管，雞卵內(nèi)有一小黑點（雞胚），有明顯的自然轉(zhuǎn)動。3死胎：如果發(fā)現(xiàn)雞卵血管模糊、擴(kuò)張、胚胎活動呆滯或不能自主地轉(zhuǎn)動，則可判斷胚胎頻死或已經(jīng)死亡，應(yīng)將其挑撿出來。 雞胚孵育完畢后，用鉛筆劃出氣室邊緣和胚胎的位置待用。 15尿囊腔接種 【材料】新城雞瘟病毒10毫升稀釋液，1012日齡雞胚，卵墊，1毫升無菌注射器及14號針頭，小銼了刀，橡皮乳頭、大頭針，眼科鑷子及小鑷子，無菌培養(yǎng)皿、無菌生理鹽水，碘酒，酒精棉球。16【方法】 選911日齡雞胚，照檢后劃出氣室和胎位，在氣室邊緣上28毫米處避開血管作一標(biāo)記，將碘酒在此消毒后，用蛋鉆鉆一小扎（勿損傷殼膜），用注射器注入病毒0.10.2毫升，然后用溶化石蠟封口，置3335孵育（時間見表126）。17（2）剖檢及收獲收獲前雞胚應(yīng)置4冰箱過夜，使雞胚內(nèi)血液凝固。收獲時，用碘酒將氣室部卵殼 消毒，將氣室處卵殼剝?nèi)?，（不要將碎片落入殼膜）。然后用無菌手術(shù)刀柄從胚胎背部輕輕下壓，（切勿壓破卵黃囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶內(nèi)，于低溫保存。18三、病