膜片鉗技術(shù)在中藥對(duì)心肌鈣離子通道作用研究中的應(yīng)用

1、膜片鉗技術(shù)在中藥對(duì)心肌鈣離子通道作用研究中的應(yīng)用【摘要】膜片鉗技術(shù)自創(chuàng)造以來(lái)，被廣泛用于生物學(xué)、生理學(xué)、藥理學(xué)等多種學(xué)科的根底研究和應(yīng)用研究中，為解決生物學(xué)跨膜信號(hào)傳導(dǎo)問題提供了革命性的檢測(cè)手段。目前該技術(shù)已運(yùn)用于中藥對(duì)離子通道作用的研究中，尤其是心肌鈣離子通道。本文綜述了近年來(lái)中藥對(duì)心肌鈣通道的作用?！娟P(guān)鍵詞】膜片鉗技術(shù)；中藥；鈣離子通道TheAppliatinfPathlapintheResearhfTraditinalhineseediinenardiauslealiuhannelsKeyrds:pathlap;traditinalhineseediine;aliuhannels膜片鉗技

2、術(shù)是以微弱電流信號(hào)測(cè)量為根底,利用玻璃微電極與細(xì)胞膜封接來(lái)測(cè)量多種通道電流,其測(cè)量值可到達(dá)皮安級(jí)(pA,10-12A),是一種典型的低噪聲的測(cè)量技術(shù)。膜片鉗技術(shù)的問世給細(xì)胞生物學(xué)的研究帶來(lái)了一場(chǎng)革命。當(dāng)前該技術(shù)已經(jīng)成為細(xì)胞電生理學(xué)的重要研究方法。尤其是該技術(shù)近年來(lái)浸透到中醫(yī)藥研究的各個(gè)領(lǐng)域,對(duì)中醫(yī)藥研究程度的進(jìn)步起到了很大的推動(dòng)作用。1膜片鉗技術(shù)的根本原理膜片鉗的根本原理是利用負(fù)反響電子線路，將微電極尖端所吸附的一個(gè)至幾個(gè)平方微米的細(xì)胞膜的電位固定在一定程度上，對(duì)通過通道的微小離子電流作動(dòng)態(tài)或靜態(tài)觀察，從而研究其功能。膜片鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)膜電流固定的關(guān)鍵步驟是在玻璃微電極尖端邊緣與細(xì)胞膜之間形成高阻

3、密封，其阻抗數(shù)值可達(dá)10100G。由于此阻值如此之高，故根本上可看成絕緣，其上之電流可看成零。此密封不僅電學(xué)上近乎絕緣，在機(jī)械上也是較結(jié)實(shí)的。此時(shí)可通過膜片鉗放大器，選用不同的記錄形式細(xì)胞吸附式ell-attahed，全細(xì)胞形式hel-ell等對(duì)細(xì)胞進(jìn)展電壓和電流鉗制，記錄各種離子通道電流、細(xì)胞的靜息膜電位及動(dòng)作電位等。2心肌細(xì)胞鈣離子通道1958年Fart和Katz等率先發(fā)現(xiàn)了鈣離子通道(L型鈣通道),目前已證實(shí)心肌細(xì)胞上存在B型、L型和T型三種鈣通道且后二者屬電壓依賴性通道(Vltagedependenthannels,VDs)。B型鈣通道即背景鈣通道(bakgrunda2hannels)

4、，是靜息鈣通道；L型(lng-lasting)鈣通道是細(xì)胞興奮過程中鈣離子內(nèi)流的主要途徑；T型transient鈣通道的功能與維持細(xì)胞自律性和低膜電位(接近靜息膜電位)時(shí)鈣的跨膜運(yùn)動(dòng)有關(guān)。心肌細(xì)胞上的L型鈣通道，其啟閉對(duì)動(dòng)作電位平臺(tái)期的形成、細(xì)胞內(nèi)鈣離子增高以及心肌細(xì)胞的電生理特性等起重要作用。3部分中藥對(duì)心肌鈣離子通道的作用目前膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用主要在以下幾個(gè)方面：離子通道特性的研究；離子通道活動(dòng)調(diào)控的研究；離子通道生理與病理情況下作用機(jī)制的研究；單細(xì)胞形態(tài)與功能關(guān)系的研究；藥物作用機(jī)制的研究。對(duì)中藥研究而言，現(xiàn)階段主要使用膜片鉗單通道或者全細(xì)胞技術(shù)，觀察中藥對(duì)離子通道特性的影響來(lái)解釋藥物作用

5、的機(jī)理，這將有利于說(shuō)明中藥在細(xì)胞程度的作用機(jī)制。我們通過中藥提取物對(duì)心肌各種鈣通道的影響研究，來(lái)討論其防治心率失常、強(qiáng)心的作用機(jī)制，或者發(fā)現(xiàn)其引起心率失常的離子通道原因。3.1人參現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)人參根中含有多種人參皂甙。包括齊墩果酸型人參皂甙單體R0，人參二醇組皂甙R,Rd，人參皂甙Rg1，人參三醇組皂甙單體Rh等。齊墩果酸型人參皂甙單體R0(200l/l)對(duì)心肌L、B、T型3種類型鈣通道的活動(dòng)均無(wú)影響1。但是人參皂甙Rg1、人參二醇組皂甙R,Rd1500g/l、人參三醇組皂甙單體Rh160l/L可使心肌鈣通道的平均開放時(shí)間縮短,平均關(guān)閉時(shí)間延長(zhǎng),開放概率減小，但對(duì)3種類型鈣通道的電流幅值無(wú)明顯

6、影響,其作用與異搏定相似,與BayK8644相反24。通過與鈣通道阻滯劑異搏定37.5g/l、鈣通道沖動(dòng)劑BAYK8644(5nl/L)的對(duì)照實(shí)驗(yàn),證明人參二醇組皂甙R200g/l對(duì)鈣通道有阻滯作用而Rd200g/l那么無(wú)此作用5。3.2粉防己堿粉防己堿是從防己科多年生木質(zhì)藤本植物粉防己中提取的。運(yùn)用膜片鉗單通道技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)0.3300l/L粉防己堿濃度依賴性地阻滯L型鈣電流,半數(shù)抑制濃度I50為13.3l/L，但對(duì)其電流-電壓曲線無(wú)明顯影響6。全細(xì)胞記錄研究7卻發(fā)現(xiàn)1l/L粉防已堿可使電流-電壓曲線的各電流值均降低，0.13.2l/L使鈣電流呈濃度依賴性降低,I50為0.7l/L。此外,0.

7、3l/L就能阻滯異丙腎上腺素0.1l/L引起的鈣電流增大。雖然兩者在實(shí)驗(yàn)詳細(xì)結(jié)果上有差異，但仍證明粉防己堿可阻滯心肌細(xì)胞L型鈣電流。3.3丹參丹參為活血化瘀的代表藥之一，除含脂溶性非醌類成分，丹參酮、丹參酮-A等外，還有水溶性成分。全細(xì)胞記錄實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,丹參酮-A10、20和40l/L可使L型鈣電流的峰值分別減少35.2%、57.7%和74.7%,但對(duì)最大激活鈣電流的電壓依賴曲線及穩(wěn)定激活曲線無(wú)影響8，9。同樣使用全細(xì)胞記錄，經(jīng)過20in的缺氧以及5in的復(fù)氧后,50、100、200g/L丹參分別將兔心室肌細(xì)胞L型鈣通道電流的峰值從(667.9158.7)pA減小至(537.1121.3)pA、

8、(497.247.9)pA、(343.873.1)pA10，11。顯然,丹參酮-A具有類似異搏停樣L型鈣通道阻斷劑作用,其阻斷作用呈非電壓依賴性；丹參能有效地減少缺氧復(fù)氧后心室肌細(xì)胞的L型鈣電流,這種作用可能是其抗心肌缺血以及抗缺血再灌性心律失常的機(jī)制之一。3.4三七皂甙通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察：三七皂甙Rb110l/L和30l/L分別使BayK8644和nifedipine敏感的鈣內(nèi)向電流即L型鈣電流減少16.2%3.7%和38.3%10.4%,且在3-1000l/L范圍內(nèi),其抑制作用呈濃度依賴關(guān)系；同劑量的三七皂甙Rg1對(duì)該電流無(wú)明顯影響1213；三七總皂甙100g/L和300g/L對(duì)大鼠

9、心肌細(xì)胞L型鈣電流的抑制率分別為(26.734.5)%和(4919.6)%14。因此可以認(rèn)為三七總皂甙、Rb1為L(zhǎng)型鈣通道阻滯劑而Rg1對(duì)其無(wú)抑制作用。3.5黃芪研究發(fā)現(xiàn)黃芪對(duì)L型鈣電流有雙向調(diào)節(jié)作用。它一般不影響正常心肌細(xì)胞L型鈣電流的幅度,但可抑制病毒感染細(xì)胞L型鈣電流的增加,從而防止病毒感染可能導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載,對(duì)感染細(xì)胞起到保護(hù)作用15。這可能是黃芪用于心肌炎治療的作用機(jī)制之一。另一方面，黃芪還具有恢復(fù)受抑制的L型鈣電流的作用。急性心肌梗死1周時(shí)，兔梗死周邊區(qū)心室肌細(xì)胞L型鈣電流受到抑制,電流-電壓關(guān)系曲線(I-V)上移,失活曲線左移,半數(shù)最大失活電位由-13.14.2V左移至-25

10、.97.0V,失活速度加快16。這可能是急性心梗后室性心律失常發(fā)生的原因之一。使用黃芪后，缺血引起的L型鈣電流的抑制有部分改善。3.6其他中藥對(duì)心肌鈣離子通道作用的研究川芎嗪、丹皮酚、芍藥苷、青藤堿28阻斷L型鈣電流，但不使I-V曲線的峰值發(fā)生偏移。其中丹皮酚、青藤堿可使I-V曲線上移，這些可部分解釋其抗心律失常作用機(jī)制。芍藥苷激活曲線沒有明顯的改變，失活曲線向較負(fù)電壓的方向偏移,通道從失活中恢復(fù)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)。蓮心堿29阻斷L型鈣電流后使峰電位略右移，而烏頭堿30、大豆皂甙單體AI31雖然能顯著阻斷L型鈣通道的活動(dòng),使其開放時(shí)間縮短、關(guān)閉時(shí)間延長(zhǎng)、開放概率下降但對(duì)通道的電流幅度無(wú)明顯影響。4

11、討論和展望綜上所述，中藥對(duì)心肌細(xì)胞鈣通道作用的研究不僅品種繁多，而且方法多樣，既有膜片鉗單通道記錄，也有全細(xì)胞記錄。上述大部分中藥具有類似鈣拮抗劑的作用，也有少部分類似鈣沖動(dòng)劑，例如黃連素、異馬錢子堿等。所以上世紀(jì)80年代，陳可冀教授率先提出關(guān)于中藥鈣拮抗劑的研究方向。這可看成是鈣通道藥理學(xué)在我國(guó)開展的一個(gè)特殊分支學(xué)科。目前對(duì)中藥影響心肌細(xì)胞鈣通道作用的研究雖多，但是仍存在不少問題。首先，盡管研究已經(jīng)深化到中藥的有效成分，但對(duì)中藥復(fù)方研究的文獻(xiàn)尚少。而中醫(yī)治療以復(fù)方為主，復(fù)方研究盡管復(fù)雜，但意義重大，需要引起重視。其次，對(duì)通道的研究尚處在初層次。文獻(xiàn)結(jié)果多以開放時(shí)間、開放概率、電流幅度、I-V

12、曲線的變化等參數(shù)為主。往往滿足于觀察到對(duì)通道表現(xiàn)出抑制或者激活這一現(xiàn)象，而沒有進(jìn)一步分析通道抑制或者激活的原因。我們知道通道的開放受氧化復(fù)原反響、磷酸化或去磷酸化反響、以及蛋白激酶等等因素調(diào)控，外界刺激可以直接作用于通道產(chǎn)生作用，或者通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑間接作用于通道。我們施加的中藥到底是直接還是間接作用于通道，這就需要單通道膜片鉗記錄和全細(xì)胞記錄結(jié)合起來(lái)一起研究，兩者的結(jié)果互相參考。假如某種中藥施加到浴液中，對(duì)通道只有直接作用而無(wú)間接作用，理論上電流只出如今全細(xì)胞記錄，而不出如今單通道記錄。而我們目前的研究多只是使用一種膜片鉗的記錄形式。假如是間接作用于通道，那它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游和下游途徑又是如何的。這些問題都需要我們做進(jìn)一步的研究。因此，我們應(yīng)該把膜片鉗技術(shù)和PR技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)結(jié)合起來(lái)，對(duì)通道進(jìn)展研究。用膜片鉗技術(shù)研究了單個(gè)細(xì)胞的通道電學(xué)特性后，使用PR技術(shù)對(duì)該細(xì)胞內(nèi)這種通道亞基RNA的表達(dá)情況進(jìn)展分析。細(xì)胞內(nèi)的RNA程度變化常常反映蛋白產(chǎn)物的變化，