去垢劑對單向免疫擴散法測定流感病毒疫苗血凝素含量的影響

1、去垢劑對單向免疫擴散法測定流感病毒疫苗血凝素含量的影響去垢劑對單向免疫擴散法測定流感病毒疫苗血凝素含量的影響流感病毒的囊膜外層分布著兩種主要的抗原物質(zhì)：血凝素haeagglutinin，HA和神經(jīng)氨酸酶neurainidase，NA1-2。研究說明，血凝素在流感病毒感染宿主細胞的過程中起著至關(guān)重要的作用3，是流感病毒亞單位疫苗中有效的免疫物質(zhì)4-6。因此，血凝素含量的準(zhǔn)確測定是流感病毒疫苗制品質(zhì)量控制的關(guān)鍵。目前，國際上通用的流感論文聯(lián)盟.Ll.病毒血凝素含量測定方法是單向免疫擴散法singleradialiundiffusin，SRID7-12，該方法不僅應(yīng)用于流感病毒亞單位疫苗成品的血凝素

2、含量測定，在疫苗制品消費的中間過程控制中也起著至關(guān)重要的指導(dǎo)作用。在流感病毒亞單位疫苗的消費過程中，首先制備出大量的完好病毒，然后經(jīng)裂解、純化等假設(shè)干處理后獲得亞單位疫苗13。為了在疫苗制品的消費過程中對不同階段的中間產(chǎn)品進展必要的質(zhì)量控制，就需要對不同組成成分的中間產(chǎn)品進展血凝素含量的檢測。這些中間產(chǎn)品既包括未裂解的完好病毒也包括經(jīng)過裂解、純化的亞單位產(chǎn)品。因此，確定一種可以同時對完好病毒和亞單位疫苗進展血凝素含量測定的單向免疫擴散法對于疫苗消費過程的質(zhì)量控制具有重要的意義。1材料與方法1.1疫苗中間產(chǎn)品和標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗血清流感病毒疫苗中間產(chǎn)品：完好病毒液及亞單位疫苗原液由天士力金納生物技術(shù)天

3、津消費；標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗血清均購自NIBS。1.2主要試劑瓊脂糖BIEST；去垢劑：Zittergent3-14Detergenterk；染色液0.4%考馬斯亮藍R250；脫色液無水乙醇冰醋酸水=291259。1.3抗原樣本的處理1.3.1去垢劑濃度的比擬將A/Vitria/210/09H3N2NYX-187標(biāo)準(zhǔn)抗原、完好病毒液1、亞單位疫苗原液1三個抗原樣本以抗原：去垢劑=91的體積比分別參加濃度為0.375%、0.625%、1.25%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%/v的去垢劑，以PBS代替去垢劑等體積參加，作為去垢劑濃度為0的對照。3組抗原樣本各經(jīng)八個濃度終濃度分別為0、0.03

4、75%、0.0625%、0.1250%、0.2500%、0.5000%、1.0000%、2.0000%的去垢劑在室溫下裂解30in后同時加至抗體凝膠板中進展SRID。1.3.2裂解時間的比擬取A/Vitria/210/09H3N2NYX-187標(biāo)準(zhǔn)抗原和亞單位疫苗原液2，分別參加1/9體積的10%/v去垢劑，在室溫條件下分別放置不同時間進展裂解。其中，各裂解時間組的標(biāo)準(zhǔn)抗原均稀釋為1、0.75、0.50、0.25倍濃度，完好病毒液2和亞單位疫苗原液2分別稀釋12倍和15倍后進展裂解。所有抗原樣本經(jīng)處理后同時加至抗體凝膠板中進展SRID。論文聯(lián)盟.Ll.1.4SRID實驗用PBS配制1%瓊脂糖溶

5、液，加熱融化后降溫至45，按說明書中的建議量參加標(biāo)準(zhǔn)抗血清，混勻后傾注在擴散板上凝膠厚度為2，待瓊脂糖溶液凝固后用4直徑的打孔器打孔并除去孔內(nèi)凝膠，即為抗體凝膠板。向抗體凝膠板的各加樣孔中分別參加18L處理后的抗原樣本，將凝膠板置于濕盒內(nèi)室溫擴散至少18h。凝膠經(jīng)漂洗、壓雹枯燥后進展染色、脫色，測量沉淀圈直徑8。2結(jié)果2.1去垢劑濃度的比擬將標(biāo)準(zhǔn)抗原、完好病毒液1、亞單位疫苗原液1三個抗原樣本分別以終濃度為0、0.0375%、0.0625%、0.1250%、0.2500%、0.5000%、1.0000%、2.0000%的去垢劑于室溫下同時裂解30in后進展SRID，測量沉淀圈直徑，然后根據(jù)三組

6、樣本的沉淀圈直徑繪圖，見圖1。從3條曲線的形態(tài)可以看出，去垢劑終濃度由0增加至0.125%時，3種抗原的沉淀圈均逐漸增大；當(dāng)去垢劑濃度由0.125%增至2.00%時，標(biāo)準(zhǔn)抗原和亞單位疫苗的沉淀圈直徑無明顯變化，而完好病毒的沉淀圈仍隨去垢劑濃度的增大而變大，直到去垢劑終濃度到達1%時，才不再增大。這說明不管是標(biāo)準(zhǔn)抗原、亞單位疫苗還是完好病毒，在進展SRID實驗前都需要進展裂解；標(biāo)準(zhǔn)抗原和亞單位疫苗因為事先都經(jīng)過了一定的裂解過程，故需要的去垢劑濃度較低0.125%，而完好病毒那么需要使用較高濃度1%的去垢劑才可以充分裂解。圖1中亞單位疫苗與標(biāo)準(zhǔn)抗原兩條曲線幾乎是平行的，這說明去垢劑濃度的變化對該亞

7、單位疫苗與標(biāo)準(zhǔn)抗原的影響是一致的。經(jīng)過終濃度不小于0.125%的去垢劑裂解后，利用SIRD的方法以標(biāo)準(zhǔn)抗原作為參考品來測定該工藝條件下消費的亞單位疫苗的血凝素含量可以得到穩(wěn)定而準(zhǔn)確的結(jié)果。去垢劑終濃度由0增加到2%時完好病毒SRID沉淀圈直徑增加了5.2，而亞單位疫苗與標(biāo)準(zhǔn)抗原的沉淀圈僅增加了2.9和2.8?？梢姡ス竸舛鹊淖兓瘜ν旰貌《镜淖饔米顬轱@著。當(dāng)利用SRID的方法以標(biāo)準(zhǔn)抗原作為參考品來測定完好病毒中的血凝素含量時，樣本處理所需要的去垢劑終濃度不應(yīng)小于1%。2.2裂解時間的比擬標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋為四個濃度與稀釋的亞單位疫苗原液共同進展三組裂解時間的比擬，SRID測得的沉淀圈直徑見表1。利用

8、SRID的沉淀圈直徑與抗原濃度呈線性的關(guān)系分別對3組裂解時間所得到的結(jié)果做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將3組中分別測得的完好病毒液2和亞單位疫苗原液2的沉淀圈直徑代入公式中，計算其血凝素含量，見表2。由表1和表2可見，標(biāo)準(zhǔn)抗原和亞單位疫苗SRID沉淀圈直徑均不隨裂解時間的變化而發(fā)生顯著變化。因此，在3組裂解時間下分別測得的完好病毒液血凝素含量V=0.2%和亞單位疫苗原液血凝素含量V=1.3%的結(jié)果都是一致的。3討論單向免疫擴散SRID實驗應(yīng)用于流感病毒血凝素含量的檢測是一種非常成熟、有效的方法，該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重復(fù)性好等優(yōu)點，是?中國藥典?2022年版三部中用于流感病毒疫苗血凝素含量檢測的標(biāo)準(zhǔn)

9、方法。而該方法中，樣本裂解的充分與否是影響測定結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。本文以流感病毒疫苗消費過程中不同消費階論文聯(lián)盟.Ll.段的中間產(chǎn)品作為樣本，研究了利用單向免疫擴散法測定樣本血凝素含量時去垢劑的影響。本研究的結(jié)果說明，完好病毒或亞單位疫苗以終濃度1%的去垢劑對抗原樣本進展30in的裂解處理后，均能在單向免疫擴散實驗中得到穩(wěn)定準(zhǔn)確的結(jié)果。去垢劑濃度低于1%時，完好病毒裂解不充分，進展單向免疫擴散所得的沉淀圈偏??；而去垢劑濃度高于1%時，完好病毒和亞單位疫苗的SRID沉淀圈直徑均不隨去垢劑濃度的增加而發(fā)生變化。此外，裂解時間的延長不會對血凝素含量的測試結(jié)果產(chǎn)生影響。完好病毒未經(jīng)過裂解，抗原顆粒較

10、大，在SRID中不易擴散；亞單位疫苗經(jīng)過了一定的裂解處理，抗原顆粒較小，相對于完好病毒顆粒更易于擴散；而亞單位疫苗經(jīng)去垢劑處理后可進一步裂解為顆粒更小的抗原物質(zhì)，在SRID中最易擴散，裂解劑濃度比擬的實驗結(jié)果也充分證明了這一點。標(biāo)準(zhǔn)抗原與亞單位疫苗相似，也需要經(jīng)去垢劑裂解后進展SRID。在大規(guī)模流感病毒疫苗消費的質(zhì)量控制工作中，經(jīng)常需要對大量的不同階段中間產(chǎn)品樣本進展檢測。利用本研究所確定的樣本處理條件，可同時對多種待測抗原樣本進展血凝素含量的測定，對于進步工作效率、縮小實驗間誤差、節(jié)約實驗本錢等方面都具有非常重要的意義。參考文獻1ValentineR，IsaasA.Thestruturefi

11、nfluenzavirusfilaentsandspheresJ.JGenirbil，1957,161：195-204.2hppinP，urphyJS，Stekenius.ThesurfaestruturefinfluenzavirusfilaentsJ.Virlgy，1961，134：548-550.3ang，henJR，TsengY，etal.GlyansninfluenzaheagglutininaffetreeptrbindingandiunerespnseJ.PrNatlAadSiUSA，2022，10643：18137-18142.4LaverG，ebsterRG.PreparatinandiungeniityfapurifiedinfluenzavirushaeagglutininandneurainidasesubunitvaineJ.PstgradedJ，1976，52608：373-378.5VanDaeP，ArnuR，KafejaF，etal.Evaluatinfnn-inferirityfintraderalversusadjuvantedseasnalinfluenzavaineusingtserlgialtehniques：arandisedparativestudyJ.BIn