微透析技術(shù)與方法-研究生課件

1、微透析技術(shù)與方法洪 宗 元皖南醫(yī)學(xué)院定量藥理研究所微透析技術(shù)是一種微量化學(xué)采樣與檢測(cè)技術(shù)微透析技術(shù)微透析系統(tǒng)組成微透析技術(shù)原理微透析技術(shù)特點(diǎn)透析相關(guān)儀器及透析液微透析實(shí)驗(yàn)操作微透析實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)二、微透析技術(shù)原理微透析探頭是由具有一定截留分子量的纖維半透膜制成(microdialysis probe，MDP)；將探頭埋入待測(cè)的組織區(qū)域，以恒定速度向探頭內(nèi)灌注與組織液成分相近的等滲灌流液；當(dāng)灌流液流經(jīng)探頭前端透析膜時(shí)，組織內(nèi)小分子量生物活性物質(zhì)即順濃度梯度從膜外擴(kuò)散入膜內(nèi)，并隨灌流液被引流至探頭外；按一定的時(shí)間間隔連續(xù)收集透析液，檢測(cè)其中待測(cè)生物活性物質(zhì)水平，可監(jiān)測(cè)該區(qū)域內(nèi)細(xì)胞外生物活性物質(zhì)濃度

2、的經(jīng)時(shí)變化過(guò)程微透析技術(shù)原理優(yōu)點(diǎn)組織損傷小、取樣少、方便、快捷、可連續(xù)監(jiān)測(cè)且易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。微透析系統(tǒng)示意圖-Anesthesized ratsAnesthesized ratsMDP：常用管式半透膜與不銹鋼、石英或塑料毛細(xì)管構(gòu)成，半透膜由再生纖維素、聚碳酸脂或聚丙烯腈制成。截留分子量 5,000-100,000 dolton不等。適合神經(jīng)遞質(zhì)等小分子物質(zhì)通透，而蛋白質(zhì)難以通透 ；三、微透析技術(shù)特點(diǎn)灌流液：腦微透析的灌流液一般采用人工腦脊液 (artificial cerebral spinal fluid, aCSF)、Ringer或 Krebs 溶液；（一）微透析探針組成成分：小口徑的

3、透析膜、硅管、防水萬(wàn)用膠、硅膠毛細(xì)管 1.橡膠管；2.硅膠管（silica tubing）粗管；3.硅膠管（silica tubing）細(xì)管；4.聚乙烯管(PE-10 (polyethylene tubing)；5.透析膜（Dialysis membrane）；6.環(huán)氧乙烷（epoxy adhesive）；7.注射針頭。四、透析相關(guān)儀器及透析液 （三）透析液轉(zhuǎn)換器Carnegie Medicine 公司發(fā)展了一個(gè)全自動(dòng)的透析液轉(zhuǎn)換器 CMA/110 及 CMA/111。因這個(gè)機(jī)器有微調(diào)的功能，馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的設(shè)備，來(lái)轉(zhuǎn)換透析液，在轉(zhuǎn)換過(guò)程中不會(huì)讓空氣進(jìn)入。 （四）透析液收集1.手動(dòng)收集透析液 雖然耗

4、時(shí)間，但可使一臺(tái) HPLC 發(fā)揮最大功用。例如收集時(shí)間要 20 分鐘，測(cè)定一個(gè)樣品只要 7-8 分鐘，則一臺(tái) HPLC 力足以應(yīng)付 3 種樣品；使樣品分離和分析很明確2.自動(dòng)收集器 (CMA/140) 按一定間間隔將透析液收集在冷藏（refrigerated）設(shè)備的旋轉(zhuǎn)盤(pán)上的玻璃小瓶?jī)?nèi),這就不需在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中一直看守著儀器。但就無(wú)法一邊收一邊分析透析液3.在線收集與檢測(cè) (Online)將探針出口直接連到 HPLC 的承載閥（load-valve）上，而直接在線上自動(dòng)分析透析液。即把一臺(tái) HPLC 限制在單一動(dòng)物身上，使透析實(shí)驗(yàn)全自動(dòng)化（五）灌流液 (perfusate) 1. Ringers

5、solution： 140 mM NaCl 3.0 mM KCl 1.2-3.4 mM CaCl2 1.0 mM MgCl2 1.2 mM Na2HPO4 0.27 mM NaH2PO4 7.2 mM glucose pH 7.42. 人工腦積液 (artificial cerebrospinal liquid, aCSF) 147 mM Na+ 4.0 mM K+ 2.0 mM Ca2+大多數(shù)微透析使用的透析液，都含有1-3.4 mM 濃度的鈣離子。動(dòng)物組織不同區(qū)域，鈣離子濃度從1-3 mM 不等。透析液中含有3.4 mM 和含有1.2 mM 鈣離子時(shí)，對(duì)藥物引起的 DA 變化，會(huì)有定量的（

6、quantitative）不同。目前我們雖知透析液中鈣離子的含量，對(duì)單胺的釋出有影響，但影響的程度則未知。組織間的不同差異，鈣離子可能是一個(gè)影響因素。 （六）透析液中鈣離子的濃度（二）微透析探針植入前的準(zhǔn)備1.手術(shù)前，將透析探針（儲(chǔ)存在干的狀態(tài)下）連上透析系統(tǒng)，并安置在立體定位儀的把手。2.將把手夾在一個(gè)小蒸餾架上，將探針浸到含有透析液的燒杯中，使透析膜完全浸濕和微微張開(kāi)。一旦透析膜弄濕后，就不可將透析膜移出溶液，因?yàn)橥肝瞿じ傻艉?，?huì)影響單胺的回收率。3.檢查透析膜，確定它是流通而不滲漏的；并排空系統(tǒng)內(nèi)氣體。 （三）麻醉1.非復(fù)原性（急性實(shí)驗(yàn) acute preparation）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中，用

7、加溫毯或臺(tái)燈將動(dòng)物體溫維持在 37 C。手術(shù)（30min），然后等 2 小時(shí)作基礎(chǔ)值測(cè)定期（baseline period）,看(單胺釋出量)有否趨于穩(wěn)定，然后藥物注射之后，繼續(xù)測(cè)定 2 小時(shí)左右的給藥測(cè)定期（post-drug）。用 chloral hydrate 或 urethane麻醉，麻醉時(shí)間較長(zhǎng)六、微透析實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng) （一）組織損害 腦組織急性植入小導(dǎo)管或探針，導(dǎo)致立即地，但數(shù)分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)可恢復(fù)的變化，如在探針鄰近區(qū)域， 組織被壓凹， 血腦障壁被破壞， 葡萄糖代謝受影響， 神經(jīng)元損害微透析探針植入幾天，透析膜附近的組織，立即發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)（gliotic）反應(yīng)，結(jié)果造成炎癥細(xì)胞和結(jié)締組織覆蓋在半透膜上，形成障壁（barrier