青藤堿對(duì)糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷MCP1和TNFα含量的影響

1、青藤堿對(duì)糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷MCP-1和TNF-含量的影響【摘要】目的討論青藤堿(sinenine,Sin)對(duì)糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷單核細(xì)胞趨化蛋白-1(P-1)和腫瘤壞死因子-(TNF-)含量的影響。方法采用高脂高糖飲食加腹腔注射小劑量鏈脲霉素建立糖尿病大鼠模型，造模成功后將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、Sin低劑量治療組和Sin高劑量治療組。線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型。Sin低(30g/kg)、高劑量(60g/kg)治療組于術(shù)前30in分別給予大鼠腹腔注射。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)缺血90in再灌注24h大鼠額頂部皮質(zhì)P-1和TNF-含量的變化，并進(jìn)展

2、2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TT)染色和HE染色觀察腦堵塞體積及病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果腦缺血再灌注24h，缺血再灌注組P-1和TNF-含量明顯升高，與假手術(shù)組比擬，差異具有顯著性(均P0.05);與缺血再灌注組比擬，Sin高、低劑量治療組均顯著減少P-1和TNF-含量;高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P0.05);Sin治療組腦堵塞體積較缺血再灌注組減小，高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P0.05);Sin高、低劑量治療組腦組織缺血損傷病理學(xué)改變明顯輕于缺血再灌注組，Sin高劑量治療組缺血改變亦輕于低劑量治療組。結(jié)論Sin對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注腦損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低缺血再灌注

3、損傷腦組織P-1和TNF-含量，抑制再灌注損傷炎癥反響有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】缺血再灌注;單核細(xì)胞趨化蛋白-1;腫瘤壞死因子-;青藤堿Abstrat：bjetiveTstudytheeffetfsinenine(Sin)nthententsfP-1andTNF-aftererebralisheiareperfusin(I/R)injuryindiabetirats.ethdsInthisexperient,ratdelfdiabetesellitusasadebyhighsurse,fatdietandstreptztininjetin.Diabetiratsererandlydividedint4g

4、rups,naelyshaperatedgrup,I/Rgrup,ldseSintreatedgrupandhighdseSintreatedgrup.Thefaliddleerebralarterylusin(A)delasadebysuture-ludedethd.Sineregivenintraperitneallytrats30inbefrefalerebralisheiaperatin.After90inAflling24hfreperfusin,einvestigatedthententsfP-1andTNF-inisheifrntalandparietalrtex.HEstain

5、ingandTTstainingerealsinvestigated.Resultsparedithshaperatedgrup,thententsfP-1andTNF-ereinreasedat24hfreperfusinintheisheiterritry(P0.05).paredithI/Rgrup,Sindse-dependentlyreduedthententsfP-1andTNF-(allP0.05).paredithI/Rgrup,erebralinfartinvlueinlandhighdseSintreatedgrupsasdereaseddse-dependently(al

6、lP0.05).ThehangefisheiipairentinlrhighdseSintreatedgrupaslighterthanthatfI/Rgrup,andhighdseSintreatedgrupaslighterthanthatfldseSintreatedgrup.nlusinSinayreduederebralisheia-reperfusininjurybydereasingthententsfP-1andTNF-indiabetirats.Keyrds：Isheia-reperfusin;P-1;TNF-;Sinenine研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞早期穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織是再灌

7、注后炎癥反響的核心表現(xiàn)。筆者前期有研究證實(shí)1，腦缺血再灌注后炎癥反響是造成再灌注損傷的主要原因之一。而在糖尿病高血糖情況下，明顯加重的缺血性腦損傷可能與炎癥反響親密相關(guān)。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(P-1)是與單核/巨噬細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障浸潤(rùn)關(guān)系親密的趨化因子。青藤堿sinenine,Sin是從中藥青風(fēng)藤SineniuautuRehdetils中提取的生物堿單體，具有抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等藥理作用。已有報(bào)道，青藤堿對(duì)正常血糖大鼠缺血再灌注腦損傷有保護(hù)作用2，但其是否對(duì)腦缺血再灌注損傷單核細(xì)胞趨化蛋白-1(P-1)和腫瘤壞死因子-(TNF-)含量有影響尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)展了相關(guān)研究。

8、1材料與方法1.1糖尿病大鼠模型建立及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組安康istar大鼠，雄性，清潔級(jí)，共65只，體質(zhì)量(25030)g(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。大鼠喂飼高脂飼料(高脂飼料配方:1%膽固醇,10%豬油,0.2%丙基硫氧嘧啶,89%根底飼料3)。4周后,單次空腹腹腔注射30g/kg鏈脲霉素(購(gòu)于Siga公司)，繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng),于注射后1，2個(gè)月測(cè)定體質(zhì)量和血糖4。選擇非空腹血糖16.725.6l/L的大鼠作為造模成功的糖尿病大鼠。經(jīng)檢測(cè)模型成功大鼠共60只，將按隨機(jī)分組原那么分為假手術(shù)組(15只)、缺血再灌注組(15只)、Sin低劑量治療組(15只)及Sin高劑量治療組(15只)。1.

9、2方法1.2.1給藥方法Sin低劑量治療組(30g/kg)和高劑量治療組(60g/kg)均于術(shù)前30in分別給予大鼠腹腔注射，假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等量的生理鹽水腹腔注射。缺血再灌注組和Sin低、高劑量治療組建立腦缺血90in再灌注24h動(dòng)物模型。1.2.2腦缺血再灌注動(dòng)物模型的建立參照Lnga等5方法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。采用頸外動(dòng)脈插入線栓法，各組均進(jìn)展左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞。線栓采用石蠟線栓。線栓直徑約0.27，插入深度約18，此時(shí)線栓頭位于大腦中動(dòng)脈起始部。缺血90in時(shí)，抽提線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分：按照Lnga等5評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各組分別在再灌注24h進(jìn)展評(píng)分。0分：正

10、常，無(wú)神經(jīng)學(xué)征象;1分：動(dòng)物不能完全神展右前肢;2分：動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3分：動(dòng)物行走向右側(cè)跌倒，或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾;4分：無(wú)自發(fā)活動(dòng)，有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分在13分為造模成功。1.2.3P-1和TNF-含量檢測(cè)再灌注24h，立即將各組5只大鼠斷頭取腦，冰盤上快速取缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)，用冰冷生理鹽水沖洗掉血液，濾紙吸干水分,于低溫環(huán)境下稱重，置于含有冰冷生理鹽水的玻璃勻漿器中(勻漿器放入冰浴中)制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的腦組織勻漿，然后放置于低溫離心機(jī)中,4離心取上清液，ELISA法測(cè)定TNF-和P-1含量。1.2.4TT染色再灌注24h，將各組5只大鼠麻

11、醉后開顱取腦。將鼠腦置于-4冰箱20in后，將其切成5等份冠狀位切片，置于2%TT溶液中，水寓多聚甲醛液固定。用計(jì)算機(jī)病理圖像分析儀及梯形法計(jì)算出堵塞灶體積，各腦片堵塞灶體積之和即為堵塞體積。左側(cè)大腦半球堵塞灶區(qū)呈白色，主要為額頂部皮質(zhì)和尾殼核，正常組織呈紅色。局部組織表現(xiàn)為由白色向紅色過(guò)度區(qū)(見圖1)。圖1大鼠腦缺血再灌注24hTT染色1.2.5HE染色再灌注24h將各組剩余50只大鼠，用生理鹽水和多聚甲醛心臟灌注固定，斷頭取腦，取左側(cè)大腦半球間隔 嗅球尖端711之間5厚組織塊，固定、脫水、包埋成蠟塊，切片，厚5進(jìn)展常規(guī)HE染色，觀察病理形態(tài)學(xué)改變。見圖25。1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用

12、SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展運(yùn)算，結(jié)果以s表示,組間差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1各組大鼠腦組織P-1和TNF-含量的比擬見表1。與假手術(shù)組比擬，缺血再灌注組缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)P-1和TNF-含量明顯增高，差異具有顯著性(P0.05);與缺血再灌注組比擬，Sin高、低劑量組均可明顯降低腦組織P-1和TNF-含量(P0.05)，且高、低劑量組之間差異具有顯著性(P0.05)。表1各組大鼠腦組織TNF-、P-1及腦堵塞體積的比擬與假手術(shù)組比擬，P0.05;與缺血再灌注組比擬，*P0.05;與Sin低劑量治療組比擬，P0.052.2各組腦堵塞體積的比擬見表1。Sin高、

13、低劑量治療組堵塞體積較缺血再灌注組減小(均P0.05)，高、低劑量組之間差異亦具有顯著性(P0.05)。3討論防己科植物青藤及毛青藤的枯燥藤莖稱青風(fēng)藤，Sin是從中提取的生物堿單體，在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等各種風(fēng)濕病以及心律失常中發(fā)揮了較好療效。梁健等2給予青藤堿治療正常血糖的腦缺血再灌注大鼠，顯示青藤堿對(duì)缺血再灌注腦損傷有保護(hù)作用。但詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明，糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷給予不同劑量的Sin治療，可明顯減少腦堵塞體積，減輕缺血造成的病理?yè)p害，并且高劑量Sin的腦保護(hù)效果更顯著。我們前期研究證實(shí)，缺血再灌注腦損傷早期存在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的炎癥級(jí)聯(lián)反響過(guò)程1。單核/巨噬細(xì)胞浸

14、潤(rùn)那么參與缺血后期的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷6。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(P-1)是與單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系親密的趨化因子,是促使單核/巨噬細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)入損傷腦組織的關(guān)鍵因素。P-1是由76個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，P-1在正常腦組織保持極低程度存在。腦缺血后神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞/活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)P-1。大鼠缺血再灌注后6h腦組織P-1程度開場(chǎng)上升，2d到達(dá)頂峰,后逐漸下降，P-1峰濃度為是對(duì)側(cè)半球同時(shí)間點(diǎn)的49.3倍6。缺血腦組織P-1表達(dá)的增高，誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞向缺血腦損傷區(qū)浸潤(rùn)，參與繼發(fā)性腦損傷或遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。P-1也可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，上調(diào)IA-1等黏附分子表達(dá)，介導(dǎo)腦組織損傷。TNF-那么是被激活的巨噬細(xì)胞分泌的一種具有廣泛生物學(xué)功能的多效細(xì)胞因子。腦缺血再灌注后，激活的TNF-能促進(jìn)星形細(xì)胞和浸潤(rùn)的白細(xì)胞表達(dá)P-17，使單核細(xì)胞穿越血腦屏障進(jìn)入腦組織內(nèi)，而浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞又能加重炎癥反響，參與神經(jīng)元損傷。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，糖尿病大鼠腦缺血90in再灌24h，缺血再灌注組腦組織P-1和TNF-含量明顯上升，顯示此階段再灌注損傷由缺血性向炎癥性損傷發(fā)生了重大轉(zhuǎn)變，單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞參與了缺血再灌注腦損傷過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)8