這些凝膠染色技術(shù)你會(huì)了嗎

1、Word文檔 這些凝膠染色技術(shù)你會(huì)了嗎 (一)標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍(lán)染色法 (1)電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一干凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)；(2)室溫下振搖溫育4h至過(guò)夜；(3)去除染色液，收集保存可重復(fù)使用20-40次：(4)依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室溫振搖下脫色。靈敏度為0.1-0.5ug蛋白/每條帶。注：使用加熱的染色液或脫色液可以縮短染色或脫色時(shí)間。將染色液或脫色液在微波爐或水浴中加熱，(大約50-60)，染色時(shí)間可縮短至20min,脫色時(shí)間約 1-2h。(二)快速考馬斯亮藍(lán)染色法(1)電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一干凈的玻

2、璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250(溶解于50%三氯yi酸中)；(2)室溫下振搖溫育20min；(3)去除染色液，收集保存可重復(fù)使用多次；(4)加入數(shù)倍體積的脫色液(25%甲醇、7%乙酸)室溫振搖下脫色。必要時(shí)可更換脫色液。靈敏度為1.0ug蛋白/每條帶。(三)凝膠銨銀染色法(1)電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一干凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的50%乙醇和10%乙酸，振搖30min至過(guò)夜；(2)去除50%乙醇和10%乙酸，用去離子水清洗凝膠。加入20%乙醇, 室溫振搖30min；(3)去除20%乙醇，再加5倍體積的20%乙醇，室溫振搖30min；(4)去除20%

3、乙醇，將凝膠轉(zhuǎn)入通風(fēng)柜內(nèi)，加入5倍體積的用去離子水配制的5%戊/二醛，室溫振搖30min；(5)去除戊/二醛，用去離子水清洗凝膠。加入5倍體積的20%乙醇，室溫振搖20min；(6)去除20%乙醇，重復(fù)兩次；(7)去除20%乙醇，用去離子水清洗凝膠。再加入5倍體積的用去離子水，室溫溫育10min；(8)去除去離子水，加入4倍體積新奇配制的氨-水yin溶液，室溫振搖30min。配制100ml：加1.4ml 14.8mol/L氫氧化銨到100ml水中，再加入190ul 10mol/L氫氧/化鈉；放置渦旋器上緩緩加入1ml新奇配制的硝/酸銀溶液(0.8g硝/酸銀/ml水)，直至消失沉淀物，但很快溶解

4、；(9)去除氨-水yin溶液，用去離子水清洗凝膠20min以上，其間更換水?dāng)?shù)次；(10)去除水，加入5倍體積新奇配制的0.005%檸檬酸，0.019%的甲醛。輕柔混勻，數(shù)分鐘內(nèi)條帶即顯現(xiàn)出。當(dāng)背景開(kāi)頭變化時(shí)，去除顯影劑，用用去離子水清洗凝膠。在10%乙酸和20%乙醇中溫育凝膠，以終止反應(yīng)。靈敏度為110ng蛋白/每條帶。注：操作時(shí)，應(yīng)戴手套并使用干凈的玻璃器皿，以免污染，影響反應(yīng)的靈敏度。(四)凝膠中性銀染色法(1)電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一干凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的30%乙醇和10%乙酸，振搖30min至過(guò)夜；(2)去除乙醇/乙酸溶液，加入5倍體積的30%乙醇, 室溫振搖30mi

5、n；(3)去除乙醇，再加5倍體積的30%乙醇，室溫振搖30min；(4)去除乙醇，加入10倍體積的去離子水，室溫振搖10min；重復(fù)用去離子水清洗兩次；(5)去除去離子水，加入4倍體積新奇配制的0.1%硝/酸銀溶液(用室溫下貯存于棕色瓶?jī)?nèi)的20%原液稀釋而得)，室溫振搖30min；(6)去除硝/酸銀溶液，用去離子水清洗凝膠20s；(7)去除水，加入5倍體積的2.5%碳酸鈉和 0.02%的甲醛(pH4.0),室溫振搖溫育，數(shù)分鐘內(nèi)條帶即顯現(xiàn)出。當(dāng)背景開(kāi)頭變黑時(shí)，停止溫育；(8)在1%乙酸內(nèi)清洗，停止反映。用去離子水清洗，更換數(shù)次，每次10min；靈敏度為110ng蛋白/每條帶。(五)凝膠銅染色法

6、凝膠銅染色法為考馬斯亮藍(lán)或銀染色法的替代染色方法將凝膠氯/化銅溶液中溫育，在Tris和SDS同時(shí)存在時(shí)可形成明顯的白色不透亮的沉淀物。蛋白條仍舊清楚，留下一個(gè)多肽分別模式的附染圖象。由于蛋白質(zhì)未結(jié)合在凝膠上，可通過(guò)EDTA去除Cu離子而得以洗脫，因而該方法特殊適合需快速定位蛋白條帶用于免疫反應(yīng)，或進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)討論。其染色模式猶如考馬斯亮藍(lán)或銀染色法的凝膠，易進(jìn)行拍照。(1)電泳后，凝膠用蒸餾水短時(shí)清洗數(shù)次，每次30s,勿洗過(guò)長(zhǎng)時(shí)間；(2)將凝膠轉(zhuǎn)入一干凈的玻璃或塑料容器中。加入5倍于凝膠體積的0.3mol/L CuCl2；(3)室溫振搖min，較厚的凝膠可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。當(dāng)CuCl2 進(jìn)入凝膠時(shí)，在不含蛋白的區(qū)域會(huì)消失白色沉淀；(4)用蒸餾水清洗數(shù)分鐘，在黑色背景下觀看結(jié)