氨基酸的鑒定(紙層析法)

1、氨基酸的鑒定（紙層析法）實驗目的：1、掌握紙層析法的基本原理2、通過對氨基酸的分離，掌握紙層析的操作方法并學會分析未知樣品中的氨基酸組分。實驗原理：1、層析法又稱色譜法（Chromatography）,是一種物理的分離方法。利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差異（如吸附辦、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在固定相和流動相兩相中,并使各組分以不同速度移動,從而得到有效的分離。操作方式:紙層析、薄層層析、柱層析等。分離機理:分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析等。2、紙層析法是用濾紙作為情性支持物的分配層析法,展層溶劑由有機溶劑和水組成。濾紙纖維上的羥

2、基具有親水性,在濾紙上水就被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相。當有機溶劑（流動相）沿紙流動經(jīng)過層析點時,層析點上溶質(zhì)就在水相和有機相之間不斷進行分配。由于溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)不同，移動速率也不同，因而可以彼此分開。井麗茅數(shù)K-溶質(zhì)在固定相中的濃度一溶質(zhì)在流動相中的滾厲物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的移動速率用Rf值來表示:原點到層析點中心的距離原點到溶鈿前沿的距離珞刑前沿上行法層桿示意13、在一定條件下，物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關。4、本實驗利用紙層析法分離氨基酸，利用茚三酮反應將氨基酸層析點顯色來鑒定氨基酸的種類。試劑:1、

3、酸性展層劑正丁醇：88%甲酸:水=15:3:2V/V2、顯色儲備液:0.4mol/L茚三酮-異丙醇：甲酸:水=20:1:53、標準氨基酸溶液（6mg/ml,苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、組氨酸His）4、未知樣品液：上述4種氨基酸中的一種或幾種混合液（每組任選一個樣品）實驗器材：、濾紙、燒杯3、剪刀4、毛細管5、層析缸6、微量注射器7、電吹風8、保鮮膜操作方法：一、點樣1、量取30ml層析溶劑、1ml顯色貯備液于層析缸中，混勻密閉，靜置。（展層缸洗凈后應除去多余的水，否則會影響展層溶劑的比例而影響展層）2、戴好手套，在桌上鋪好一層保鮮膜。取一張干凈濾紙，將其剪裁為18cmX14c

4、m。在紙的一端距邊緣2cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，在此直線上等距離分出幾個點作為點樣原點。（點樣操作時應戴手套，防止樣品及濾紙受污染）3、用毛細管將標準氨基酸及未知樣品分別點在點樣點上，每次點樣后用電吹風冷風吹干再點下一次，點樣點直徑不超過5mm。二、層析與顯色1、將濾紙卷成圓柱形，用針線縫合或釘書針固定成圓筒狀，紙的兩邊不能接觸。2、將濾紙豎直放入盛有展層劑的層析缸中，迅速蓋緊層析缸蓋（點樣點的一端在下，展層劑液面需低于點樣線1cm左右。3、待溶劑前沿線距濾紙末端12cm（展層長度10cm，約2hr）時，取出濾紙（需帶上手套）4、用鉛筆將前沿線作一標記。剪去縫合線，電吹風熱風吹千（通風櫥中進

5、行），即可見層析斑點。結(jié)果處理：用鉛筆將層析圖譜上的斑點圈出，分別測量點樣點到層析點中心和點樣點到溶劑前沿的距離。計算各種標準氨基酸的Rf值，并根據(jù)樣品分離的情況鑒定混合樣品中氨基酸的組分。、點樣點1-His2-Phe3-Gly4-Pro5-A18距離/cm一、點樣點到層析點中心0.85.61.63.60.9/3.9/6.2點樣點到溶劑前沿&6&6&5&6&6Rf(His)=0.8/8.6=0.093Rf(Phe)=5.6/8.6=0.651Rf(Gly)=1.6/8.5=0.188Rf(Pro)=3.6/8.6=0.419樣品：下：Rf=0.9/8.6=0.105中：Rf=3.9/8.6=0.453上：Rf=6.2/8.6=0.721混合樣品中氨基酸的組分為：His、Pro、Phe誤差分析：1、樣品點樣不足，顯色不明顯。2、點樣時溫度較高，氨基酸濃度發(fā)生變化。3、濾紙邊緣不齊，影響氨基酸擴散速度。4、顯色時，熱風溫度不夠，顯色不明顯。5、測量不精確，擴散距離存在誤差。注意事項：1、嚴格控制點樣位置以及點樣直徑，防止層析后氨基酸斑點過度擴散和重疊，同時點樣點應高于展層劑液面。2、點樣時宜采用冷風吹干。3、展層劑需臨用時配制，以免發(fā)生酯化而影響層析結(jié)果。展層劑比例應保持不變，因此展層缸應保持干燥。4、若樣品中溶質(zhì)種類較