氨基酸的鑒定(紙層析法)

1、氨基酸的鑒定（紙層析法）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握紙層析法的基本原理2、通過(guò)對(duì)氨基酸的分離，掌握紙層析的操作方法并學(xué)會(huì)分析未知樣品中的氨基酸組分。實(shí)驗(yàn)原理：1、層析法又稱(chēng)色譜法（Chromatography）,是一種物理的分離方法。利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附辦、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相兩相中,并使各組分以不同速度移動(dòng),從而得到有效的分離。操作方式:紙層析、薄層層析、柱層析等。分離機(jī)理:分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析等。2、紙層析法是用濾紙作為情性支持物的分配層析法,展層溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。濾紙纖維上的羥

2、基具有親水性,在濾紙上水就被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。當(dāng)有機(jī)溶劑（流動(dòng)相）沿紙流動(dòng)經(jīng)過(guò)層析點(diǎn)時(shí),層析點(diǎn)上溶質(zhì)就在水相和有機(jī)相之間不斷進(jìn)行分配。由于溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開(kāi)。井麗茅數(shù)K-溶質(zhì)在固定相中的濃度一溶質(zhì)在流動(dòng)相中的滾厲物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的移動(dòng)速率用Rf值來(lái)表示:原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶鈿前沿的距離珞刑前沿上行法層桿示意13、在一定條件下，物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。4、本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸，利用茚三酮反應(yīng)將氨基酸層析點(diǎn)顯色來(lái)鑒定氨基酸的種類(lèi)。試劑:1、

3、酸性展層劑正丁醇：88%甲酸:水=15:3:2V/V2、顯色儲(chǔ)備液:0.4mol/L茚三酮-異丙醇：甲酸:水=20:1:53、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液（6mg/ml,苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、組氨酸His）4、未知樣品液：上述4種氨基酸中的一種或幾種混合液（每組任選一個(gè)樣品）實(shí)驗(yàn)器材：、濾紙、燒杯3、剪刀4、毛細(xì)管5、層析缸6、微量注射器7、電吹風(fēng)8、保鮮膜操作方法：一、點(diǎn)樣1、量取30ml層析溶劑、1ml顯色貯備液于層析缸中，混勻密閉，靜置。（展層缸洗凈后應(yīng)除去多余的水，否則會(huì)影響展層溶劑的比例而影響展層）2、戴好手套，在桌上鋪好一層保鮮膜。取一張干凈濾紙，將其剪裁為18cmX14c

4、m。在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，在此直線上等距離分出幾個(gè)點(diǎn)作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。（點(diǎn)樣操作時(shí)應(yīng)戴手套，防止樣品及濾紙受污染）3、用毛細(xì)管將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸及未知樣品分別點(diǎn)在點(diǎn)樣點(diǎn)上，每次點(diǎn)樣后用電吹風(fēng)冷風(fēng)吹干再點(diǎn)下一次，點(diǎn)樣點(diǎn)直徑不超過(guò)5mm。二、層析與顯色1、將濾紙卷成圓柱形，用針線縫合或釘書(shū)針固定成圓筒狀，紙的兩邊不能接觸。2、將濾紙豎直放入盛有展層劑的層析缸中，迅速蓋緊層析缸蓋（點(diǎn)樣點(diǎn)的一端在下，展層劑液面需低于點(diǎn)樣線1cm左右。3、待溶劑前沿線距濾紙末端12cm（展層長(zhǎng)度10cm，約2hr）時(shí)，取出濾紙（需帶上手套）4、用鉛筆將前沿線作一標(biāo)記。剪去縫合線，電吹風(fēng)熱風(fēng)吹千（通風(fēng)櫥中進(jìn)

5、行），即可見(jiàn)層析斑點(diǎn)。結(jié)果處理：用鉛筆將層析圖譜上的斑點(diǎn)圈出，分別測(cè)量點(diǎn)樣點(diǎn)到層析點(diǎn)中心和點(diǎn)樣點(diǎn)到溶劑前沿的距離。計(jì)算各種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的Rf值，并根據(jù)樣品分離的情況鑒定混合樣品中氨基酸的組分。、點(diǎn)樣點(diǎn)1-His2-Phe3-Gly4-Pro5-A18距離/cm一、點(diǎn)樣點(diǎn)到層析點(diǎn)中心0.85.61.63.60.9/3.9/6.2點(diǎn)樣點(diǎn)到溶劑前沿&6&6&5&6&6Rf(His)=0.8/8.6=0.093Rf(Phe)=5.6/8.6=0.651Rf(Gly)=1.6/8.5=0.188Rf(Pro)=3.6/8.6=0.419樣品：下：Rf=0.9/8.6=0.105中：Rf=3.9/8.6=0.453上：Rf=6.2/8.6=0.721混合樣品中氨基酸的組分為：His、Pro、Phe誤差分析：1、樣品點(diǎn)樣不足，顯色不明顯。2、點(diǎn)樣時(shí)溫度較高，氨基酸濃度發(fā)生變化。3、濾紙邊緣不齊，影響氨基酸擴(kuò)散速度。4、顯色時(shí)，熱風(fēng)溫度不夠，顯色不明顯。5、測(cè)量不精確，擴(kuò)散距離存在誤差。注意事項(xiàng)：1、嚴(yán)格控制點(diǎn)樣位置以及點(diǎn)樣直徑，防止層析后氨基酸斑點(diǎn)過(guò)度擴(kuò)散和重疊，同時(shí)點(diǎn)樣點(diǎn)應(yīng)高于展層劑液面。2、點(diǎn)樣時(shí)宜采用冷風(fēng)吹干。3、展層劑需臨用時(shí)配制，以免發(fā)生酯化而影響層析結(jié)果。展層劑比例應(yīng)保持不變，因此展層缸應(yīng)保持干燥。4、若樣品中溶質(zhì)種類(lèi)較