藥典微生物相關(guān)培訓(xùn) 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法(通則1106)解析

1、中國(guó)藥典2015版非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法(通則1106)解析馬英英陜西省食品藥品檢驗(yàn)所2015年8月16日主2015版控制菌檢查法主要變化培養(yǎng)基適用性要內(nèi)容方法適用性和供試品檢查控制菌鑒定程序常用鑒定方法簡(jiǎn)介Ch.P2015控制菌檢查主要變化檢驗(yàn)項(xiàng)目2010版中國(guó)藥典大腸埃希菌（E.coli）大腸菌群（Coliform）2015版中國(guó)藥典大腸埃希菌（E.coli）耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-TolerantGram-Negative Bacteria）沙門(mén)菌（Salmonella）沙門(mén)菌（Salmonella）銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa）金黃色葡萄球菌（S.aur

2、eus）梭菌（Clostridia）銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa）金黃色葡萄球菌（S.aureus）梭菌（Clostridia）白色念珠菌（C.albicans）白色念珠菌（C.albicans）Ch.P2010Ch.P2015控制菌檢查大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（耐膽鹽革蘭氏陰性菌） 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基沙門(mén)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體

3、培養(yǎng)基RV 沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基或沙門(mén)、志賀 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基菌屬瓊脂培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基化鈉瓊脂培養(yǎng)基梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基梭菌增菌培養(yǎng)基哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基念珠菌

4、顯色培養(yǎng)基1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基Ch.P2015控制菌檢查主要變化培養(yǎng)體系培養(yǎng)體系 增菌培養(yǎng)基（廣譜增菌培養(yǎng)基替代選擇性增菌培養(yǎng)基）、預(yù)增菌、選擇性增菌、分離用培養(yǎng)基種類(lèi)變化；培養(yǎng)時(shí)間與溫度變化。方法 培養(yǎng)基的適用性發(fā)生變化。 方法適用性發(fā)生變化（方法驗(yàn)證方法適用性）。供試品 強(qiáng)抑菌性樣品的處理方式發(fā)生變化。Ch.P2015控制菌檢查主要變化-結(jié)果判斷方式Ch.P2010Ch.P2015增菌、分離（純化）、生 增菌、分離（純化）、生化試驗(yàn)（較多） 化試驗(yàn)（較少）適宜的鑒定試驗(yàn) 適宜的鑒定試驗(yàn)Ch.P2015：如果經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無(wú)法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不易存

5、在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對(duì)徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。（陽(yáng)性對(duì)照可以不生長(zhǎng)）培養(yǎng)基適用性測(cè)試項(xiàng)目接種量 培養(yǎng)條件判斷標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng) 100cfu 各控制菌檢查培養(yǎng)條 與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。能力件規(guī)定最短時(shí)間固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng) 100cfu 各控制菌檢查培養(yǎng)條 被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。能力件規(guī)定最短時(shí)間培養(yǎng)基抑制能力 100cfu 各控制菌檢查培養(yǎng)條 試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)件規(guī)定最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)基指示能力 100cfu 各控制菌檢查培養(yǎng)條 被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生件規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi) 長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示反應(yīng)情況等應(yīng)于對(duì)照培養(yǎng)基

6、一致。培養(yǎng)基適用性控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株耐膽鹽革蘭陰性菌腸道增菌肉湯促生長(zhǎng)能力大腸埃希菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌抑制能力促生長(zhǎng)能力+指示特性紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂麥康凱液體培養(yǎng)基銅綠假單胞菌大腸埃希菌大腸埃希菌沙門(mén)菌促生長(zhǎng)能力抑制能力金黃色葡萄球菌大腸埃希菌促生長(zhǎng)能力+指示特性麥康凱瓊脂培養(yǎng)基RV沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力乙型副傷寒沙門(mén)菌抑制能力金黃色葡萄球菌+指示特性木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基 促生長(zhǎng)能力乙型副傷寒沙門(mén)菌三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基指示能力乙型副傷寒沙門(mén)菌培養(yǎng)基適用性控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株銅綠假單胞菌 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力銅綠假單胞菌抑制能力

7、金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌+指示特金黃色葡萄球菌 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基 促生長(zhǎng)能力性抑制能力大腸埃希菌生孢梭菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力促生長(zhǎng)能力促生長(zhǎng)能力生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌+指示特+指示能沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 促生長(zhǎng)能力性念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力力白色念珠菌大腸埃希菌抑制能力方法適用性和供試品檢查方法適用性微生物檢驗(yàn)：某種樣品采用某種方法得到一個(gè)檢查結(jié)果。供試品 方法的影響 有效性方法適用性和供試品檢查方法適用性Ch.P2010方法驗(yàn)證10100cfuCh.P2015方法適用性不大于100cfu名稱(chēng)加菌量培養(yǎng)要求在最苛刻的條件

8、下培養(yǎng)（培養(yǎng)時(shí)間）結(jié)果判斷 上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性（非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）中的“抗菌活性的去除或滅活”），并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。結(jié)果判斷：如果經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無(wú)法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不易存在該供試品，選擇抑菌成分消除相對(duì)徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。方法適用性和供試品檢查-耐膽鹽革蘭陰性菌定性方法適用性和供試品檢查-耐膽鹽革蘭陰性菌定量預(yù)培養(yǎng)：將制備好的1：10的供試液，在2025 培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間使供試品中的細(xì)菌恢復(fù)但不增殖（約2小時(shí)）耐膽鹽革蘭陰性

9、菌的可能菌數(shù)（N）每1g（或1ml各供試品量的檢查結(jié)果或）供試品種可能的菌數(shù)cfu0.1g或0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml0.1ml相當(dāng)于0.1g或ml、0.01g或ml、0.001g或ml樣品+-N103102 N103腸道菌增菌液體培養(yǎng)基3035培養(yǎng)2448小時(shí)紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂+-10 N102N103035培養(yǎng)1824小時(shí)注：（1）+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長(zhǎng)； -代表紫紅單眼葡萄糖瓊脂平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)。（ ）若量減少 倍（如0.00供試品1ml，0.0001g或0.0001ml，10cm2樣品），則每1g（1ml）供試品中可能的菌數(shù)（N）應(yīng)相應(yīng)增加1

10、0倍。VRBA：有菌落生長(zhǎng)，檢出耐膽鹽革蘭陰性菌 ，根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，查表得耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。210 0.01g 0.01ml 0.001g或或，陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照方法適用性和供試品檢查-耐膽鹽革蘭陰性菌耐膽鹽革蘭陰性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)替代2010年版大腸菌群Coliform）：耐膽鹽革蘭陰性菌為一群無(wú)嚴(yán)格定義的微生物，通常它們被定義為能夠在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物。它們包括無(wú)乳糖發(fā)酵但能夠利用葡萄糖，能夠在膽鹽中生長(zhǎng)的革蘭陰性菌，例如，腸桿菌科、假單胞菌和氣單胞菌屬的一些膽鹽耐受的革蘭陰性菌。方法適用性和供

11、試品檢查-耐膽鹽革蘭陰性菌討論：（1）若供試品具有抑菌性，應(yīng)采用中和、稀釋、薄膜過(guò)濾等方法去除抑菌活性。（2）試驗(yàn)過(guò)程中第一步供試品加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑預(yù)培養(yǎng)是使待檢菌“充分恢復(fù)”，但不增殖才能保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確；實(shí)際操作過(guò)程中如何保證“供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不增殖” 還有待進(jìn)一步實(shí)踐摸索。（3）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（牛膽鹽）（4）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基在培養(yǎng)耐膽鹽革蘭陰性菌時(shí)，會(huì)出現(xiàn)變色和不變色兩種情況。變色可能是由菌體大量增殖或其產(chǎn)生的初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物影響到該培養(yǎng)基的pH值進(jìn)而引起亮綠發(fā)生變色反應(yīng)。耐膽鹽革蘭陰性菌中大部分是產(chǎn)酸的，會(huì)引起培養(yǎng)基顏色變化，（加入大腸試驗(yàn)是否變

12、色）但也有不產(chǎn)酸或少產(chǎn)酸的（如銅綠假單胞菌）不會(huì)引起培養(yǎng)基變色。雖然該培養(yǎng)基會(huì)時(shí)而發(fā)生指示特性，但考慮到ICH中對(duì)顏色指示功能未作要求；耐膽鹽革蘭陰性菌包含細(xì)菌種類(lèi)繁多，產(chǎn)酸能力差異大，顏色的改變也不統(tǒng)一，不宜統(tǒng)一要求；中成藥本身顏色較深，可能會(huì)掩蓋培養(yǎng)基顏色，影響顏色觀察；等因素在修訂時(shí)未加入該培養(yǎng)基的指示功能。試驗(yàn)中無(wú)論培養(yǎng)基渾濁與澄清，均應(yīng)做分離培養(yǎng)、染色、鏡檢。方法適用性和供試品檢查大腸埃希菌方法適用性和供試品檢查大腸埃希菌討論：（1）若供試品具有抑菌性，應(yīng)采用中和、稀釋、薄膜過(guò)濾等方法去除抑菌活性。（2）胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基在對(duì)供試品進(jìn)行前增菌或選

13、擇性增菌時(shí)，盡量采取標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的上限進(jìn)行，有利于菌體的復(fù)蘇、增殖和檢出，尤其是對(duì)污染較輕或污染菌受損較嚴(yán)重的供試品。對(duì)于污染嚴(yán)重的供試品可根據(jù)實(shí)際情況按標(biāo)準(zhǔn)調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度和時(shí)間。（3）藥品中污染的大腸埃希菌，易受生產(chǎn)工藝及藥物的影響，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征會(huì)發(fā)生變化。檢驗(yàn)者在挑選菌落時(shí)都會(huì)盡量挑選最典型的菌落，但形成典型菌落的不一定是大腸埃希菌，部分非典型菌落也會(huì)是大腸埃希菌，因此該試驗(yàn)對(duì)檢驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)要求較高，也造成了一定的主觀性。要求檢驗(yàn)者盡量多挑選菌落進(jìn)行鑒別，以防漏檢。方法適用性和供試品檢查沙門(mén)菌方法適用性和供試品檢查沙門(mén)菌討論：（1）若供試品具有抑菌性，應(yīng)采用中和

14、、稀釋、薄膜過(guò)濾等方法去除抑菌活性。（2）Ch.P2015沙門(mén)菌檢查方法和所用的培養(yǎng)基較Ch.P2010更加完善。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，TSB 較營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基更加豐富，更有利于細(xì)菌的復(fù)蘇和繁殖，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻的細(xì)菌也能很好的培養(yǎng)。RV沙門(mén)菌增菌肉湯的高滲透壓，低pH和孔雀綠的抑菌作用使培養(yǎng)基的選擇性作用更強(qiáng)，不僅抑制了革蘭陽(yáng)性菌，對(duì)腸桿菌科的細(xì)菌也具有不同程度的抑制作用。木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基上沙門(mén)菌特有的形態(tài)特征更有利于觀察。（血清分型）（3）隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，藥典控制菌檢查鑒別方法不作具體規(guī)定，由各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身?xiàng)l件自行選擇，以適應(yīng)先進(jìn)技術(shù)的發(fā)展，與國(guó)外藥典控制菌檢查的發(fā)展趨勢(shì)同步

15、。這就要求各實(shí)驗(yàn)室要具備相當(dāng)?shù)臈l件設(shè)備和技術(shù)能力，才能適應(yīng)新時(shí)期藥品質(zhì)量控制的要求。方法適用性和供試品檢查銅綠假單胞菌檢查方法方法適用性相當(dāng)于1g、1ml、10cm2樣品相當(dāng)于1g、1ml、10cm2樣品胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（銅綠）3035培養(yǎng)1824小時(shí)溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板3035培養(yǎng)18小時(shí)溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板3035培養(yǎng)18小時(shí)3035培養(yǎng)1872小時(shí)與陽(yáng)性對(duì)照相比，菌落形態(tài)一致 ，陽(yáng)性對(duì)照計(jì)數(shù)不大于100cfu。取平板上的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照方法適用性和供試品檢查銅綠假單胞菌討論：（1）若供試品具有

16、抑菌性，應(yīng)采用中和、稀釋、薄膜過(guò)濾等方法去除抑菌活性。（2）在進(jìn)行銅綠假單胞菌檢驗(yàn)時(shí)，傳統(tǒng)的方法是在分離純化之后，進(jìn)行革蘭染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)，再進(jìn)行一系列的綠膿菌素試驗(yàn)或者硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42生長(zhǎng)試驗(yàn)和明膠液化試驗(yàn)，也比較時(shí)力。與傳統(tǒng)方法比較，用（如自微生物鑒定系統(tǒng)、PCR等）準(zhǔn)確性高，鑒定度，但用較高。各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身?xiàng)l件自行選擇結(jié)品本身特，檢驗(yàn)時(shí)限等因素，選擇適宜的方法，會(huì)高檢驗(yàn)的和準(zhǔn)確性。方法適用性和供試品檢查金黃色葡萄球菌檢查方法方法適用性方法適用性和供試品檢查金黃色葡萄球菌討論：（1）若供試品具有抑菌性，應(yīng)采用中和、稀釋、薄膜過(guò)濾等方法去除抑菌活性。（2）在進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢

17、驗(yàn)時(shí)，傳統(tǒng)方法是在分離純化，革蘭染色鏡檢之后使用兔血漿進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)，而兔血漿的質(zhì)量和新鮮程度要求相對(duì)較高，否則容易得出假陰性結(jié)果。雖然在實(shí)驗(yàn)的同時(shí)使用了陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照作為參考，但遇到上述情況也比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對(duì)于凝固與否需要人工判斷，結(jié)果又會(huì)有誤差。與傳統(tǒng)方法比較，借用儀器（如VITEK、PCR、RP等）準(zhǔn)確性高，鑒定速度快，但費(fèi)用較高。各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身?xiàng)l件自行選擇結(jié)合樣品本身特點(diǎn)，檢驗(yàn)時(shí)限等因素，選擇適宜的方法，會(huì)提高檢驗(yàn)的效率和準(zhǔn)確性。方法適用性和供試品檢查梭菌檢驗(yàn)檢查方法方法適用性相當(dāng)于1g、1ml、10cm2樣品2份一份置80 加熱保相當(dāng)于1g、1ml、10cm2樣品2份一份

18、置80 加熱保溫10分鐘后迅速冷卻梭菌增菌培養(yǎng)基溫10分鐘后迅速冷卻梭菌增菌培養(yǎng)基（生孢梭菌）3035厭氧培養(yǎng)48小時(shí)3035厭氧培養(yǎng)48小時(shí)哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板3035 厭氧培養(yǎng)4872小時(shí)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板3035 厭氧培養(yǎng)48小時(shí)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)平板上有菌落生長(zhǎng)，過(guò)氧化酶陰性，進(jìn)行適宜的鑒定；過(guò)氧化酶陽(yáng)性，判供試品未檢出梭菌。與陽(yáng)性對(duì)照相比，菌落形態(tài)一致 ，陽(yáng)性對(duì)照計(jì)數(shù)不大于100cfu。過(guò)氧化酶陰性陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照方法適用性和供試品檢查白色念珠菌檢查方法方法適用性相當(dāng)于1g、1ml、10cm2樣品相當(dāng)于1g、1ml、10cm2樣品沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（白念）3035培

19、養(yǎng)3沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基3035培養(yǎng)35沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板（SDA）3035培養(yǎng)24小時(shí)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板（SDA）3035培養(yǎng)2448小時(shí)取平板上的菌落種念珠菌 取平板上的菌落種念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)或采用 顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后與陽(yáng)性對(duì)照相比，菌落形態(tài)一 致 。陽(yáng)性其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。對(duì)照計(jì)數(shù)不大于100cfu。陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照陰性對(duì)照為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行差調(diào)查。陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)方法同供試品的控制菌檢查，對(duì)照菌的加量應(yīng)不大于100cfu。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)

20、的控制菌。特情況除外控制菌鑒定微生物鑒定指導(dǎo)原則（通則9204）為非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查中控制菌的鑒定，以及藥物原料、輔料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間體和終產(chǎn)品中檢出微生物的鑒定提供指導(dǎo)。如果在藥物原料、輔料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境，中間體和終產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)微生物，典型的做法是進(jìn)行鑒別，包括鑒定和菌株分型。在某些時(shí)候，微生物鑒定需要達(dá)到更加明確的水平，如種屬水平的鑒定。甚至進(jìn)行菌株水平的鑒定，這種技術(shù)在污染調(diào)查的過(guò)程中非常有用，能夠決定微生物污染的來(lái)源。對(duì)潔凈室和其他受控環(huán)境分離到的微生物進(jìn)行適當(dāng)比率的鑒定，掌握環(huán)境微生物污染情況，有助于污染調(diào)查。控制菌鑒定確定實(shí)驗(yàn)室分離的微生物的類(lèi)別，大類(lèi)如細(xì)菌、酵

21、母菌或霉菌，或小類(lèi)如屬和/或種。在大多數(shù)非無(wú)菌藥品生產(chǎn)過(guò)程和部分無(wú)菌生產(chǎn)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中，利用菌落形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、不同的染色技術(shù)，以及氧化酶、過(guò)氧化氫酶和凝固酶反應(yīng)等特征的生化反應(yīng)，來(lái)確定實(shí)驗(yàn)室分離到的微生物的特性，如為非致病球菌或致病性球菌，可以滿足趨勢(shì)分析和調(diào)查需要而不是嚴(yán)格的微生物鑒定。微生物鑒定需要達(dá)到明確屬或種的水平，甚至鑒定到菌株水平?？刂凭b定鑒定步驟1、待檢菌的分離純化微生物鑒定的第一步是培養(yǎng)物的分離純化。挑取待檢菌在適宜的微生物固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線分離純化出純培養(yǎng)物（單個(gè)菌落），必要時(shí)可進(jìn)一步純培養(yǎng)以獲取待檢菌的純培養(yǎng)物，為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量菌體?？刂凭b

22、定2、初篩試驗(yàn)常規(guī)的微生物鑒定，一般要先進(jìn)行初篩試驗(yàn)確定待檢菌的基本微生物特征，將待檢菌做初步分類(lèi)。常見(jiàn)的初篩包括革蘭染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)、重要的生化反應(yīng)等。重要的生化篩選試驗(yàn)包括：氧化酶試驗(yàn)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)?zāi)堂冈囼?yàn)初篩試驗(yàn)可為評(píng)估提供有價(jià)值的信息，對(duì)于微生物鑒定方法來(lái)說(shuō)，初篩試驗(yàn)是最關(guān)鍵的一步，若給出錯(cuò)誤的結(jié)果，將影響后續(xù)試驗(yàn)。控制菌鑒定生化反應(yīng)-氧化酶試驗(yàn)原理：氧化酶或稱(chēng)細(xì)胞色素氧化酶是細(xì)胞色素呼吸系統(tǒng)的終端呼吸酶，能直接利用氧分子作為受氫體，將底物上脫下來(lái)的氫與氧結(jié)合成水。作氧化酶試驗(yàn)時(shí)，此酶并不直接與氧化酶試劑反應(yīng)，而首先使細(xì)胞色素c氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素c再

23、使對(duì)苯二胺試劑氧化，使之成為玫瑰紅色到暗紫色的醌類(lèi)化合物。主要用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌（氧化酶陽(yáng)性）和腸道菌（氧化酶陰性）。控制菌鑒定生化反應(yīng)-氧化酶試驗(yàn)操作過(guò)程：取潔凈的濾紙置平皿內(nèi)，用無(wú)菌接種環(huán)從平板上挑取單顆待鑒定的菌落或菌苔，均勻涂抹在濾紙上，滴上一滴氧化酶試劑，在1030秒鐘內(nèi)如果出現(xiàn)深紫色則為陽(yáng)性反應(yīng)，延緩反應(yīng)或顏色不變色者則為陰性反應(yīng)。注意事項(xiàng)： 含葡萄糖培養(yǎng)基上的菌落不宜做氧化酶試驗(yàn)。因葡萄糖發(fā)酵可氧化酶的活性，造成假陰性。 待檢菌應(yīng)避免同鐵、鎳等金屬接觸，故不宜用鎳鉻合金絲制成的接種環(huán)。 如果氧化酶試劑變成紫色時(shí)，則不能使用。 反應(yīng)需在有氧條件下進(jìn)行，勿將試劑滴加過(guò)多，以

24、免妨礙菌苔與空氣接觸，造成假陰性?？刂凭b定生化反應(yīng)-過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)原理：細(xì)菌代謝產(chǎn)生過(guò)氧化氫，對(duì)菌細(xì)胞有毒，過(guò)氧化氫酶的作用是使過(guò)氧化氫分解成分子態(tài)氧和水，使其解毒。具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌培養(yǎng)物，加入過(guò)氧化氫酶試液 ，立即產(chǎn)生氣泡，即為陽(yáng)性反應(yīng)。絕大多數(shù)細(xì)菌的瓊脂培養(yǎng)物均產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，但鏈球菌屬為陰性，故常用于鑒別葡萄球菌、微球菌（陽(yáng)性）與鏈球菌。操作過(guò)程：用無(wú)菌接種環(huán)挑取一環(huán)瓊脂培養(yǎng)基上的可疑菌落置潔凈的載玻片上，滴加過(guò)氧化氫酶試劑數(shù)滴，或于瓊脂斜面培養(yǎng)物上直接滴加過(guò)氧氫酶試劑，立即觀察結(jié)果。如果產(chǎn)生氣泡者為陽(yáng)性反應(yīng)，不產(chǎn)生氣泡者則為陰性反應(yīng)?？刂凭b定生化反應(yīng)-過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)注意事項(xiàng)試驗(yàn)

25、用的培養(yǎng)基、玻片不得含有血液或其它體液，因紅細(xì)胞含有過(guò)氧化氫酶，易造成假陽(yáng)性反應(yīng)。試驗(yàn)必須用1824h的培養(yǎng)物，因陳舊培養(yǎng)可能喪失酶活性，出現(xiàn)假陰性反應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)，勿先加過(guò)氧化氫酶試劑再加菌，更不能用無(wú)菌接種環(huán)將菌苔與過(guò)氧化氫酶試劑相混合。試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)以已知陽(yáng)性菌株作對(duì)照?？刂凭b定生化反應(yīng)-凝固酶試驗(yàn) 血漿凝固酶是一種能使血漿凝固的酶類(lèi)物質(zhì)。致病性的葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白，附著于細(xì)菌表面，形成凝塊。 葡萄球菌產(chǎn)生的凝固酶有兩種，一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的結(jié)合凝固酶，它直接作用于血漿中的纖維蛋白原，使發(fā)生沉淀，可用玻片法測(cè)定；另一種是由菌體生成后釋放于培養(yǎng)基中，叫做游離凝固酶，它能使血

26、漿中的凝固酶反應(yīng)因子形成類(lèi)似凝固酶的物質(zhì)，間接地使纖維 蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，可由試管法測(cè)定。 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，該酶具有抗原性，能和兔血漿結(jié)合形成一種穩(wěn)定的結(jié)合物，使血漿凝固，而其它的葡萄球菌沒(méi)有該特性，所以可以用該反應(yīng)來(lái)確認(rèn)金黃色葡萄球菌的存在?？刂凭b定3、表型微生物鑒定表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達(dá)來(lái)區(qū)分不同微生物間的差異，是經(jīng)典的微生物分類(lèi)鑒定法，以微生物細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性表型為主要指標(biāo)，通過(guò)比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進(jìn)行鑒別。微生物分類(lèi)中使用的表型特征見(jiàn)表。控制菌鑒定3、表型微生物鑒定控制菌鑒定3、表型微生物鑒定微生物細(xì)胞的大小和形態(tài)、

27、芽孢、細(xì)胞成分、表面抗原、生化反應(yīng)和對(duì)抗菌劑的敏感性等表型，除受其遺傳基因的控制外，還與微生物的分離環(huán)境、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件等因素有關(guān)。表型微生物鑒定通常采用增殖培養(yǎng)的方式獲得實(shí)驗(yàn)所需要的大量純化培養(yǎng)物，但長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的方法有時(shí)對(duì)一些特定微生物的恢復(fù)、增殖作用是有限的，部分環(huán)境微生物在普通增殖培養(yǎng)基中甚至不能恢復(fù)；一些從初始培養(yǎng)物中剛分離出的受損微生物還有可能不能完整的表達(dá)其表型屬性；因此，在表型鑒別時(shí)應(yīng)注意培養(yǎng)基和傳代次數(shù)對(duì)鑒定結(jié)果的影響?？刂凭b定3、表型微生物鑒定目前已經(jīng)發(fā)展出的基于微生物的生理、生化反應(yīng)，脂肪酸構(gòu)成分析（氣液相色譜法）和全細(xì)胞成分分析(質(zhì)譜法)等微生物鑒定系統(tǒng)，在進(jìn)行結(jié)果判

28、斷時(shí)需借助于系統(tǒng)自身的鑒別數(shù)據(jù)庫(kù)，因此鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性可能受實(shí)驗(yàn)中所使用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件與建庫(kù)時(shí)的特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的一致性影響?？刂凭b定3、表型微生物鑒定表型微生物鑒定方法已廣泛應(yīng)用于藥品微生物實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)微生物表型所提供的信息可以掌握環(huán)境微生物群落的變化，并用于產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)決策。在許多質(zhì)量控制調(diào)查中，單獨(dú)的表型鑒定結(jié)果就能給出充足的信息幫助使調(diào)查人員進(jìn)行深入調(diào)查，并按需要推薦適宜的糾正措施。利用表型微生物鑒定可對(duì)藥品中發(fā)現(xiàn)的微生物進(jìn)行常規(guī)鑒定和特定控制菌的鑒定?？刂凭b定3、表型微生物鑒定常規(guī)的細(xì)菌鑒定是將檢出目標(biāo)菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢并以過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)或凝固酶試

29、驗(yàn)三個(gè)特征生化反應(yīng)，將細(xì)菌做初步分類(lèi)：革蘭氏陽(yáng)性球菌：先通過(guò)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，區(qū)分葡萄球菌(陽(yáng)性)和鏈球菌(陰性)。再依據(jù)凝固酶試驗(yàn)推測(cè)葡萄球菌可能為致病性(凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性)和非致病性(凝固酶試驗(yàn)陰性)。革蘭氏陰性球菌：奈瑟菌屬和布蘭漢菌屬等。革蘭氏陽(yáng)性桿菌：依據(jù)需氧情況，可分為厭氧菌（如梭菌屬）、需氧或兼性菌（如過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性的棒狀桿菌、李斯特菌、芽孢桿菌等；過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性的乳酸桿菌等）。革蘭氏陰性桿菌：通過(guò)氧化酶試驗(yàn)區(qū)分為非發(fā)酵菌(陽(yáng)性)和發(fā)酵菌即腸道菌(陰性)?？刂凭b定4、基因型微生物鑒定與表型特征不同，微生物基因型通常不受生長(zhǎng)培養(yǎng)基或分離物活性的影響，只需分離到純菌落便可用于分

30、析。大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的，因而DNADNA雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、16S rRNA序列 和 23SrRNA序列、多位點(diǎn)序列分型、焦磷酸測(cè)序、DNA探針和核糖體分型分析等基因型微生物鑒定方法理論上更值得信賴，但由于基因鑒定法需要昂貴的分析設(shè)備和材料，通常基因鑒定法僅在關(guān)鍵微生物調(diào)查中使用，如產(chǎn)品不合格調(diào)查，且必須經(jīng)過(guò)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。控制菌鑒定4、基因型微生物鑒定目前伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)第二版中對(duì)細(xì)菌分類(lèi)的描述是通過(guò)遺傳物質(zhì)的分析比較來(lái)實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)未知微生物的DNA與已知微生物的DNA比較，能夠確定親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近?；蛐丸b定可通過(guò)DNA雜交、限制性酶切片段圖譜的比較和/或DNA探針來(lái)完成。

31、控制菌鑒定4、基因型微生物鑒定若DNADNA的雜交親緣關(guān)系大于70%時(shí)，即表明微生物是同一種屬；系統(tǒng)發(fā)育典型的分析方法是通過(guò)比較細(xì)菌16SrRNA或真菌23S rRNA基因的部分堿基序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。即經(jīng)過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行基因擴(kuò)增、電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物、以雙脫氧鏈終止法進(jìn)行堿基測(cè)序、與專(zhuān)用數(shù)據(jù)庫(kù)（已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證）或利用公共的數(shù)據(jù)庫(kù)（不一定經(jīng)過(guò)驗(yàn)證）進(jìn)行比對(duì)等過(guò)程?？刂凭b定4、基因型微生物鑒定微生物分類(lèi)學(xué)的基因型/系統(tǒng)發(fā)育的特征類(lèi)別特征基因型DNA-DNA、DNA基比例（如G+C）、限制性酶和DNA16S rRNA 列和18S rRNA列系統(tǒng)發(fā)控制菌鑒定4、基因型微生物鑒定基于核酸的方法可以用來(lái)篩

32、選處于過(guò)渡期受損的微生物。將存在于過(guò)渡期與菌株生存能力相關(guān)的rRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方法轉(zhuǎn)換為可用于PCR擴(kuò)增的DNA。解決了不能存活的細(xì)菌細(xì)胞中DNA的擴(kuò)增問(wèn)題。該方法經(jīng)過(guò)樣品收集、核酸提取、目的片段擴(kuò)增、雜交和檢測(cè)等步驟，涉及了變異微生物的檢測(cè)、檢測(cè)限、基質(zhì)效應(yīng)、正向截點(diǎn)的核查、儀器設(shè)備和系統(tǒng)攜帶污染、分析的精確性和試驗(yàn)的重現(xiàn)性等內(nèi)容?？刂凭b定4、基因型微生物鑒定-DNA的堿基組成堿基組成是各種生物一個(gè)穩(wěn)定的特征。用G+C占全部堿基物質(zhì)的摩爾百分比表示各類(lèi)生物的DNA堿基組成特征。具有相似的G+C含量，則具有親緣關(guān)系近的可能性。同一種內(nèi)不同菌株G+C含量差別應(yīng)在4%-5%。同屬不同種的差別應(yīng)低于10%-15%。常用鑒別方法介紹顯色培養(yǎng)基原：利用不同種屬細(xì)菌代謝所產(chǎn)生的酶的特異性，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特異性