hTERT激活人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞端粒酶活性

1、hTERT激活人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞端粒酶活性【關(guān)鍵詞】人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基因Keyrds：hTERT;telerase;huanbnearresenhyesteell;gene髓間充質(zhì)干細(xì)胞(huanbnearresenhyesteell，hBS)目前作為組織工程的種子細(xì)胞，在根底研究與臨床中得到廣泛應(yīng)用。但是也存在許多問(wèn)題13，在根底研究中存在如何得到純化，甚至標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞系，使各實(shí)驗(yàn)室之間以及實(shí)驗(yàn)室前后研究之間具有可比性和延續(xù)性的問(wèn)題；在臨床生物工程應(yīng)用中存在細(xì)胞老化、去分化，以及生物工程化器官過(guò)程中，如何獲得足夠數(shù)量的種子細(xì)胞的問(wèn)題3。細(xì)胞培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于根底研究、臨床理

2、論和生物工程4。然而，正常組織來(lái)源的細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下經(jīng)過(guò)有限次的傳代后，就會(huì)停頓分裂增殖，發(fā)生衰老和死亡5，這就限制了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，學(xué)者們提出建立永生化細(xì)胞系，使體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有無(wú)限增殖才能。研究說(shuō)明，端粒酶的激活可以延緩細(xì)胞的衰老，甚至使細(xì)胞永生化6,7。TERT作為端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶，與細(xì)胞端粒酶的活性上下親密相關(guān)8。本實(shí)驗(yàn)將外源性人TERT(huantelerasereversetransriptase，hTERT)基因轉(zhuǎn)染至克隆培養(yǎng)的hBS中，以明確hTERT能否調(diào)控其端粒酶活性，為建立永生化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系奠定基矗1材料和方法1.1主要試劑與材料1.2

3、方法1.2.3hTERTRNA的表達(dá)用Trizl裂解沉淀細(xì)胞后，提取總RNA。根據(jù)hTERT的RNA序列(GeneBank)和參考文獻(xiàn)10,11，設(shè)計(jì)PR擴(kuò)增的兩條引物：上游5-GAAAATTAAGGTG-3和下游5-GATGAAGTGTATA-3，預(yù)期產(chǎn)物片段為175bp。采用TitanTneTubeRT-PRKit進(jìn)展RT-PR檢測(cè)hTERTRNA的表達(dá)。RT-PR參數(shù)為：5030in；9410s，6030s，6845s，10個(gè)循環(huán)；9410s,6030s，682in，25個(gè)循環(huán)；68，7in。1.2.4hTERT蛋白的表達(dá)參照文獻(xiàn)12,13，以三去污劑裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，經(jīng)

4、核酸蛋白分析儀定量后，每孔上樣量為50g，進(jìn)展hTERT的esternBlt分析。采用esternBlttingLuinlReagent測(cè)試劑盒顯色。同時(shí)，取細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定后，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)展細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色，免疫熒光顯色。2結(jié)果2.1質(zhì)粒擴(kuò)增和酶切鑒定2.2細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染圖2轉(zhuǎn)染后BSs的G418抗性克隆形成17d觀察2.3hTERTRNA的表達(dá)2.4hTERT蛋白的表達(dá)esternBlt檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞在124ku左右見(jiàn)特異性條帶，為hTERT蛋白，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞未能檢測(cè)到該蛋白(圖4)。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示hTERT蛋白定位于細(xì)胞核(圖5)。2.5端粒酶活性端粒酶檢測(cè)結(jié)果

5、，圖6說(shuō)明原代BS仍然存在一定端粒酶活性，但是活性較低。轉(zhuǎn)染后BSs端粒酶活性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，并且持續(xù)保持陽(yáng)性表達(dá)，其活性可到達(dá)人胚腎細(xì)胞系的程度。圖6端粒酶活性比擬3討論端粒是真核細(xì)胞染色體末端富含G的DNA重復(fù)序列，由DNA及其相關(guān)蛋白組成，雖不含基因，但是在穩(wěn)定染色體方面具有重要作用14,15。端粒酶是一種能延長(zhǎng)端粒末端的核酸蛋白酶，由蛋白質(zhì)和RNA組成，可以以其自身的內(nèi)源性RNA為模板，發(fā)揮RNA指導(dǎo)的DNA合成作用，向端粒末端添加(TTAGGG)n序列，使端粒延長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命。正常情況下，除了一些生殖細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性以外，其他體細(xì)胞都不表達(dá)端粒酶活性6。如今已經(jīng)明確人

6、端粒酶由3個(gè)局部組成17:(1)端粒酶自身的RNA模板：端粒酶以自身RNA為模板，以端粒的3-verhang為引物，在端粒的末端加上新的重復(fù)序列，使端粒延長(zhǎng)。在多種人體正常組織中均有人端粒酶RNA的表達(dá)；2)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)：是端粒酶的活性部位。eyersn等18克隆出人的編碼端粒酶催化亞基的DNA，hTERTRNA在大多數(shù)缺乏端粒酶活性的正常體細(xì)胞中不能檢測(cè)到；3)端粒酶的相關(guān)蛋白：TP1TLP1基因編碼端粒酶的相關(guān)蛋白，和端粒酶的活性沒(méi)有必然的聯(lián)絡(luò)，詳細(xì)功能尚不清楚。上述3個(gè)組成局部中hTERT是恢復(fù)端粒酶活性的關(guān)鍵。然而，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)hTERTRNA在組織分布上與端粒酶活性并

7、不完全一致19，而且端粒酶的組成和構(gòu)造至今尚未完全明確。另外，端粒酶活性受到復(fù)雜機(jī)制的調(diào)節(jié)，在不同層次上存在各種調(diào)節(jié)因素，如端粒長(zhǎng)度變化、端粒酶RNA和蛋白組分、癌基因和抑癌基因、細(xì)胞分化和細(xì)胞周期等。所以，目前還不能斷定hTERT與端粒酶激活的必然聯(lián)絡(luò)，即并不是每一種細(xì)胞轉(zhuǎn)染hTERT基因均可激活該細(xì)胞的端粒酶活性。為了明確在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中導(dǎo)入外源性hTERT能否調(diào)控端粒酶活性，作者克隆培養(yǎng)hBS9，導(dǎo)入克隆至真核表達(dá)載體pIne的hTERT基因。G418挑選20d后形成抗性細(xì)胞克隆，移液槍轉(zhuǎn)移，擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞端粒酶活性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。因此，作者認(rèn)為在hBS中，導(dǎo)入外源性hTERT可以激活端粒酶，其活性可到達(dá)人胚腎細(xì)胞系的程度。目前，有關(guān)端粒和端粒酶的研究主要集中在腫瘤的基因治療上20，抑制端粒酶活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。借用這一思路，反之，構(gòu)建hTERT真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的細(xì)胞，使細(xì)胞在體外培養(yǎng)的生命期延長(zhǎng)，用于構(gòu)建組織工程化標(biāo)準(zhǔn)種子細(xì)胞系，可能是解決體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖困難、傳代時(shí)間短、細(xì)胞衰老的方法之一，且hTERT真核表達(dá)質(zhì)