DNA重組實(shí)驗(yàn)原理及步驟

1、實(shí)驗(yàn)十 DNA重組 一、實(shí)驗(yàn)原理 外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA叫做重組子。DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術(shù)之一，其本質(zhì)是一個(gè)酶促反應(yīng)過(guò)程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段的5端磷酸和3端羥基之間相互作用，形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。常用的DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對(duì)底物的要求低，能更有效地連接DNA的平末端，應(yīng)用更廣泛。T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分3步：首先，ATP與T4噬菌體DNA連接酶通過(guò)ATP的磷酸與連接酶的賴氨酸的氨基形成酶ATP復(fù)合物。被激活的

2、AMP隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5端的磷酸基團(tuán)上，形成磷酸磷酸鍵。DNA鏈3端的羥基被活化，取代ATP后與DNA5端的磷酸根形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP，完成DNA之間的連接。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和ATP作為輔助因子，在一定的溫度和pH條件下進(jìn)行連接反應(yīng)。二、儀器及試劑：1. 儀器：臺(tái)式離心機(jī)、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋等。2. 試劑：T4 DNA連接酶、10T4 DNA連接酶緩沖液、 載體DNA、外源DNA。三、操作步驟1. 外源DNA片段和載體DNA的連接取1只無(wú)菌Ep管、用微量進(jìn)樣器按下列順序加入各成分。10T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切

3、后的DNA片段 *1 約0.3 pmol酶切后的載體DNA *2 約0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的310倍。*2 相同末端的載體與DNA片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。2.蓋好蓋子，用手指輕彈Ep管數(shù)次，并于臺(tái)式離心機(jī)離心2s 以集中溶液。3.將反應(yīng)管放入16過(guò)夜反應(yīng)（1216h）。4.取出約25ng的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定連接結(jié)果，以未經(jīng)連接的質(zhì)粒DNA片段和酶切DNA片段作電泳。5.用0.1TE將連接混合物稀釋至50ul，使用1020ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌

4、感受態(tài)細(xì)胞。四、注意事項(xiàng)1. 連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后應(yīng)迅速做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。2. 根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)酶的用量。平端連接或接頭連接都比黏端連接慢得多，而且酶的用量也增大。3. 單價(jià)陽(yáng)離子或低濃度的聚乙二醇可提高平端連接的效率。4. 防止載體DNA自身環(huán)化，常用堿性磷酸酶處理線性載體，去掉載體的5?C磷酸以抑制DNA片段的自身環(huán)化。5. 正確調(diào)整載體DNA和外源DNA之間的比例有助于獲得高產(chǎn)量的重組產(chǎn)物。五、相關(guān)問(wèn)題1. 連接反應(yīng)的影響因素除了載體、供體的濃度及其比例等因素外，影響連接反應(yīng)的因素還有很多，如緩沖液組分、連接溫度與時(shí)間、酶濃度、DNA濃度及片段末端的堿基序列等。（1）連接緩沖液的影響不同的公司提供

5、的連接緩沖液可能有所不同，但大體上都含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過(guò)稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現(xiàn)多用1mmol/L，是酶反應(yīng)所必需的。（2）pH的影響一般將緩沖液的pH調(diào)節(jié)到7.4-7.8，較多用7.8。有

6、實(shí)驗(yàn)表明，若把pH為7.5-8.0時(shí)的酶活力定為100%，那么體系偏堿（pH為8.3）時(shí)僅為全部活力的65%；當(dāng)體系偏酸（PH為6.9）時(shí)僅為全部活力的40%。（3）ATP濃度的影響連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，ATP的最適濃度為0.5-1mmol/L，過(guò)濃會(huì)抑制反應(yīng)。例如，5mmol/L的ATP會(huì)完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報(bào)道，當(dāng)ATP的濃度為0.1mmol/L時(shí)，去磷酸載體的自環(huán)比例最大。由于ATP極易分解，所以當(dāng)連接反應(yīng)失敗時(shí)，除了DNA與酶的問(wèn)題外，還應(yīng)考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應(yīng)于-20保存，

7、溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時(shí)最好分小管貯存，防止反復(fù)凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長(zhǎng)期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長(zhǎng)期保存），臨用時(shí)加入新配制的ATP母液。（4）連接溫度與時(shí)間的影響因?yàn)轲ば阅┒说腄NA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過(guò)高會(huì)使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37。為了解決這一矛盾，在經(jīng)過(guò)綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16，時(shí)間為4-16h。現(xiàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于一般的黏性末端來(lái)說(shuō)，20 30min就足以取得相當(dāng)好的連接效果，當(dāng)然如果時(shí)間充裕的話，20 60min能使連接反應(yīng)進(jìn)行得更完全一些。對(duì)于平末端是不用考

8、慮氫鍵問(wèn)題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。（5）酶濃度的影響根據(jù)New England Biolabs公司對(duì)T4 DNA連接酶的定義，1U的酶可在16 30min內(nèi)連接20ul體系中Hind 酶切片段（黏性末端為0.12umol/L 5,末端，此時(shí)DNA質(zhì)量濃度約為300ng/ul）的50%。日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時(shí)酶用量要比連接黏端大10-100倍，廠商為了滿足這一要求，又往往提供高濃度的酶（幾百個(gè)單位/ul），所以進(jìn)行黏末端連接時(shí)需先行稀釋。除了立即用于反應(yīng)的部分可用酶反應(yīng)緩沖液稀釋外，其余都應(yīng)使用廠商提供的稀釋液。稀釋液的成分與酶保存

9、緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長(zhǎng)時(shí)間保持活力，也便于隨時(shí)取用。（6）DNA濃度的影響盡管有的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上推薦使用0.1-1nmol/L的DNA濃度，但考慮到用質(zhì)粒作為載體克隆時(shí)，最后要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物，所以DNA濃度不可過(guò)高，一般不會(huì)超過(guò)20nmol/L。相比較而言，以噬菌體、cosmid質(zhì)粒為載體的克隆過(guò)程最后要求線性化的連接產(chǎn)物，所以，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。此外，在用大質(zhì)粒載體進(jìn)行大片段克隆時(shí)，以及在雙酶切片段的連接反應(yīng)中，DNA濃度還應(yīng)降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個(gè)nmol/L。另?yè)?jù)研究，T4 DNA連接酶對(duì)DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，

10、所以，連接時(shí)DNA濃度不應(yīng)低于1nmol/L。即應(yīng)具有2nmol/L的末端濃度。2. 三種連接酶單位定義（1）Weiss單位連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的Weiss單位，現(xiàn)也稱PPi單位。他的單位定義為：37 20min內(nèi)將1nmol的32P從焦磷酸根上置換到ATP分子上所需的酶量?，F(xiàn)在大多數(shù)廠商仍使用這種單位。（2）d（A-T）環(huán)化單位由于Weiss單位定義中測(cè)試的是T4 DNA連接酶中除連接功能外的另一種磷交換功能，并且測(cè)試溫度高達(dá)30，與實(shí)際連接反應(yīng)相比無(wú)論在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich與Lehman提出了真正度量連接功能的d(A-T)環(huán)化單位，又稱外切酶抗性檢測(cè)。d（A-T）環(huán)化單位的定義為：30 30min 內(nèi)將100nmol/L的d（A-T）（約2kb長(zhǎng)）轉(zhuǎn)化成抗外切酶的形式。（3）黏性末端單位與Weiss單位相比，d（A-T）環(huán)化單位更接近實(shí)際，但仍有一定的問(wèn)題，例如，環(huán)化單位測(cè)試中用的是純AT片段，與實(shí)際連接中4種堿基隨機(jī)排列不符；再說(shuō)，如果連