重組dna技術20110413 分子生物學

1、重組DNA技術(DNA克隆或分子克隆) DNA Recombination Technique ( DNA Cloning or Molecular Clone) 第二章1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗:從S型細菌中分別抽提出DNA、蛋白質和莢膜物質，并把每一種成分同活的R型細菌混合，懸浮在合成培養(yǎng)液中。結果發(fā)現(xiàn)只有DNA組分能夠把R型細菌轉變成S型細菌重組DNA技術的發(fā)展史O. T. Avery（1944年）證明，遺傳信息的攜帶者是DNA；1953年, Watson和Crick提出了DNA分子的雙螺旋結構模型1958年,Meselson和Stahl證實了DNA的半保留復制同年

2、， Crick提出遺傳信息傳遞的“中心法則”1961年， F. Jacob和J. Monod提出了操縱子模型1966年，Nirenberg等人破譯了氨基酸的64個遺傳密碼1972年，P. Berg等率先完成DNA體外重組(諾貝爾化學獎)1973年，S. Cohen等進一步實現(xiàn)了重組DNA的轉化1977年 美國南舊金山建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年，第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠。1982年，美國FDA批準首例基因工程產品-人胰島素1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉。人體生長激素釋放激素(SS)抑制和調節(jié)多種激素的作用從動物

3、腦中提取:5mg-50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌 培養(yǎng)液相關概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因載體基本原理 重組DNA技術與醫(yī)學的關系主要內容：第一節(jié)、重組DNA技術相關概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology克隆(clone):是指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細胞或個體所組成的群體獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一） DNA克隆技術水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 細胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮┦窃隗w外將不同來源的特異基因或DN

4、A片段插入病毒、質?；蚱渌d體分子，構建重組DNA分子，然后將重組DNA導入到合適的受體細胞中，使其在細胞中擴增和繁殖（稱之為“克隆”），篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子(recombinant DNA, chimera DNA） ，即DNA克隆，因此DNA重組技術又稱為DNA克?。―NA cloning）。DNA克隆生物技術工程: 基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等 基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學或重組DNA技術(recombination DNA techni

5、que)，基因操作(gene manipulation)、遺傳工程(genedc engineering)。(二)目的基因進行DNA重組的目的主要有兩方面： 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）這些使我們感興趣的基因或DNA序列就是目的基因(target DNA)。目的基因有兩種類型： cDNA(complementary DNA):在體外經反轉錄合成的與mRNA互補的DNA?；蚪MDNA(Genomic DNA):代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。(三)載體一.表達載體(expression vector):為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成

6、 多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。二.克隆載體(Cloning vector):為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。第二節(jié) 重組DNA技術操作的基本過程基本原理目的基因的獲取DNA導入受體細胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達 重組DNA技術操作過程可形象歸納為： 分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉轉入受體細胞篩篩選重組體 目的基因基因載體重組體分切接轉篩表總體技術路線 以 質 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程第三節(jié) 重要的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DN

7、A中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基一.限制性核酸內切酶(restriction endonuclease)

8、 限制性核酸內切酶(restriction endonuclease, RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定義：第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶、（基因工程技術中常用型）分類： 型限制性核酸內切酶的作用特點 回文結構(palindrome) 大部分型限制酶能夠識別由4個8個核苷酸組成的

9、特定序列。型酶識別具有回文結構的核苷酸序列（圖2-2）?！盎匚摹币鉃轫樧x和倒讀都一樣的詞語切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功異源酶：有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(comp

10、atible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶名稱 識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產生突出末端:BamH 5GGATCC.3Bgl 5AGATCT.3EcoR 5GAATTC.3Hind 5AAGCTT.3 Hpa 5CCGG.3 Mbo 5GATC.3 Nde 5GATATG.3切割后產生3突出末端:Apa 5GGGCCC.3Hae 5PuGCGCPy.3Kpn 5GGTACC.3Pst 5CTGCAG.3Sph 5GCATGC.3切割后產生平末端:Alu 5A

11、GCT.3EcoR 5GATATC.3Hae 5GGCC.3Pvu 5CAGCTG.3Sma 5CCCGGG.3 限制性內切核酸酶二、DNA連接酶(基因工程的“縫紉針”) ： 1. T4噬菌體DNA連接酶：兩個不同片段雙鏈DNA存在互補粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。 DNA連接反應都是由T4DNA連接酶介導 2. 大腸桿菌DNA連接酶:不能催化平末端DNA分子的連接 三、DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大腸桿菌DNA聚合酶I具有三種酶活性。 Klenow片段具有二種酶活性（去除5 3外切酶活性）。2. Taq DNA

12、聚合酶: 耐熱（75-80），分子量65kD,也具5 3外切酶活性。反轉錄酶(RDDP):多功能酶，無3 5DNA外切酶活性，具有3 5RNA外切酶活性。工 具 酶功 能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA

13、聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第四節(jié) 常用載體 定義載體是攜帶目的基因進入宿主細胞擴增和表達的工具。具備的條件:具有自主復制能力有多個單一限制性內切酶的酶切位點（MCS）具有選擇性遺傳標記分子量小拷貝數(shù)高（10個200個/細胞）具有較高的遺傳穩(wěn)定性。 常用載體:質粒DNA噬菌體DNA病毒DNAEcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ Oriori pUC19質粒載體圖 質粒 (plasmid):是

14、細菌內攜帶的染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA，能獨立進行復制。特點: 1.分子量相對較小能在細菌內穩(wěn)定存在，能在宿主細胞內獨立自主復制；有較高的拷貝數(shù)。2.具有一個以上的遺傳標志，便于在宿主細胞進行選擇。3.具有多個限制性酶的單一切口，稱為多克隆位點。便于外源基因的插入。常用質粒載體（一） pBR322質粒：由一系列大腸桿菌質粒DNA通過重組技術構建成，長度為4.36kb，特點：（1）含有復制起始點和復制調節(jié)信號；（2）有單個EcoRI酶切位點，可切開插入目的基因；（3）有抗四環(huán)素基因Ter+和抗氨芐青霉素基因 Amp+，便于重組體細胞的篩選。1.抗藥性標記選擇（二） pUC系列載體:由pBR質粒

15、與M13噬菌體構建而成，長度為2.674kb，特點：具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。 “藍白斑”篩選: pUC載體中的LacZ基因可編碼-半乳糖苷酶（-Gal）N端的-肽鏈，該-肽與宿主細胞(如E.coli JM109）中F因子上的LacZM15基因（-肽缺陷型）的產物互補，產生完整的、有活性的-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成藍色菌落。當外源基因插入MCS后，LacZ-肽基因的讀碼框被破壞，不能合成完整的-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。稱為“藍白斑”篩選。EcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ O

16、riori pUC19質粒載體圖 3根據-半乳糖苷酶顯色反應篩選 :標志補救lacZAmN2H片段COOH片段X-galLac Z藍色化合物X-gal第五節(jié) 目的基因的獲取和體外重組化學合成法：較短的基因（60-80bp）基因組DNA文庫(genomic DNA library)cDNA文庫(cDNA library)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)一.目的基因的獲取:1.化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物, 測序引物, 定點突變, 核酸雜交探針組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載

17、體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.從基因組DNA文庫獲取目的基因基因組DNA(genomic DNA):指代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列構建基因組DNA文庫的基本過程 mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉錄酶 載體 受體菌 復制3. 從cDNA文庫獲取目的基因 逆轉錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T TcDNA:指經反轉錄合成的、與RNA (mRNA或病毒RNA)互補的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板

18、、經聚合反應可合成雙鏈cDNA 基因組文庫和cDNA文庫的比較 PCR技術的基本過程模板DNA dNTP 引物Buffer預變性模板DNA dNTP 引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC59455 72 4.PCR技術獲取目的基因:二.外源基因與載體的連接:體外重組DNA體外重組本質上是一個酶促反應過程，在DNA連接酶的催化作用下，將外源DNA分子與載體DNA分子連接成一個重組分子的過程。連接方式:（一）黏性末端連接（二）平末端連接（三）同聚物加尾連接（四）人工接頭連接（五）T-A克隆Bam H切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+

19、目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接1.粘性末端連接不同限制酶切位點的連接Eco R切割位點Bg l切割位點+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連2.平端連接 DNA連接酶同聚物尾巴同聚物加尾法連接重組DNA分子 同聚物加尾連接:在末端轉移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。利用人工合成的接頭連接重組DNA分子4.人工接頭(linker)連接:由平端加上新的酶

20、切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接5.T-A克隆T-A克隆策略是一種直接將PCR產物插入到載體中的方法。一、重組DNA分子的導入選定的受體細胞應具備的條件：1. 易于接納重組DNA分子導入；2.對載體的復制、擴增和表達無嚴格限制；3.不存在特異性降解外源DNA的酶系統(tǒng)；不對外源DNA進行修飾；能表達重組體分子所提供的某種表型特征。常用的導入方法: （一）轉化（transformation）（二）轉染（transfection）（三）感染（infection）第六節(jié) 重組DNA分子的導入和篩選與鑒定轉化方法：1.氯化鈣法：細菌處于低溫、低滲CaCl2溶液中，菌細胞壁通透性增加，菌

21、體膨脹成球形，經短暫熱休克后重組DNA易進入2.電穿孔法：除特殊儀器外比氯化鈣法更簡單，使用時注意電場強度、電脈沖長度、DNA濃度等參數(shù)。特殊處理受體細胞細胞膜特性改變（一）轉化（transformation）CaCl2處理受體細菌50-100mmol/LCaCl2 感受態(tài)細菌重組體轉入細菌（二）轉染 將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉染 DEAE葡聚糖介導轉染 電穿孔 :操作簡單且轉染效率高，幾乎可轉染任何細胞用于瞬時表達或穩(wěn)定表達。但是它需要專門儀器，確定最佳實驗條件。 脂質體轉染 :脂質體（liposomes）是一種人造類脂膜.用脂質體包裹DNA，瞬時表達和穩(wěn)定表達，操作簡單，轉

22、染效率高，重復性好，且毒性低、包裝容量大，昂貴。 顯微注射:轉染效率高，但需要一定的儀器和操作技巧。主要用于穩(wěn)定表達（三）感染（infection）感染是指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構建的重組體DNA，經體外包裝成具有感染性的噬菌體顆粒和病毒顆粒后，借助噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA注入細菌或真核細胞。感染的效率很高，但重組體DNA需經過較為復雜的體外包裝過程。(一）根據重組載體的遺傳表型進行篩選 1根據載體的抗藥性標記篩選 2根據載體的抗藥性標記插入失活選擇3根據-半乳糖苷酶顯色反應篩選 4根據插入的外源基因性狀進行篩選(二）限制性核酸內切酶酶切鑒定（三）核酸分子雜交法（四）PCR法

23、（五）免疫化學檢測法（六） DNA序列檢測：二.重組體的篩選與鑒定1.抗藥性標記選擇AmprTetrBamH位點BamH酶切BamH酶切DNA連接酶目的DNA重組質粒大腸桿菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板 2.抗藥性標記插入失活選擇3根據-半乳糖苷酶顯色反應篩選 :標志補救lacZAmN2H片段COOH片段X-galLac Z藍色化合物X-gal4根據插入的外源基因性狀進行篩選如把酵母基因組DNA隨機切割后插入到質粒載體中，然后將重組質粒轉化到組氨酸缺陷型大腸桿菌細胞中，并在無組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這樣只有含酵母組氨酸基因并獲得表達的轉化菌才能在無組氨酸的培養(yǎng)基中生長。（二）.限制性核酸

24、內切酶酶切鑒定凝膠電泳檢測加樣孔DNA Marker空質粒重組質粒 重組質粒酶切重組質粒的PCR擴增片段原位雜交（三）.核酸分子雜交法:菌落雜交篩選法（四）.PCR法某些載體的MCS兩側存在保守的序列，如pGEM系列載體的MCS兩側是T7及SP6啟動子序列，可根據此序列設計引物，對提取的重組質粒進行PCR擴增。如果已知目的基因的全序列或其兩端的序列與全長，可設計合成一對引物，以轉化菌的質粒DNA為模板進行PCR擴增，若PCR產物與目的基因的預期長度相一致，那么即可初步篩選出含重組體的陽性菌落。雞的肌球蛋白的克隆和檢出（五）.免疫化學檢測法（六）.DNA序列檢測ACTGAAGGCT標準：選擇標志

25、，強啟動子 ，翻譯調控序列，多接頭克隆位點外源基因在原核細胞中的表達：1融合型表達蛋白 所謂融合型表達是指將外源目的基因與另一基因相拼接構建成融合基因進行表達。2非融合型表達蛋白 3分泌型表達蛋白 利用分泌型表達載體，需要在信號肽的幫助下進行。4包涵體 1. 原核表達體系第七節(jié) 克隆基因的表達E.coli表達體系的不足：不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質；表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達大量可溶性蛋白 優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當修飾表達的蛋白質 表達產物分區(qū)域積累 缺點：操作技術難、費時、經濟2.真核表達體系（

26、酵母、昆蟲、乳類動物細胞）真核表達載體大多是穿梭載體, 通常包括以下元件：1啟動子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。2增強子 3剪接信號4終止信號和PolyA化信號5遺傳選擇標記 ：胸苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰轉移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。新霉素抗性選擇系統(tǒng) 新霉素的類似物G418（geneticin）對真核和原核細胞均有毒性。表達載體中攜帶的neor基因編碼的磷酸轉移酶能使G418失活，所以當真核細胞中導入了含neor基因的載體后，轉染細胞就可以在含有G418的培養(yǎng)基中生長而得以篩選。該選擇系統(tǒng)適用于所有真核細胞。重組DNA技

27、術與醫(yī)學的關系非常密切并前景遠大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 重組DNA醫(yī)藥產品產 品功 能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF, EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO, 酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交一、A型題：1以質粒為載體，將外源基因導入受體菌的過程稱為： A轉化 B轉染 C轉導 D轉位 E感染2最常用的篩選轉化細菌是否含有質粒的方法是： A營養(yǎng)互補篩選 B抗藥性篩選 C免疫化學篩選 D原位雜交篩選 ESouthern印跡篩選3.互補篩選屬于： A抗藥性標志篩