鈣蛋白酶抑制劑對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

1、鈣蛋白酶抑制劑對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用【摘要】目的:研究alpain抑制劑ALLN對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法:45只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常灌注組、缺血/再灌注組、ALLN+正常灌注組、ALLN+缺血/再灌注組和二甲亞砜+缺血/再灌注組,分別檢測再灌注15in時冠狀動脈流出量F和冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)漏出量，熒光分光光度計測定熒光強(qiáng)度來反映alpain活性，免疫印跡法檢測心肌細(xì)胞alpain蛋白表達(dá)量，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡率，并計算凋亡指數(shù)。結(jié)果：同缺血/再灌注組相比，ALLN+缺血/再灌注組F顯著增高P0.01，LD

2、H漏出量、alpain活性和蛋白表達(dá)量、胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度和細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低P0.01。結(jié)論:ALLN對離體心臟缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用,可能與其抑制alpain活性，從而減輕alpain對細(xì)胞的損傷，減輕了細(xì)胞內(nèi)鈣超載有關(guān)。【關(guān)鍵詞】鈣蛋白酶；缺血再灌注損傷；鈣離子；凋亡鈣蛋白酶alpain是半胱氨酸異源二聚體蛋白酶，廣泛存在于包括心臟在內(nèi)的各種組織細(xì)胞中，在體內(nèi)alpain可被鈣離子激活后對特定的底物進(jìn)展限制性水解，參與了細(xì)胞增殖、分化、遷移和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等多種生物學(xué)功能1。alpain的異常激活那么參與了許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如神經(jīng)退行性并外傷性腦損傷和脊髓損傷等，而對其在心臟病理條件下

3、的作用研究不是很多。本試驗(yàn)利用alpain特異性抑制劑，觀察其對離體大鼠心臟缺血/再灌注(isheia-reperfusin,I/R)損傷的影響，旨在討論alpain在I/R損傷中作用及可能的機(jī)制。1材料與方法1.1材料1.1.1主要試劑和儀器alpain抑制劑(ALLN)、N-Suinyl-Leu-Tyr-A、A、alpain單克隆抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗、FLU-3/AFIT(美國Siga公司)，esternblttingEL發(fā)光試劑盒美國Piere公司，膠原酶型美國Ares公司，GAPDH單克隆抗體上海康成生物公司，其它試劑為國產(chǎn)分析純。FASAria流式細(xì)胞儀美國BD公司，Lang

4、endrff離體灌流裝置由揚(yáng)州醫(yī)院心血管病研究所提供，熒光分光光度計日立，F(xiàn)-4500，電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像系統(tǒng)均為Bi-Rad公司產(chǎn)品。1.1.2實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)動物為成年雄性SD大鼠，250300g，由揚(yáng)州大學(xué)動物比擬中心提供。1.2方法1.2.1離體大鼠心臟I/R模型的制備和分組(1)模型制備：SD大鼠,3%戊巴比妥鈉30gkg-1及肝素500Ukg-1腹腔注射,麻醉后無菌條件下摘取心臟,在4的Kerbs-HenselEitK-H液中迅速行主動脈插管并與Langendrff逆灌裝置連接，用以95%2、5%2達(dá)飽和的K-H液行逆行恒溫恒壓灌注，整個試驗(yàn)過程中溫度控制在(370.5)、pH(

5、7.40.5),灌注壓90H2，并于灌注過程中持續(xù)通入95%2、5%2混合氣體。(2)分組：心臟復(fù)跳成功后平衡15in隨機(jī)分為以下5組，每組9只。正常灌注組ntrl組,離體大鼠心臟用K-H液灌注85in。I/R組,離體大鼠心臟用K-H液先灌注15in后停頓灌注30in，然后再用K-H液恢復(fù)灌注40in。ALLN+ntrl組,離體大鼠心臟用含10lL-1ALLN的K-H液先灌注15in，后用K-H液恢復(fù)灌注70in。ALLN+I/R組，用含10lL-1ALLN的K-H液先灌注15in，然后停頓灌注30in，接著再用K-H液恢復(fù)灌注40in。二甲亞砜(DS)+I/R組，用含0.3%DS的K-H液先

6、灌注15in，然后停頓灌注30in，接著再用K-H液恢復(fù)灌注40in。1.2.2乳酸脫氫酶(LDH)和冠狀動脈流出量(F)的測定搜集再灌注15in時單位時間內(nèi)的F，并應(yīng)用日立全自動生化分析儀測定冠脈流出液中LDH的漏出量。1.2.3心肌勻漿制備去除心房和右心室，將剩余的心臟組織剪碎后參加10lg組織-1勻漿液10lL-1NaH3，5lL-1NaN3，15lL-1Tris-Hl，pH6.8，制成勻漿后離心10919g，20in，搜集上清，分裝儲存于-70，以上操作均在4進(jìn)展，蛋白濃度采用Bradfrd法測定。1.2.4alpain活性測定我們以N-Suinyl-Leu-Tyr-Aalpain特異

7、性作用底物與alpain反響釋放出A的熒光強(qiáng)度來代表不同樣品中alpain的活性2。取150l的心肌勻漿液，參加1l的反響緩沖液145lL-1Nal,100lL-1Tris-Hl，pH7.337水浴箱中振蕩10in,再參加150l的500lL-1的N-Suinyl-Leu-Tyr-A，在37水浴箱中振蕩60in后取1l參加比色皿，在熒光分光光度計上用波長為360n的光線激發(fā)后，測定在440n處發(fā)射的熒光強(qiáng)度。用濃度的A作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得的結(jié)果以ngAin-1(g蛋白)-1表示。1.2.5esternbltting測定alpain蛋白表達(dá)取40g變性蛋白(心肌勻漿液)經(jīng)12SDS-聚丙烯酰胺凝膠電

8、泳，然后將膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(電壓50V，2h)，轉(zhuǎn)膜后5脫脂奶粉4封閉過夜，洗膜3次，每次10in，洗膜后與11000稀釋的alpain單克隆抗體37結(jié)合2h，洗膜3次，每次10in，然后用14000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗37結(jié)合2h，洗膜3次，每次10in，以上的洗膜均在搖床上進(jìn)展，洗膜所用液體均為PBS+0.05Teen-20。最后用化學(xué)發(fā)光試劑EL顯色，X光膠片曝光，顯影，定影。用同樣的方法做內(nèi)參GAPDH的esternbltting免疫印跡一抗13500,辣根過氧化酶標(biāo)記二抗15000，X光膠片采用Bi-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)展掃描，并用自帶的Quantityne分析軟件對結(jié)

9、果進(jìn)展定量分析，各組alpain條帶與各自對應(yīng)的內(nèi)參GAPDH的積分光密度值的比值作為結(jié)果。1.2.6心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子及凋亡的測定再灌注完畢后，每組隨機(jī)取3枚心臟采用酶分解法制備成年大鼠心肌細(xì)胞3，調(diào)整細(xì)胞濃度至2106l-1，在相差顯微鏡下可見心肌細(xì)胞呈細(xì)長桿狀，邊緣光滑，橫紋明晰。(1)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定：每組樣品中參加適量的FLU-3/A液終濃度為5lL-1，混勻后避光37振蕩30in，去除負(fù)載液，用D-Hanks液洗滌3次，流式細(xì)胞儀參數(shù)設(shè)置激發(fā)波長488n，發(fā)射波長526n，每組樣品取10000個細(xì)胞，以平均熒光強(qiáng)度代表各組細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度。FLU-3/A用DS配制，混勻后-20

10、保存。(2)凋亡的測定：按照Annexin-FLUSStainingKIT使用說明，取30lAnnexin-染料參加到1.5l的結(jié)合緩沖液中，再參加30lPI染料，充分混勻。每個細(xì)胞樣品中參加100l的混合染料，混勻，避光室溫放置15in。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。結(jié)果斷定Annexin-PI-為正常細(xì)胞，Annexin-+PI-為凋亡細(xì)胞，Annexin-+PI+為壞死細(xì)胞。每組樣品取10000個細(xì)胞，計算Annexin-+PI-細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)。1.3統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)以x-s表示，應(yīng)用SPSS115統(tǒng)計軟件分析處理，并采用單因素方差檢驗(yàn)(ANVA)分析組間差異的顯著性。假

11、設(shè)差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，進(jìn)一步進(jìn)展兩兩比擬(SNK法)，P005表示兩組間具有顯著差異。2結(jié)果2.1各組間再灌注15in時F和LDH比擬與ntrl組相比，I/R組和DS+I/R組的F顯著降低(P0.01)，LDH顯著升高(P0.01)；ALLN+I/R組與I/R組比F顯著升高(P0.01)，LDH顯著降低(P0.01)，與ntrl組比，差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；此外，DS+I/R組與I/R組，ALLN+ntrl組與ntrl組之間F、LDH差異無統(tǒng)計學(xué)意義P0.05。見表1。表1各組再灌注15in時F和LDH比擬2.2各組間alpain活性比擬I/R組alpain活性為0.36550.00

12、17，明顯高于ntrl組的0.13600.0022(P0.01、ALLN+ntrl組的0.12140.0014(P0.01)、ALLN+I/R組的0.15470.0030(P0.01),而與DS+I/R組的0.36280.0021之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。而ntrl組與ALLN+ntrl組、ALLN+I/R組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義P0.01。見表2。表2各組alpain活性及alpain蛋白表達(dá)的比擬轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3各組間alpain蛋白表達(dá)比擬I/R組alpain/GAPDH2.340.20明顯高于ntrl組0.730.13、ALLN+ntrl組0.640.07和ALL

13、N+I/R組1.190.14)，均為P0.01;ALLN+I/R組雖顯著低于I/R組，但與ntrl組仍有統(tǒng)計學(xué)差異P0.01;ntrl組與ALLN+ntrl組、I/R組與DS+I/R組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義P0.05，見表2。蛋白印跡結(jié)果見圖1。1.ntrl組；2.ALLN+ntrl組;3.ALLN+I/R組；4.I/R組;5.DS+I/R組圖1各組大鼠心肌alpain和內(nèi)參GAPDH蛋白印跡Fig1TheprtEinbltfalpainandGAPDHinallgrups2.4各組間細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度比擬I/R組與DS+I/R組明顯高于其他各組P0.01，但它們兩組之間無明顯差異P0.05;AL

14、LN+I/R組雖顯著低于I/R組，但與ntrl組比擬仍有統(tǒng)計學(xué)差異P0.01;ntrl組與ALLN+ntrl組之間無明顯差異P0.05。見圖2。2.5各組間細(xì)胞凋亡指數(shù)的比擬與I/R組相比，ntrl組、ALLN+ntrl組和ALLN+I/R組的細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低P0.01;DS+I/R組與I/R組相比無明顯差異P0.05;ALLN+I/R組雖顯著低于I/R組，但與ntrl組相比仍有統(tǒng)計學(xué)差異P0.01;ntrl與ALLN+ntrl組之間無顯著差異P0.05。見圖3。3討論心肌I/R損傷一直是臨床和根底研究的熱點(diǎn),其發(fā)活力制可能與再灌注期自由基生成過多、鈣超載、微血管損傷和能量生成缺乏等有關(guān)

15、，其中鈣超載可通過以下機(jī)制引起心肌細(xì)胞功能障礙：(1)導(dǎo)致線粒體功能障礙。(2)引起心律失常。(3)使肌原纖維攣縮、斷裂。(4)激活許多鈣依賴的酶系統(tǒng)，如磷脂酶，可促進(jìn)膜磷脂水解，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器質(zhì)膜受損，此外還可激活alpain,后者是半胱氨酸異源二聚體蛋白酶，其家族包括具有組織特異性的n-alpain和非組織特異性的-alpain和-alpain。其中-alpain和-alpain分布廣泛且生化和催化特性非常相似，但兩者激活表現(xiàn)半最高活性所需鈣離子濃度不同，前者需120lL-1,后者需250750lL-1。alpain活性主要受alpain-激活蛋白，alpain-抑制蛋白alpasta

16、tin、鈣離子、PKA的磷酸化以及亞硝基化調(diào)節(jié)4-5。本試驗(yàn)中我們利用離體心臟Langendrff灌流模型，測量了再灌注15in時的F和冠脈流出液中LDH的漏出量，并利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)鈣程度和細(xì)胞的凋亡程度，從而綜合評價心臟損傷程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I/R組較ntrl組損傷明顯，證實(shí)我們離體大鼠心臟I/R模型構(gòu)建成功，假設(shè)在I/R前預(yù)先使用10lL-1的ALLN可明顯減輕I/R所致的損傷，但與ntrl組仍有差異，這些提示ALLN通過抑制alpain活性，一定程度上減輕了I/R所致的細(xì)胞壞死和凋亡，這與國外一些研究是相符的。Barta等6試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)心肌纖維組成蛋白和骨架蛋白均可被alpain降解，

17、其中相對分子質(zhì)量為284000的胞襯蛋白(fdrin)和相對分子質(zhì)量為30000003300000的肌聯(lián)蛋白nnetin對alpain最敏感，所有這些蛋白的水解都將損傷心臟功能，而ALLN可減輕這種損傷。hen等7通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了a2+i的增加可以激活alpain，后者水解Bid形成tBid(截短的Bid)，促使了BAX/BAK易位和寡聚化，促使細(xì)胞色素的釋放，而ALLN可以阻止Bid活化所造成的細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步研究alpain在I/R中的作用，我們利用alpain特異性熒光底物以及免疫印跡法分析了各組alpain活性和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)alpain活性在I/R組明顯高于ntrl組，而預(yù)先

18、使用ALLN可使alpain活性明顯降低，但令人驚奇的是，該組細(xì)胞內(nèi)鈣程度較I/R組也顯著降低，此前Arstrng等8試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),激活的alpain可以蛋白水解肌漿網(wǎng)膜骨架上的-fdrin，從而增加肌漿網(wǎng)的脆性，這些在再灌注的前幾分鐘持續(xù)惡化，使肌漿網(wǎng)對心肌細(xì)胞內(nèi)鈣的處理才能趨于崩潰，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生。由于心肌肌漿網(wǎng)是控制心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)9及我們的試驗(yàn)結(jié)果，我們提出以下假設(shè)：在I/R損傷中，細(xì)胞內(nèi)alpain激活后發(fā)揮其蛋白酶的功能，損害肌漿網(wǎng)的功能，造成細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的失調(diào)，加重鈣超載，而增加的鈣離子又可以進(jìn)一步激活alpain，從而形成一惡性循環(huán)，而ALLN可

19、以打斷這種循環(huán)，一定程度緩和了鈣超載，從而保護(hù)了細(xì)胞，這方面我們將在下一步試驗(yàn)中繼續(xù)研究。關(guān)于alpain蛋白表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)alpain蛋白量與活性相一致，這提示在I/R損傷中alpain蛋白表達(dá)是增加的。此外為排除溶劑DS對試驗(yàn)的影響，我們增加DS+I/R組，其各項指標(biāo)與I/R組相比無明顯差異。綜上所述，我們認(rèn)為10lL-1ALLN可一定程度緩和I/R引起的細(xì)胞壞死和凋亡，作用機(jī)制可能與其抑制alpain活性，從而減輕alpain對細(xì)胞的損傷，維持了細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1SAEZE,RAIREZ-LRAR,RNFJ,etal.Thetherapeutiptentialfth

20、ealpainfaily:neaspetsJ.DrugDisvTday,2022，11(19-20):917-923.2HEN,NDJ,KRAJESKIS,etal.alpainandithndriainisheia/reperfusininjuryJ.JBilhe,2002,277:29181-29186.3BUGAISKYLB,ZAKR.DifferentiatinfadultratardiayytesinellultureJ.irRes,1989,64(3):493-500.4SANADAS,ASANUAH,TSUKAT,etal.PrtEInkinaseAasantherediatrfisheiprenditiningindependentfprteinkinaseJ.irulatin，2022，110:51-57.5HHANPK,SINGHRB,DHALLANS,