植物細(xì)胞工程的筆記-原版

1、緒論1生物技術(shù)：以生物科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物個(gè)體或生物器官，組織，細(xì)胞的特性和功能，設(shè)計(jì)和構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品系，以及與工程原理相結(jié)合進(jìn)行產(chǎn)品加工生產(chǎn)的綜合體系。內(nèi)涵：運(yùn)用生物學(xué)理論與科學(xué)技術(shù)改造細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。2細(xì)胞工程：是以細(xì)胞學(xué)，遺傳學(xué)，發(fā)育學(xué)及分子生物學(xué)等理論為基礎(chǔ)，借助工程學(xué)的試驗(yàn)方法或技術(shù)，在細(xì)胞水平上研究和改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，以獲得特定的細(xì)胞，細(xì)胞產(chǎn)品或新生物體的有關(guān)理論和技術(shù)方法的科學(xué)。3植物細(xì)胞工程：以植物組織和細(xì)胞為基本單位，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)，繁殖，或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種或創(chuàng)造新物種，或加速繁殖植物個(gè)

2、體，以獲得有用無(wú)知的過(guò)程。4細(xì)胞全能性：高等植物的組織和器官可以不斷分割，直到單個(gè)細(xì)胞，如果每個(gè)細(xì)胞都有植物個(gè)體一樣的性質(zhì)和能力，那么可以通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)使單個(gè)細(xì)胞發(fā)育成為一個(gè)新個(gè)體。（一個(gè)生活細(xì)胞所具有完整生物個(gè)體的潛在能力）5植物細(xì)胞的工程類(lèi)別培養(yǎng)層次：植株培養(yǎng)。器官培養(yǎng)，胚胎培養(yǎng)，愈傷組織，細(xì)胞培養(yǎng)，原生質(zhì)體培養(yǎng)（原生質(zhì)體：植物細(xì)胞脫除細(xì)胞壁后的完整細(xì)胞培養(yǎng)。）6應(yīng)用：在植物育種上(1快速獲得特殊倍性材料，2克服遠(yuǎn)緣雜交不親和，3克服雜交種胚早期夭折，4導(dǎo)入外源基因，5突變體篩選，6種質(zhì)資源保存），種苗脫毒和快速繁殖，細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞學(xué)說(shuō)和發(fā)育生物學(xué)研究中，在植物遺

3、傳，生理生化以及病理等基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用7 植物組織培養(yǎng) 動(dòng)物組織培養(yǎng) 細(xì)胞全能性 細(xì)胞增殖 固體培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基 蔗糖，植物激素 葡萄糖，動(dòng)物血清 植物體 細(xì)胞株，細(xì)胞系 快速繁殖，培育無(wú)毒植株 獲得細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物第一章1生活細(xì)胞的全能性必須首先回復(fù)到分生狀態(tài)或胚性細(xì)胞狀態(tài)，（條件：離體，適當(dāng)?shù)拇碳ぃ?植物細(xì)胞分類(lèi)：第一類(lèi)，莖尖，根尖，及形成層細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞始終保存分裂能力，從一個(gè)周期到另一個(gè)周期，稱(chēng)為周期細(xì)胞，第二類(lèi)，篩管，導(dǎo)管和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞等特化細(xì)胞，為永久失去分裂能力的細(xì)胞，為終端分化細(xì)胞，第三類(lèi)，表皮細(xì)胞及各種薄壁細(xì)胞，在通常情況下不分裂，但受到外界刺激后從新啟動(dòng)分裂，為G0細(xì)胞。高

4、度分化的細(xì)胞表現(xiàn)細(xì)胞全能性的能力降低或喪失，2細(xì)胞的脫分化：培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無(wú)分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過(guò)程。（靜止細(xì)胞啟動(dòng)分裂都是分化細(xì)胞成功脫分化的重要標(biāo)志，靜止細(xì)胞：停止分裂，執(zhí)行特定的代謝功能）3脫分化過(guò)程的生理活動(dòng)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化：細(xì)胞質(zhì)顯著變濃，大液泡消失，核體積增加并逐漸移位至細(xì)胞中央，細(xì)胞器增加，液泡蛋白體的出現(xiàn)和質(zhì)體轉(zhuǎn)變?yōu)樵|(zhì)體被認(rèn)為是細(xì)胞脫分化的重要標(biāo)志。變化最明顯的葉綠體4脫分化的過(guò)程：（1）啟動(dòng)階段，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)增生，并開(kāi)始向細(xì)胞中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)，（2）演變階段，此時(shí)細(xì)胞核開(kāi)始向中央移動(dòng)，質(zhì)體演變成原生質(zhì)體，（3）脫分化終結(jié)期，細(xì)胞回

5、復(fù)到分生細(xì)胞的階段，細(xì)胞分裂即將開(kāi)始。5植物激素是離體培養(yǎng)中所必須的條件，因此與激素相關(guān)的基因表達(dá)被認(rèn)為是啟動(dòng)細(xì)胞脫分化的關(guān)鍵。6細(xì)胞分化：導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在的發(fā)育過(guò)程，（一個(gè)細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)和機(jī)能，這是在時(shí)間上的分化，同一種細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)和機(jī)能，是空間上的分化）本質(zhì)是基因表達(dá)和調(diào)控的結(jié)果7再分化，在離體的條件下，當(dāng)細(xì)胞脫分化以后無(wú)序生長(zhǎng)的細(xì)胞及愈傷組織要重新進(jìn)入有序生長(zhǎng)才能成為新個(gè)體?；蜻x擇性表達(dá)與修飾的人工調(diào)控過(guò)程。8極性：植物的器官，組織甚至單個(gè)細(xì)胞在不同軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化上的梯度差異，無(wú)論低等

6、植物或高等植物都存在。細(xì)胞的不均等分裂時(shí)細(xì)胞極性建立的標(biāo)志。極性建立與質(zhì)膜離子通道的不對(duì)稱(chēng)分布和細(xì)胞周質(zhì)微管的重排有關(guān)。9管狀分子（TE）由愈傷組織薄壁細(xì)胞分化形成，是愈傷組織細(xì)胞分化器官的前提，離體培養(yǎng)中TE的出現(xiàn)時(shí)組織分化的標(biāo)志，分為三個(gè)階段，葉肉細(xì)胞的脫分化，脫分化葉肉細(xì)胞向TE細(xì)胞轉(zhuǎn)換，TE細(xì)胞特化階段10激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)調(diào)控過(guò)程。11在離體培養(yǎng)條件下，植物細(xì)胞經(jīng)過(guò)再分化形成完整的個(gè)體通過(guò)兩天途徑：器官發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生第二節(jié)1器官發(fā)生：在培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織)分化形成不定根或不定芽等器官的過(guò)程。離體培養(yǎng)下器官發(fā)生的難易，往往取決于研究對(duì)象的培養(yǎng)

7、技術(shù)成熟程度及其調(diào)控機(jī)制基礎(chǔ)研究的深度。2離體培養(yǎng)中器官發(fā)生的方式:1先形成芽，后在芽上形成根，2先形成根，后在根上形成芽，3在愈傷組織的不同部位形成芽和根再通過(guò)維管束組織的聯(lián)系形成完整的植株4經(jīng)過(guò)愈傷組織再分化器官的過(guò)程：1外植體經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)形成愈傷組織，2形成生長(zhǎng)中心，也即愈傷組織形成器官的部位，3器官原基及器官形成不經(jīng)過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生：1外植體已經(jīng)存在器官原基，2外植體某些部位的細(xì)胞重新分裂后形成分生細(xì)胞團(tuán)，再由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基5起始材料對(duì)器官分化的影響：母體植物的遺傳物質(zhì)（器官分化能力的差異大于愈傷組織誘導(dǎo)的差異），外植體類(lèi)型及生理狀態(tài)（外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，有

8、時(shí)甚至影響分化程度和器官類(lèi)型。6離體培養(yǎng)下器官分化，在大多數(shù)情況下時(shí)通過(guò)外源提供適宜的植物激素實(shí)現(xiàn)的，生長(zhǎng)素與與細(xì)胞分裂素占主導(dǎo)地位。7光照時(shí)間，強(qiáng)度及光質(zhì)對(duì)器官分化均有影響：1 合子胚 體細(xì)胞胚 萌芽率高，質(zhì)量好 萌芽率低，質(zhì)量差受精卵 體細(xì)胞胚柄，明顯 即使有也不明顯形態(tài)固定，體積較小 形態(tài)復(fù)雜，體積較大變異率低 變異率高2體細(xì)胞的界定：其一：體細(xì)胞胚是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限與離體培養(yǎng)范圍內(nèi)使用，以區(qū)別無(wú)融合生殖胚，其二，體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，以區(qū)別合子胚，其三，體細(xì)胞經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程，以區(qū)別與離體培中器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑3體細(xì)胞的形成外植體直接發(fā)生，經(jīng)過(guò)愈傷組織的體細(xì)胞胚發(fā)生，細(xì)胞

9、懸浮液培養(yǎng)的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，4與器官發(fā)生形成個(gè)體的途徑相比，體細(xì)胞胚發(fā)育再生植株的特點(diǎn):體細(xì)胞具有雙極性，體細(xì)胞胚形成后與母體的維管束系統(tǒng)聯(lián)系較少，即出現(xiàn)生殖隔離現(xiàn)象5影響體細(xì)胞胚發(fā)生的因素：（1）外緣激素（生長(zhǎng)素對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生有重要的調(diào)控，細(xì)胞分裂素對(duì)維持在促進(jìn)細(xì)胞分裂和維持細(xì)胞活躍生長(zhǎng)中有重要作用）（2）培養(yǎng)基：（3）不同基因型間體細(xì)胞胚形成能力的差異，（4）外植體類(lèi)型，采用幼胚，成熟胚，上胚軸和子葉為外植體，較容易產(chǎn)生胚性愈傷組織，而采用葉片，莖段等能形成體細(xì)胞胚6體細(xì)胞胚胎發(fā)生的生化與分子基礎(chǔ)：內(nèi)源激素的變化，特異蛋白質(zhì)，基因表達(dá)調(diào)控第二章1體細(xì)胞無(wú)性系:任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株

10、，而這些植株所表現(xiàn)的變異稱(chēng)為體細(xì)胞無(wú)性系2離體培養(yǎng)下的穩(wěn)定性，離體無(wú)性繁殖可以具有較高的遺傳穩(wěn)定性，即使發(fā)生變異也可淘汰變異，也可以通過(guò)離體培養(yǎng)選擇保留并穩(wěn)定下來(lái)3離體培養(yǎng)下的遺傳變異的特點(diǎn)普遍性，局限性，嵌合性4影響體細(xì)胞遺傳與變異的因素供體植物(二倍體比單倍體的穩(wěn)定)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式，繼代培養(yǎng)的次數(shù)（時(shí)間越久次數(shù)越多，則變異頻率越高，5體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)：DNA核內(nèi)重復(fù)負(fù)責(zé)，染色體斷裂與重組，非正常的有絲分裂6體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)：堿基突變，DNA序列的選擇性擴(kuò)增與丟失，轉(zhuǎn)座子的活化，DNA甲基化7離體培養(yǎng)誘導(dǎo)篩選體細(xì)胞無(wú)性系變異的優(yōu)點(diǎn)，（1）由于篩選可以在離體培養(yǎng)下，從而

11、可以在曉空間內(nèi)對(duì)大量個(gè)體進(jìn)行選擇，（2）細(xì)胞突變體的篩選可以在幾個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)部完成，且不受季節(jié)限制，因此篩選效率高，（3）誘變和篩選的條件可控制，從而提高重復(fù)性，（4）由于變異是在單細(xì)胞水平上進(jìn)行的，因此一個(gè)突變體就是來(lái)自一個(gè)細(xì)胞，不會(huì)有非突變體細(xì)胞的干擾，避免整體植株水平上無(wú)性變異常呈現(xiàn)嵌合體，因而可以省去變異分離的麻煩，（5）理化誘變劑可較均勻地接觸細(xì)胞，有較高的頻率發(fā)生突變，增加選擇的機(jī)會(huì)8（1）體細(xì)胞變異誘導(dǎo)材料的選擇：注意的問(wèn)題，目標(biāo)性狀的可行性，必須充分考慮實(shí)驗(yàn)植物的細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)水平，適當(dāng)?shù)募?xì)胞類(lèi)型培養(yǎng)細(xì)胞的自發(fā)變異（3）培養(yǎng)細(xì)胞的誘變（物理誘變，化學(xué)誘變，復(fù)合因子誘變，轉(zhuǎn)座子插

12、入誘變，）（4）體細(xì)胞突變體的篩選（直接篩選法和間接篩選法）9體細(xì)胞無(wú)性系變異的利用：創(chuàng)造育種中間材料或直接篩選新品種，基因克隆及功能鑒定，發(fā)育生物學(xué)研究，生化代謝途徑研究植物細(xì)胞工程技術(shù)原理1實(shí)驗(yàn)室：3個(gè)基本需要（實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，無(wú)菌操作和控制培養(yǎng)）2洗滌：鉻酸洗滌液是強(qiáng)氧化劑，去污能力很強(qiáng)，特別是在加熱后去污效果更好，一般可在，40到45攝氏度使用，但鉻酸洗滌液同時(shí)具有較強(qiáng)的腐蝕性，使用時(shí)要小心謹(jǐn)慎，以免發(fā)生意外，僅用于玻璃實(shí)驗(yàn)器皿，可反復(fù)使用，直至溶液呈青褐色為止。洗滌方法，1玻璃器皿：新的玻璃器皿上附有游離的堿性物質(zhì)，其洗滌方法是用1%HCl溶液浸泡一晝夜，再用合成洗滌劑洗刷，然后用清水反復(fù)

13、沖洗，最后用蒸餾水沖洗1到兩次，干燥后即可使用。已經(jīng)使用過(guò)的試管，燒杯，三角瓶，將器皿中的殘留除去，用清水洗凈，再用合成洗滌劑洗刷，用清水洗干凈后，最后用蒸餾水沖洗1到2次，內(nèi)徑狹小的玻璃制品，先放入鉻酸洗滌液中浸泡2h以上，經(jīng)流水沖洗半個(gè)小時(shí)，再用蒸餾水沖洗1到二次，然后烘干，或晾干，載玻片或蓋玻片，先用清水沖洗，然后放入鉻酸洗滌液中浸泡幾個(gè)小時(shí)，或者是用鉻酸洗滌液煮沸半個(gè)小時(shí)，取出后用清水沖洗干凈，將其貯藏在95%的酒精中，2塑料品洗滌：用合成洗滌劑，沖洗必須反復(fù)多次，最后用蒸餾水沖洗3金屬用品，用酒精擦拭，不要洗滌劑，并保持干燥3滅菌技術(shù)：滅菌是指殺滅培養(yǎng)物，培養(yǎng)基，培養(yǎng)用具及培養(yǎng)環(huán)境的

14、雜菌，是防止微生物污染的最重要最基本的環(huán)節(jié)，物理方法，利用高溫，射線(xiàn)等殺死微生物或通過(guò)過(guò)濾，離心沉淀等去除微生物，化學(xué)方法，使用消毒劑抗生素殺滅微生物高壓蒸汽滅菌：蒸餾水，各種器械，棉塞，1滅菌鍋可裝滿(mǎn)，2鍋內(nèi)的冷空氣排盡，3嚴(yán)格遵守保持壓力的時(shí)間，20min 121攝氏度過(guò)濾滅菌：用于易于分解而失效的某些化合物質(zhì)，液體培養(yǎng)基和化學(xué)試劑濕熱和干熱滅菌，濕熱，玻璃，培養(yǎng)基，干熱，玻璃器皿，金屬，160攝氏度到180攝氏度，恒溫40min，或120攝氏度滅菌2小時(shí) （4）熏蒸，熏蒸劑常用甲醛加高錳酸鉀，乙二醇，主要用于接種室和培養(yǎng)室滅菌，（5）藥劑滅菌：70%到75%酒精，0.1%到0.2%氧化汞

15、，10%的次氯酸鈉，主要用于培養(yǎng)材料的表面滅菌，（外植體）培養(yǎng)材料的滅菌原則，（重要）既要達(dá)到滅菌的目的，又不傷害組織和細(xì)胞灼燒滅菌，外焰，接種器械，瓶口，棉塞，包扎紙，瓶蓋 （7）紫外線(xiàn)照射，接種室空氣和臺(tái)面，花粉，15到20min4培養(yǎng)基：植物細(xì)胞，組織器官吸取各種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)所的地方，包括水分和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基的配方是決定培養(yǎng)物能否正常生長(zhǎng)或者能否達(dá)到培養(yǎng)目的的首要前提。成分：無(wú)機(jī)鹽，有機(jī)化合物，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（基本培養(yǎng)基部含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）（1）無(wú)機(jī)鹽，大量元素（C，H,O，N，P，K，Na，Ca，Mg，S）每升幾十至幾千毫克， 微量元素（鐵，通，鋅，硼，錳，鈷）10的-5次到-7次（2）有機(jī)

16、化合物：基本培養(yǎng)基質(zhì)只含有無(wú)機(jī)鹽類(lèi)作為碳源利用蔗糖，葡萄糖，果糖，做為氮源利用氨基酸類(lèi)和酰胺類(lèi)糖類(lèi)：既可以做碳源，又可以維持培養(yǎng)基的滲透壓，微生物：直接參與生物催化劑（酶），還參與植物蛋白質(zhì)，脂肪的代謝等重要的生命活動(dòng)肌醇，腺嘌呤，氨基酸，其他復(fù)合成分，（3）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)：生長(zhǎng)素，促進(jìn)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，有利于外植體的脫分化并啟動(dòng)細(xì)胞分裂，有利于形成愈傷組織，吲哚乙酸（IAA），萘乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4D），吲哚乙酸（IBA），細(xì)胞分裂素：促進(jìn)細(xì)胞分裂，調(diào)節(jié)器官分化，延遲組織衰老，增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成，赤霉素（GA） 水 （5）其他附加成分，瓊脂和活性炭培養(yǎng)基種類(lèi)：富鹽培養(yǎng)基，高硝態(tài)氮培養(yǎng)

17、基，中鹽培養(yǎng)基，低鹽培養(yǎng)基，如果將某一物質(zhì)的量濃度高的溶液稀釋到低濃度時(shí)，m1*V1=m2*V25外植體取材及培養(yǎng)條件的控制，外植體：指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織，器官等材料，它是植物離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)材料。來(lái)源：1生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物，2有目的地培養(yǎng)在溫室控制環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物，2無(wú)菌條件下已經(jīng)離體培養(yǎng)的植物原則1盡量使用溫室或人工氣候室控制培養(yǎng)的植物材料作為外植體來(lái)源，以減少培養(yǎng)過(guò)程中微生物感染，2必須取自自然生長(zhǎng)的植物，可以盡可能避免使用那些生長(zhǎng)過(guò)于潮濕和不潔環(huán)境中的植物，3對(duì)于在培養(yǎng)過(guò)程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染材料，應(yīng)盡量取生長(zhǎng)旺盛的生長(zhǎng)點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的外植體。取材大小，0.5到1cm

18、,過(guò)大則污染，胚胎培養(yǎng)或脫青，0.5cm以下，過(guò)小，不易活供體植物的管理：避免昆蟲(chóng)為害，注意防病，控制濕度外植體滅菌：次氯酸鹽一般用于一些教幼嫩的組織消毒，消毒時(shí)間5到30min， 氯化汞滅菌效果，一般用于種子，塊根，塊莖，及較硬的組織滅菌，但是殘留液最難去除，消毒劑和處理時(shí)間及方法會(huì)影響到滅菌效果和外植體的活力。種子滅菌，芽，葉片，和莖等組織材料滅菌，未成熟胚，子房，及花藥滅菌，70%的酒精清洗，吐溫是潤(rùn)濕劑接種條件的控制：1光照（強(qiáng)度，時(shí)間，光質(zhì)），2溫度20到30，（適宜的溫度科提高細(xì)胞分裂速率，適當(dāng)提高溫度，有利于細(xì)胞伸長(zhǎng)，在一定范圍內(nèi)降低，則會(huì)，是分裂和生長(zhǎng)速度減慢，代謝減慢，有機(jī)物

19、積累，細(xì)胞質(zhì)量增大），3濕度，（培養(yǎng)容器，100%, 環(huán)境70到80%）4培養(yǎng)基的PH，5.5到6.5，引起培養(yǎng)基PH變化的原因，高溫滅菌，培養(yǎng)物本身代謝產(chǎn)物釋放，5滲透壓 6氣體調(diào)節(jié) ，增加可利用的氧，除去有害氣體，培養(yǎng)皿的封閉性主要與封口方式和材料有關(guān)，振蕩培養(yǎng)時(shí)常用的改善通氣條件的培養(yǎng)方式：植物組織和器官培養(yǎng)1植物脫毒和快速繁殖的意義：能夠有效保持優(yōu)良品種特性；生產(chǎn)無(wú)病毒種苗，防止品種退化；快速繁殖新品種，加速優(yōu)良品種推廣，節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品商品產(chǎn)出率；便于運(yùn)輸。2病毒在植物體內(nèi)分布不均的機(jī)理：能量競(jìng)爭(zhēng)，傳導(dǎo)抑制，激素抑制，酶缺乏，抑制因子，3植物脫毒的技術(shù)規(guī)程：（1）被脫毒植物攜帶病

20、毒的診斷，指示植物，血清學(xué)，分子生物學(xué)，母體材料的選擇和預(yù)處理，欲求脫毒材料的品種典型性，對(duì)外植體的健康程度進(jìn)行選擇，（3）莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株，外植體消毒，莖尖剝離，莖尖培養(yǎng)。(4)脫毒檢測(cè)，指示植物鑒定，血清鑒定，分子生物學(xué)鑒定，（5）脫毒苗的保存與繁殖，脫毒苗的離體保存與繁殖，建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡(luò)體系，木本植物建立隔離的脫毒苗母本園4影響脫毒效果的因素，母體材料病毒侵染的程度，起始培養(yǎng)材料的莖尖大小（莖尖越小，脫毒率越高），外植體的生理狀態(tài)（頂芽脫毒效果比側(cè)芽好，生長(zhǎng)旺盛季節(jié)的芽為外植體脫毒比休眠芽或快速進(jìn)入休眠芽的效果好5離體繁殖： 外植體選擇考慮的三個(gè)的問(wèn)題：植物在自然條件下

21、的繁殖特點(diǎn)，離體條件下莖芽的增殖方式，外植體的取材部分，大小和生理狀態(tài) 培養(yǎng)物的增殖：（1）芽增殖，特點(diǎn)，主要表現(xiàn)在培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，能長(zhǎng)期繼代繁殖，不需要添加外緣激素，如果某些植物需要使用激素，一定要嚴(yán)格控制濃度，以防止產(chǎn)生愈傷組織。不定芽增殖，從現(xiàn)存的芽以外的任何器官和組織上通過(guò)器官重新形成的芽稱(chēng)為不定芽特點(diǎn)，繁殖系數(shù)高，有較好的遺傳穩(wěn)定性體細(xì)胞胚增殖：特點(diǎn)：增長(zhǎng)率高，胚的雙極性免去了生根環(huán)節(jié)，但在同一培養(yǎng)體系中的體細(xì)胞休眠的誘導(dǎo)和解除難以控制而影響大規(guī)模繁殖的規(guī)范性，因此這個(gè)需要建立一個(gè)相對(duì)一致的體胚發(fā)育體系愈傷組織增殖，特點(diǎn)，成功率高，繁殖系數(shù)大，但是遺傳穩(wěn)定性較差，

22、生根培養(yǎng)：降低礦物營(yíng)養(yǎng)的濃度，提高生長(zhǎng)素濃度，具體應(yīng)依據(jù)植物種類(lèi)而定生產(chǎn)用苗的培植6離體繁殖的使用范圍：某些難以繁殖或繁殖系數(shù)低的植物，或某些需要加速繁殖的特殊基因型; 自然無(wú)性繁殖極易感染病毒的植物 ；有性繁殖變異范圍過(guò)大而自然條件下又不易無(wú)性繁殖的。7離體繁殖的遺傳變異與控制，外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)品種典型性的影響，繼代次數(shù)和變異，增殖方式的合理選擇8花藥是器官培養(yǎng)，花粉是細(xì)胞培養(yǎng)9單倍體，具有配子體染色體數(shù)的孢子體。單倍體植物的明顯特點(diǎn)：體細(xì)胞染色體數(shù)減半，生長(zhǎng)發(fā)育弱，體形小，各種器官明顯減小，雌雄配子嚴(yán)重?cái)∮械纳踔敛荒苓M(jìn)入有性世代10花藥培養(yǎng)：外植體的選擇，供試材料的遺傳背景（最多的茄科

23、植物），材料的生育狀態(tài)（幼年植株比老齡植株花藥誘導(dǎo)率高），花粉的發(fā)育時(shí)期（單核中晚期到雙核早期）材料的表面消毒：未開(kāi)放的花蕾取花藥用70%乙醇擦拭表面，飽和漂白粉，0.1%HgCl無(wú)菌水沖洗，)接種：平板培養(yǎng)基，MS應(yīng)用最普遍，培養(yǎng)：光照（先弱后強(qiáng)），溫度，植物再生，生根和移栽11花粉的培養(yǎng)花粉和小孢子培養(yǎng)取材適宜期大多數(shù)為花粉發(fā)育處于四分體到單核早期花粉的分離：機(jī)械分離法，花粉漂浮培養(yǎng)自然釋放法，磁力攪拌法花粉培養(yǎng)法：直接培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)，哺育培養(yǎng)，看護(hù)培養(yǎng)，溫室培養(yǎng)，雙層培養(yǎng)影響花粉和花藥培養(yǎng)的因素：供體植物的基因型，生理狀態(tài)（大田比溫室的更適宜），花粉發(fā)育時(shí)期預(yù)處理：?jiǎn)?dòng)分裂，冷處理，熱處理

24、，化學(xué)處理，其他方法低溫預(yù)處理的作用：1預(yù)處理引起花藥，花粉內(nèi)激素變化，改變了小孢子（花粉粒），第一次有絲分裂的軸向（正常發(fā)育時(shí)，兩次有絲分裂形成三核花粉粒）進(jìn)而形成愈傷組織2提供小孢子的生活力，延緩?fù)嘶俣?，而提高誘導(dǎo)率3引起小孢子孤立化，即小孢子從花粉中分離，因?yàn)榈蜏靥幚磉^(guò)程中，花藥，內(nèi)薄壁細(xì)胞和絨氈層逐漸退化，從而切斷與小孢子之間的聯(lián)系4刺激花粉產(chǎn)生原胚5促使細(xì)胞同步分裂培養(yǎng)基的成分，無(wú)機(jī)鹽，碳源，激素，有機(jī)附加物，活性炭：作用，吸附瓊脂中不利于花粉細(xì)胞生長(zhǎng)的某些雜質(zhì)，同時(shí)也可以吸附各種植物激素，從而調(diào)節(jié)內(nèi)源和外源生長(zhǎng)物質(zhì)的水平花藥壁因子，可能具有促進(jìn)作用溫度和光照12花藥和花粉培養(yǎng)中單

25、倍體植株形成途徑單倍體細(xì)胞發(fā)育的方式：（1）單核小孢子起始培養(yǎng)的可能發(fā)育方式，一部分很快脫分化進(jìn)行均等分裂進(jìn)而形成小細(xì)胞團(tuán)進(jìn)入孢子體發(fā)育形成植株，另一部分繼續(xù)體內(nèi)的發(fā)育方式，在細(xì)胞內(nèi)形成大液泡，進(jìn)入晚期單核小孢子。（2）二細(xì)胞花粉起始培養(yǎng)的可能發(fā)育方式，小的生殖細(xì)胞停止發(fā)育，大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入發(fā)育，然而形成孢子體；營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞停止分裂，生殖細(xì)胞進(jìn)入孢子體發(fā)育；營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞可能融合，由融合細(xì)胞繼續(xù)分裂形成再生植株，稱(chēng)為二倍體花粉植株植株的再生途徑：通過(guò)胚胎發(fā)育途徑形成單倍體植株。通過(guò)愈傷組織形成單倍體植株13花粉植株的倍性及染色體加倍花粉植株的倍性：?jiǎn)伪扼w，二倍體，多倍體，非整倍體染色體加倍：自

26、然加倍，人工加倍（秋水仙素：組織細(xì)胞有絲分裂時(shí)紡錘絲的形成層）。愈傷組織加倍法（愈傷組織經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)后得到二倍體）14胚培養(yǎng)的意義和類(lèi)型：意義：1克服雜交育種中雜種胚的早期夭折2克服珠心胚干擾，提高育種效率3理論領(lǐng)域的應(yīng)用類(lèi)型：成熟胚培養(yǎng)，幼胚培養(yǎng) 幼胚培養(yǎng)：1取材：多為球形胚和魚(yú)雷形胚 2幼胚剝離，容易失水，注意保濕，且操作迅速，盡量帶柄 3接種培養(yǎng)，幼胚生長(zhǎng)方式：胚性發(fā)育，早熟萌發(fā)，愈傷組織培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基：蔗糖3%10%，而心形胚和魚(yú)雷胚只要去4%6%。（異性期和自養(yǎng)期），光照和溫度。15子房培養(yǎng)：包括授粉前和授粉后的培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基，植物激素的影響，蔗糖濃度單倍體來(lái)源和發(fā)育途徑：助細(xì)

27、胞或胚囊的無(wú)配子生殖產(chǎn)生單倍體；卵細(xì)胞，助細(xì)胞，反足細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生單倍體；非正常發(fā)育的大孢子四分體產(chǎn)生單倍體16被子植物胚乳培養(yǎng)發(fā)育特性：核型胚乳（經(jīng)過(guò)游離階段），細(xì)胞型胚乳（沒(méi)有經(jīng)過(guò)游離階段），沼生目型胚乳倍性特點(diǎn)：嵌合體的普遍性，倍性不穩(wěn)定，倍性多倍化植物細(xì)胞培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)1植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在離體條件下對(duì)植物單個(gè)細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖的技術(shù)。培養(yǎng)規(guī)模（小規(guī)模培養(yǎng)和大批量培養(yǎng)），培養(yǎng)方式（懸浮培養(yǎng)，平板培養(yǎng)，看護(hù)培養(yǎng)），要求產(chǎn)物的不同（誘變細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)次生產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng)）2懸浮培養(yǎng)；單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。多采用葉肉細(xì)胞和根尖細(xì)胞作為細(xì)胞來(lái)源

28、，細(xì)胞分離方法是機(jī)械分離和酶分離愈傷組織誘導(dǎo)：適宜的植物外植體材料：幼胚，胚軸，子葉 適宜的培養(yǎng)基，較高濃度激素濃度，必要的附加成分 愈傷組織的要求：松散性好，增殖快，再生能力強(qiáng)懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)體系的三個(gè)條件：1懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30個(gè)到50個(gè)一下，2均一性，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或黃色，3細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般為2到3天甚至更短的時(shí)間便可增加一倍懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期分選法：通過(guò)細(xì)胞體積大小分級(jí)，直接將處于相同周

29、期的細(xì)胞進(jìn)行分選然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)與同一培養(yǎng)體系中，優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單，分選的細(xì)胞處于自然生長(zhǎng)狀態(tài)，常規(guī)方法是梯度離心法饑餓法，在一個(gè)培養(yǎng)體系中，如果細(xì)胞生長(zhǎng)的基本成分散失，則導(dǎo)致細(xì)胞因饑餓而分裂受阻，從而停留在某一分裂時(shí)期，當(dāng)細(xì)胞處于氮饑餓其，通常獲得G1期的同步化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于磷和碳饑餓時(shí)，則可以獲得G1和G2期的同步化細(xì)胞抑制劑法：通過(guò)一些DNA合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞滯留在DNA合成前期，當(dāng)解除抑制后，就可獲得處于同一時(shí)期G1期的同步化細(xì)胞低溫處理法：3單細(xì)胞培養(yǎng)：（1）平板培養(yǎng)，指一定密度的懸浮液細(xì)胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)技術(shù)要點(diǎn)：植板，單細(xì)胞分離，單細(xì)胞懸

30、浮液制備平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來(lái)衡量，是能長(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比列看護(hù)培養(yǎng)：生長(zhǎng)速度快，提供培養(yǎng)基所不能提供的營(yíng)養(yǎng)成分，在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織，再在愈傷組織上放一小片濾紙，待濾紙濕潤(rùn)后將細(xì)胞接種與濾紙上，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)出微小細(xì)胞團(tuán)以后，將其轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基讓其迅速生長(zhǎng)。微室培養(yǎng)：進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀察而建立的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)單細(xì)胞分化，細(xì)胞分裂的全過(guò)程，胞質(zhì)環(huán)流的規(guī)律其他單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：雙層濾紙植板培養(yǎng)示意圖4植物細(xì)胞的規(guī)模培養(yǎng)：滿(mǎn)足的條件：培養(yǎng)的細(xì)胞在遺傳上是穩(wěn)定的，以得到恒定的產(chǎn)物；細(xì)胞生長(zhǎng)基生物合成的速度快，在較短時(shí)間內(nèi)得到較高的產(chǎn)量的終產(chǎn)物；代謝產(chǎn)

31、物在細(xì)胞中積累而不迅速分解，最好將其釋放到培養(yǎng)基中，植物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)體系的建立：1種子細(xì)胞的選擇與保存，（天然器官和外植體）2種子細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng)，（獲得活躍的細(xì)胞生長(zhǎng)群體）3大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立（成批培養(yǎng)：在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞和添加培養(yǎng)基后，中途不再添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。連續(xù)培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)）生物反應(yīng)器的類(lèi)型和特點(diǎn)：1攪拌式生物反應(yīng)器：混合程度高，適應(yīng)性廣，反應(yīng)器內(nèi)溫度，PH，溶氧以及營(yíng)養(yǎng)液濃度容易控制。2氣動(dòng)式生物反應(yīng)器：剪切力小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，避免污染3固定化細(xì)胞反應(yīng)器：較容易的控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而研究特定的代謝途徑，有利于次生代謝產(chǎn)物的合成，節(jié)省時(shí)間和費(fèi)用，能

32、進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)4光照生物反應(yīng)器：5轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器，懸浮系統(tǒng)均一，低剪切環(huán)境，供氧效率高，防止細(xì)胞粘壁，6其他類(lèi)型的生物反應(yīng)器4植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)中的有關(guān)工程技術(shù)問(wèn)題：培養(yǎng)中植物細(xì)胞的特性：體積大，以細(xì)胞團(tuán)方式存在，抗剪切能力弱，生長(zhǎng)速度慢培養(yǎng)液的流變特性：培養(yǎng)液的黏度是有細(xì)胞本身和細(xì)胞分泌物引起，培養(yǎng)液黏度依賴(lài)于細(xì)胞年齡，形態(tài)，細(xì)胞團(tuán)大小泡沫和表面黏附性：化學(xué)和機(jī)械消泡。化學(xué)消泡劑的條件：1具有較低的表面張力和一定的親水性，以使消泡劑對(duì)氣/液界面的分散系數(shù)足夠大，消泡作用迅速2化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在水中溶解度小，不與次生代謝產(chǎn)物起任何化學(xué)反應(yīng)對(duì)植物細(xì)胞無(wú)毒害，3不影響氣體在營(yíng)養(yǎng)液中的傳遞和溶解4來(lái)源

33、方便，價(jià)格便宜，包括，天然油脂類(lèi)，高級(jí)醇類(lèi)，聚醚類(lèi)，和硅酮類(lèi)5植物次生代謝產(chǎn)物的主要類(lèi)型：1酚類(lèi)化合物：黃酮類(lèi)，醌類(lèi)，簡(jiǎn)單酚類(lèi)。，2萜類(lèi)化合物，單，倍半，二倍半，三萜，及3含氮化合物，生物堿，胺類(lèi)，非蛋白質(zhì)氨基酸和生氰苷4其他，多炔類(lèi)，和有機(jī)酸類(lèi)5根據(jù)植物細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成關(guān)系：次生代謝產(chǎn)物的類(lèi)型1生長(zhǎng)偶聯(lián)型，即產(chǎn)物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)呈正比例關(guān)系 2中間型：產(chǎn)物僅在細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始下降時(shí)才能合成，細(xì)胞對(duì)于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)物不合成，當(dāng)細(xì)胞停止生長(zhǎng)時(shí)，產(chǎn)物也停止合成，3非生長(zhǎng)偶聯(lián)型，產(chǎn)物只在細(xì)胞生長(zhǎng)停止后才能合成6提高細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑：1選擇適宜的起始材料，2培養(yǎng)基成分（既要滿(mǎn)足細(xì)胞生物量的增長(zhǎng)，又

34、要使細(xì)胞能合成和積累次生產(chǎn)物，增加N，P，K濃度能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，增加糖濃度有利于次生代謝產(chǎn)物合成3前體的利用4激發(fā)子的利用：激發(fā)子又叫誘導(dǎo)子，指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中的一個(gè)反應(yīng)，并形成自身防御的分子，生物，非生物，外源性激發(fā)因子。與激發(fā)子的種類(lèi)和濃度有關(guān)。5抑制劑的使用6培養(yǎng)技術(shù)的選擇，原生質(zhì)體培養(yǎng)1植物原生質(zhì)體是指除去細(xì)胞壁后，被質(zhì)膜包圍的裸露細(xì)胞2原生質(zhì)體的分離：植物細(xì)胞壁的主要成分分為纖維素，半纖維素，果膠質(zhì)，和少量蛋白質(zhì)，酶解法是現(xiàn)在最主要的原生質(zhì)體分離的方法材料的選擇：生長(zhǎng)旺盛，生命力強(qiáng)，無(wú)菌試管苗葉片，培養(yǎng)細(xì)胞，生長(zhǎng)旺盛，分散性好的愈傷組織或懸浮細(xì)胞也是制備原生質(zhì)體的良好材料，酶：纖維

35、素酶和半纖維素酶主要分別降解組成細(xì)胞壁的纖維素和半纖維素，而果膠酶主要是降解中膠層，優(yōu)點(diǎn)：獲得大量的原生質(zhì)體，缺點(diǎn)：酶抑制劑會(huì)影響活力，酶液的PH4.7到6.0溫度在25到30度滲透壓穩(wěn)定劑：甘露醇，山梨醇，葡萄糖，果糖，麥芽糖。原生質(zhì)體的游離：1材料的預(yù)處理：進(jìn)行表面消毒，黑暗處理，低溫處理和不同光質(zhì)照射等方法，提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力，2酶解處理：盡可能低的酶的濃度，盡可能短的酶解時(shí)間獲得大量而且有活力的原生質(zhì)體。酶的種類(lèi)，濃度，和酶解時(shí)間因材料而以。黑暗，靜止的條件下進(jìn)行，光照會(huì)引起細(xì)胞膜損傷，造成原生質(zhì)體的活力下降。原生質(zhì)體的純化：漂浮法：蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，沉降界面法，甘露

36、醇，蔗糖作為滲透壓調(diào)劑劑，原生質(zhì)體活力的測(cè)定：目測(cè)法，熒光素雙醋酸酯染色法，伊凡藍(lán)染色法（只有已損傷的細(xì)胞才能攝取這種染料，而完整無(wú)損的或細(xì)胞則不能攝取這種染料，因而凡不能染色的原生質(zhì)體為有活力的。3原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)基：無(wú)機(jī)鹽，滲透壓調(diào)節(jié)劑：原則，培養(yǎng)基滲透壓與細(xì)胞滲透壓等滲。結(jié)合使用多種糖醇比單獨(dú)使用一種糖醇的效果更好。有機(jī)成分：維生素，氨基酸，有機(jī)酸，糖及糖醇激素：NAA，IAAPH，5.55.94原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)法：優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，對(duì)原生質(zhì)體的傷害較小，通氣性好，代謝物易于擴(kuò)散，并且易于補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，形成細(xì)胞團(tuán)或小愈傷組織也易于轉(zhuǎn)移。缺點(diǎn)，原生質(zhì)體在培養(yǎng)基中分布不均勻，

37、常常發(fā)生原生質(zhì)體之間粘連的現(xiàn)象，或造成局部原生質(zhì)體密度過(guò)高，從而影響了原生質(zhì)體再生細(xì)胞的近一步生長(zhǎng)發(fā)育，并且難以定點(diǎn)和跟蹤單個(gè)原生質(zhì)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，固體平板法：優(yōu)點(diǎn)，原生質(zhì)體被彼此分開(kāi)并固定位置，可以避免細(xì)胞間有害代謝產(chǎn)物的影響，并便于定點(diǎn)觀察，有利于跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體發(fā)育過(guò)程，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體的分裂頻率和植板率，缺點(diǎn)：對(duì)操作要求較嚴(yán)格，在原生質(zhì)體懸浮液與瓊脂糖培養(yǎng)基混合時(shí)溫度必須合適，太高會(huì)影響原生質(zhì)體活力，太低時(shí)培養(yǎng)基凝固較快使原生質(zhì)體分布不均勻，并且生長(zhǎng)發(fā)育比淺層法慢。液體淺層固體平板雙層培養(yǎng)法：優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中以補(bǔ)充培養(yǎng)基對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的消耗，同時(shí)培養(yǎng)

38、物產(chǎn)生的有害物質(zhì)可以被固體培養(yǎng)基吸收，從而更有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，可以在下層固體培養(yǎng)基中添加一定的活性炭，可以有效的吸附培養(yǎng)物所產(chǎn)生的有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂及細(xì)胞團(tuán)的形成。瓊脂糖珠培養(yǎng)基：優(yōu)點(diǎn)：利于通氣，大體積的液體培養(yǎng)基為了防止瓊脂糖過(guò)度破碎，可以調(diào)整液體培養(yǎng)基的滲透壓來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的滲透壓，以利于原生質(zhì)體的進(jìn)一步生長(zhǎng)和發(fā)育。5原生質(zhì)體培養(yǎng)體系的優(yōu)化液體淺層培養(yǎng)期，雙層培養(yǎng)期，愈傷組織增殖期，愈傷組織過(guò)渡期，愈傷組織分化期6原生質(zhì)體的發(fā)育和植株再生細(xì)胞壁再生：原生質(zhì)體在表型上表現(xiàn)為體積增大，進(jìn)而由原來(lái)的球形逐漸變?yōu)闄E圓形。細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)：培養(yǎng)2到7天，用幼苗的下胚軸和子葉，幼根，懸浮培養(yǎng)的

39、細(xì)胞和未成熟種子的子葉等材料分離的原生質(zhì)體，一般比用葉肉分離的原生質(zhì)體容易誘導(dǎo)分裂愈傷組織形成植株再生7影響原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的因素基因型，原生質(zhì)體來(lái)源（材料，分化程度，生長(zhǎng)同步性），起始細(xì)胞密度（基本起始密度，培養(yǎng)基激素水平，密度與培養(yǎng)基成分完全性）第七章1植物體細(xì)胞雜交（原生質(zhì)體融合），是指不同種，屬間，甚至不同科間的原生質(zhì)體通過(guò)人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。2植物細(xì)胞雜交的類(lèi)型：體細(xì)胞雜交，配子體細(xì)胞雜交，配子間細(xì)胞雜交，微細(xì)胞雜交。原生質(zhì)體融合的種類(lèi):對(duì)稱(chēng)融合，非對(duì)稱(chēng)融合，3用于使細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)，物理主要是采用射線(xiàn)處理，使細(xì)胞核失活?；瘜W(xué)：核失活：碘乙酸，碘乙酰胺，質(zhì)失活：羅丹明6G，是一種親酯性染料，能夠抑制線(xiàn)粒體的氧化磷酸化過(guò)程從而使 質(zhì)失活。4原生質(zhì)體融合：NaNO3融合法，多聚化合物法，高PH高鈣離子法，聚乙二醇（PEG）法PEG聚乙二醇法：優(yōu)點(diǎn)，融合成本低，無(wú)特殊設(shè)備，融合子產(chǎn)生的異核率較高，融合過(guò)程不受物