丹參對(duì)抑制膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎NO誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及滑膜炎癥的研究

1、一、立項(xiàng)依據(jù)（包括國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)、理論與實(shí)踐依據(jù)、研究目的意義等）骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis OA）是一種慢性進(jìn)行性軟骨損傷的骨關(guān)節(jié)病，多發(fā)于老年人。隨著社會(huì)人口老齡化的加劇，該病的發(fā)生越來(lái)越多，嚴(yán)重危害著老年人的健康。由于目前尚未弄清該病的病因及發(fā)病機(jī)理，所以臨床上還缺乏有效的防治該病的藥物及方法。業(yè)已證明，關(guān)節(jié)軟骨的退變是OA的直接原因。自1993年Stefanovic闡述一氧化氮(NO)在關(guān)節(jié)軟骨退變中的作用以來(lái)，NO在OA中的作用倍受關(guān)注，人們?yōu)榇俗髁舜罅康难芯抗ぷ鳌almer等1 和Rediske等2報(bào)告軟骨細(xì)胞是在關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥遞質(zhì)誘導(dǎo)下產(chǎn)生NO的主要細(xì)胞。而

2、Grabowski等3研究證實(shí)人類(lèi)關(guān)節(jié)中的軟骨母細(xì)胞在體外培養(yǎng)中并無(wú)N0產(chǎn)生，只要加入炎性細(xì)胞因子，如IL-l 、TNF-、IFB-等，就會(huì)激活軟骨母細(xì)胞中的iNOS而產(chǎn)生大量NO。iNOS在OA的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前已知一氧化氮合酶（NOS）按表達(dá)方式分為結(jié)構(gòu)型(包括神經(jīng)型和內(nèi)皮型)和誘導(dǎo)型（iNOS）。NOS催化底物精氨酸產(chǎn)生NO4。iNOS在正?；ず蛙浌侵袥](méi)有表達(dá)，但在炎癥刺激下被活化形成大量NO。彭丹等5研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性O(shè)A中NO水平顯著高于正常對(duì)照組，且隨病程延長(zhǎng)，NO水平逐漸升高，6周達(dá)高峰，此時(shí)也出現(xiàn)較多軟骨細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，應(yīng)用一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NAME后，

3、關(guān)節(jié)液中NO含量降低，軟骨細(xì)胞凋亡現(xiàn)象減輕，提示NO是引起實(shí)驗(yàn)性O(shè)A中軟骨細(xì)胞凋亡的介質(zhì)之一。高石軍等6對(duì)OA患者關(guān)節(jié)軟骨、滑膜血清及關(guān)節(jié)液中NO的測(cè)定顯示其明顯升高，且以軟骨及滑膜中的含量最高，提示NO含量升高成為關(guān)節(jié)軟骨退變和滑膜炎癥的病因之一。而在另項(xiàng)研究中7發(fā)現(xiàn)，即使不加入IL-1或脂多糖等刺激物，OA患者軟骨細(xì)胞在體外仍可產(chǎn)生大量的NO，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：NO對(duì)軟骨細(xì)胞功能有許多不利影響，包括抑制膠原和粘多糖的合成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，以及抑制細(xì)胞外基質(zhì)粘集。Francisco等8的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NO在軟骨細(xì)胞凋亡中起重要作用，其他細(xì)胞詞控因子如 IL-l、TNF、LPS、氧自由基等均不能誘導(dǎo)

4、軟骨細(xì)胞凋亡。正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有少量的NO分泌，從而維持細(xì)胞-細(xì)胞間信息傳遞，拮抗氧自由基的氧化損害反應(yīng)9。而骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨組織在諸如滑液內(nèi)低氧分壓液、pH值降低、軟骨缺血、細(xì)胞因子、創(chuàng)傷等多種病例因素刺激下，N0被過(guò)度的表達(dá)和調(diào)控，明顯高于正常人。研究表明，高濃度N0可通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能,抑制軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì),促進(jìn)軟骨細(xì)胞糖酵解,從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)能力降低,軟骨破壞增加,加速軟骨退變10。滑膜中豐富的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等在炎性細(xì)胞因子的刺激下可產(chǎn)生大量的NO11。體外實(shí)驗(yàn)證明12，人類(lèi)滑

5、膜中的纖維母細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)無(wú)NO產(chǎn)生。當(dāng)加入IL-1、 TNF-等細(xì)胞因子后可活化其中的iNOS，產(chǎn)生大量的NO?；ぶ懈吆康腘O可引起滑膜組織的損傷和血管擴(kuò)張，NO在損傷滑膜組織的同時(shí)，也損傷了其中的血管壁，使血管壁的通透性增大而引起滲出，導(dǎo)致滑膜腫脹、充血及關(guān)節(jié)內(nèi)的少細(xì)胞滲出性關(guān)節(jié)積液。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為OA屬痹證范疇，認(rèn)為肝腎虧虛為其內(nèi)因，復(fù)加風(fēng)寒濕邪侵襲及勞損外傷等外因，致使病變局部氣血瘀滯，筋骨失養(yǎng)而發(fā)病，“風(fēng)寒濕三氣雜而為痹”(素問(wèn)痹論)，故主張“祛寒除濕”13。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。14，其性苦，微寒。歸心、肝經(jīng)。祛瘀止

6、痛，活血通經(jīng)，清心除煩。千金方、證治準(zhǔn)繩、普濟(jì)方等醫(yī)書(shū)中均有丹參在方劑中或合用以治療骨性關(guān)節(jié)炎的記載15。研究表明：丹參注射液對(duì)治療骨性關(guān)節(jié)炎有臨床療效16，但沒(méi)有闡明其具體的藥理機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)細(xì)胞分子生物學(xué)的水平研究丹參的作用機(jī)理并進(jìn)一步研究NO在OA中軟骨退變過(guò)程的機(jī)理。此外，本實(shí)驗(yàn)還將研究不同的注射方式對(duì)臨床療效的影響。綜上所述:NO在OA中具有重要的意義，但其在OA中所起的作用尚未完全明白。有研究表明，NO在破壞軟骨的同時(shí)，在某種條件下還具有保護(hù)軟骨的作用。因此，需進(jìn)一步研究NO在OA中軟骨退變過(guò)程的機(jī)理，并為iNOS特異性抑制劑的使用提供理論依據(jù)，為我們臨床治療OA提供一個(gè)更加

7、有效的途徑。主要參考文獻(xiàn):Palmer RMInduction of nitric oxide sythase in human chondrocytesBiochem Biophys Res Commum 1993；193：398RediskeHuman articular chondrocyte induced by proimflamatory mediators as the major articular cell source of nitric oxide. Osteoarthritis Cartilage 1994;2:199Grabowski PS, Macpherson H

8、, Ralston SHNitric Oxide production in cells derived from the human jointBr J Rheumatol 1996；35：207Moncada S, Hirai Y. Endogenous nitric oxide: physiology, pathology and clinical relevance. J Clin Invest 1991;21:361374.彭丹，孫才江，周江南。一氧化氮在實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡中的作用。中華風(fēng)濕病雜志2000；4（4）：232高石軍，陳百成，湯慧華，等。一氧化氮在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)比病

9、機(jī)制中作用。中華骨科雜志1999；19（7）：411Amin AR，Abramson SBThe role of nitric oxide in articular breakdown in osteoarthritisCurr Opin Rheumatol 1998；1O(3)：262Francisco JB，Robert LOHerbert S，et a1 Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide. Am J Pathol 1995；146：75彭丹，孫材江，陳游膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者中一氧化氮的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義現(xiàn)代康復(fù)，2000，4（8

10、）：1 192Tomita M，Sato EF，Nishikawa M，et al Nitric oxide regulates mitochondrial respiration and functions of articular chondrocytes. Arthritis Rheum，2001，41：96田恒力，張鏞。一氧化氮生物作用的研究進(jìn)展。國(guó)外醫(yī)學(xué)神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊(cè)1995；22：87Crabowski PS， Macpherson H，Ralston SHNitric oxide production in cells derived from the human joi

11、ntBr J Rheumatol 1996；35：207楊晉翔，趙世喜，主編疼痛性疾病中醫(yī)現(xiàn)代治療學(xué)北京：學(xué)苑出版社，2001882902中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)主編中華人民共和國(guó)藥典1995220221高學(xué)敏，主編中藥學(xué)北京：人民衛(wèi)生出版社，2000645655華美匯，陳世蓋，顧湘杰等 丹參注射液對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臨床療效的觀(guān)察。中華運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志 2003；22（1）：9091二、研究?jī)?nèi)容（包括研究目標(biāo)、關(guān)鍵技術(shù)和創(chuàng)新之處、應(yīng)用前景、預(yù)期達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)、學(xué)術(shù)水平等）本課題旨在通過(guò)細(xì)胞分子生物學(xué)的水平研究丹參注射液的作用機(jī)理并進(jìn)一步研究NO在OA中軟骨退變過(guò)程的機(jī)理。此外，本實(shí)驗(yàn)還將

12、研究不同的注射方式對(duì)臨床療效的影響。關(guān)鍵技術(shù)在于體外分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，并鑒定其品質(zhì)，對(duì)其數(shù)目、存活率、增殖、凋亡、NO濃度等方面進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，同時(shí)通過(guò)血清藥理學(xué)方法制備丹參含藥血清。動(dòng)物關(guān)節(jié)鏡檢查在本研究中也很重要。本研究創(chuàng)新之處為在細(xì)胞分子水平研究丹參治療骨性關(guān)節(jié)炎的藥理機(jī)制，并研究不同的治療方法對(duì)于療效的影響。國(guó)內(nèi)僅有華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科做過(guò)臨床療效的研究，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)系列藥理實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。應(yīng)用前景：隨著社會(huì)人口老齡化的加劇，OA的發(fā)生越來(lái)越多，嚴(yán)重危害著老年人的健康。本研究將闡明丹參注射液的作用機(jī)理并進(jìn)一步研究NO在OA中軟骨退變過(guò)程的機(jī)理。此外，本實(shí)驗(yàn)還將研究不同的注射方

13、式對(duì)臨床療效的影響，為iN0S特異性抑制劑的使用提供理論依據(jù)，從而為我們臨床治療OA提供一個(gè)更加有效的途徑。該研究將造福廣大OA患者，具有很大的社會(huì)價(jià)值。三、研究方法和技術(shù)路線(xiàn)（包括研究工作總體思路、預(yù)試驗(yàn)結(jié)果、技術(shù)方案、實(shí)驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)處理及現(xiàn)有工作基礎(chǔ)等）本研究分為三個(gè)階段：體外實(shí)驗(yàn)部分1 兔血清制備 分別制備正常兔血清和丹參含藥血清：取正常新西蘭大白兔。每組3只，雄性，體重在2.252.50kg之間。丹參注射液按體表面積折算動(dòng)物的等效劑量，以生理鹽水2 ml肌肉注射，1次/日。連續(xù)3周，在末次注射1小時(shí)后耳緣靜脈采血。放置1小時(shí)，離心(2500 rmin)30分鐘，抽取血清，56 、30分

14、鐘滅活，經(jīng)0.22m濾膜抽濾除菌，分裝，-20保存?zhèn)溆谩? 軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 取4周齡的新西蘭大白兔，無(wú)菌條件下取后肢膝關(guān)節(jié)軟骨，剔除滑膜和骨組織，用PBS溶液清洗2次，然后將軟骨組織機(jī)械分離成約1mm 3大小的組織塊，移入培養(yǎng)瓶，按1：6體積比加入0.1U膠原酶，37 消化7小時(shí)，200目網(wǎng)篩過(guò)濾后，將七清液離心8分鐘(1200 rmin)，然后倒掉上清液，加入PBS溶液清洗2次，最后加入15小牛血清1640培養(yǎng)液，反復(fù)吹打后將軟骨細(xì)胞接種在75 cm2的培養(yǎng)瓶中，置37 、5 coa培養(yǎng)箱中。逐日觀(guān)察，2-3天換1次液，原代細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后傳代，取13代細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)用。傳代細(xì)胞接種在96孔板中

15、，接種密度210個(gè)細(xì)胞孔，正常培養(yǎng)待細(xì)胞貼壁后，分別換用含有正常兔血清(對(duì)照組)和丹參血清(丹參組)的培養(yǎng)液培養(yǎng)，血清濃度分別為5、10、20。48小時(shí)后加入5 mgmL MTT 20L孔，孵育4小時(shí)后，加DMSO 200L孔，15分鐘后在酶標(biāo)儀上測(cè)OD值，波長(zhǎng)為595 nm。3 NO的檢測(cè) ，軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的檢測(cè)。NO在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镹O2-和NO3-，而NO2-進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO3-，利用硝酸還原酶特異性將NO3-還原為NO2-，通過(guò)顯色深淺測(cè)定其濃度高低。將培養(yǎng)細(xì)胞消化、離心、棄上清，下層細(xì)胞加入生理鹽水后破碎，取混懸液500ul測(cè)定。用MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的情

16、況。4 iNOS的檢測(cè) 細(xì)胞裂解后，提蛋白Western Blot檢測(cè)iNOS的表達(dá)，RTPCR法檢測(cè)iNOS基因表達(dá)的量。5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)以zS表示，用SPSS120軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分本研究采用隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。選用兔為研究對(duì)象，數(shù)量為64只，隨機(jī)分為6組，即丹參肌肉注射治療組（12只）；NS肌肉注射組（12只）；丹參關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組（12只）；NS關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組（12只）；骨性關(guān)節(jié)炎陰性對(duì)照組（12只）；正?？瞻讓?duì)照組(4只)。除正?？瞻讓?duì)照組外，先建立骨性關(guān)節(jié)炎的兔膝關(guān)節(jié)動(dòng)物模型，采用文獻(xiàn)報(bào)道的木瓜蛋白酶法建立。2周后所有動(dòng)物進(jìn)行膝

17、關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)鏡檢查，以驗(yàn)證模型建立是否成功。成功后丹參肌肉注射治療組予丹參2 ml，肌肉注射，1次/日；NS肌肉注射組予NS 2 ml，肌肉注射，1次/日；丹參關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療組予丹參2 ml，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，1次/日；NS關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射組予NS 2 ml，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，1次/日；骨性關(guān)節(jié)炎陰性對(duì)照組及正?？瞻讓?duì)照組不采用任何干預(yù)措施。治療后動(dòng)物正常喂養(yǎng)和活動(dòng)。1月、2月、3月分別麻醉動(dòng)物，進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡檢查，并取標(biāo)本（包括關(guān)節(jié)液及滑膜組織）。同時(shí)從兔耳緣靜脈處抽血。硝酸還原法酶法檢測(cè)血清、關(guān)節(jié)液及滑膜中NO的濃度，其中取血清100ul，稀釋510倍后關(guān)節(jié)液100ul檢測(cè)；滑膜與生理鹽水按重量體積比1：9制備成10的組織勻漿液，然后1000轉(zhuǎn)/分離心，取上清檢測(cè)。Western Blot檢測(cè)iNOS的表達(dá)，RTPCR法檢測(cè)iNOS基因表達(dá)的量。部分滑膜組織行病理檢查，觀(guān)察滑膜炎癥情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 12.0軟件對(duì)各組間資料進(jìn)行方差分析。（3）臨床研究部分準(zhǔn)備開(kāi)展60例病例。病例入選標(biāo)準(zhǔn)：MRI檢查證實(shí)有軟骨缺損，并且根據(jù)改良Outerbridge分級(jí)法為、級(jí)的骨性關(guān)節(jié)炎病人。其中,丹參肌肉注射組20人，丹參關(guān)節(jié)腔注射組20人，透明質(zhì)酸鈉關(guān)節(jié)腔注射組20人。術(shù)前均進(jìn)行詳細(xì)的醫(yī)患溝通并簽署知情同意書(shū)。丹參肌肉注射治療組予丹參2 ml，肌肉注射，1次/日；丹參關(guān)節(jié)