分子生物學檢驗技術：第十一章 單基因遺傳性疾病的分子生物學檢驗

1、單基因遺傳病的分子生物學檢驗Molecular Diagnosis for Monogenic Inherited Diseases遺傳病分類 單基因遺傳病 多基因遺傳病 體細胞遺傳病 染色體病 線粒體遺傳病第一節(jié) 概述基因突變點突變 (Point Mutation)插入或缺失 (Indels)缺失或重復 (Deletion/Duplication)基因倒位 (Inversion)基因融合 (Fusion)動態(tài)突變 (Dynamic):不穩(wěn)定三核苷酸重復序列，其突變是由于基因組中脫氧三核苷酸串聯重復拷貝數增加，拷貝數的增加隨著世代的傳遞而不斷擴增 單基因遺傳病分子生物學檢驗的策略直接診斷間接診

2、斷產前診斷靜態(tài)突變點突變片段突變動態(tài)突變不同層次的檢測方法DNA含量基因結構異常表達改變轉錄翻譯直接診斷主要通過基因和DNA多態(tài)的連鎖分析作出診斷。連鎖分析是基于遺傳標記與致病基因連鎖，子代是否獲得遺傳標記間接地判斷做出診斷。遺傳標記是基因組中的DAN多態(tài)性位點，如RFLP，VNTR 等。間接診斷單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP) 第三代遺傳標記芯片技術產前診斷產前診斷（prenatal diagnosis）在遺傳咨詢的基礎上，通過遺傳學檢測和影像學檢查，對高風險胎兒進行鑒別診斷，對患胎采用選擇性流產，從而降低出生缺陷率，有助于提高優(yōu)生質量和

3、人口素質。單基因遺傳病是產前診斷的主要適應病種X連鎖遺傳病血友病A、B迪謝內肌營養(yǎng)不良脆性X綜合征創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性為主：羊膜腔穿刺（最常用）、絨毛取樣（最常用）、臍血取樣、胎兒鏡及胚胎活檢等超聲波檢查、母體外周血血清標志物和胎兒細胞檢測等。血紅蛋白病血友病 迪謝內營養(yǎng)不良癥 脆性X綜合癥 成年型多囊腎第二節(jié) 血紅蛋白病的分子生物學檢驗異常血紅蛋白病 鐮狀細胞貧血(血紅蛋白S病)；不穩(wěn)定血紅蛋白??；氧親和力增高血紅蛋白；血紅蛋白M(家族性紫紺癥) 鐮狀細胞貧血（SICKLE CELL ANAEMIA）1949 年世界上最早發(fā)現的第一個分子病，由此開創(chuàng)了疾病分子生物學?；颊叱錾肽旰?，癥狀和體征逐

4、漸出現，生長發(fā)育不良，易發(fā)生感染。有貧血、黃疸和肝、脾增大，心、肺功能常受損，可發(fā)生充血性心力衰竭，甚至產生肌肉骨骼痛、腹痛等痛性危象。診斷：本病的診斷并不困難，重要的是要考慮到本病的可能性而不遺漏本病。根據種族和家族史、鐮變試驗陽性、血紅蛋白電泳顯示主要成分為HbS，再結合臨床表現，即可明確診斷。實驗室檢查：1.外周血 血紅蛋白為50100g/L。網織紅細胞計數常在10%以上。紅細胞大小不均，可見有核紅細胞、靶形紅細胞、異形紅細胞。鐮狀紅細胞并不多見，若發(fā)現則有助于診斷。通常采用“鐮變試驗”檢查有無鐮狀細胞。2.骨髓象示紅系顯著增生，在再生障礙危象時增生低下，在巨幼細胞危象時有巨幼細胞變。3

5、.血清膽紅素 輕中度增高，溶血危象時顯著增高。本病的溶血雖以血管外溶血為主，但也存在著血管內溶血。4.血漿結合珠蛋白 降低，血漿游離血紅蛋白可能增高。5.紅細胞半衰期測定 顯示紅細胞生存時間明顯縮短至515 天正常為(285)天。6.血紅蛋白電泳 顯示HbS 占80%以上，HbF 增多至2%15%，HbA2 正常，而HbA 缺如。 珠蛋白基因的第6位密碼子由正常的GAG突變?yōu)镚TG（AT），使其編碼的珠蛋白N端第6位氨基酸由正常的谷氨酸變成了纈氨酸，形成HbS。這種血紅蛋白分子表面電荷改變，出現一個疏水區(qū)域，導致溶解度下降。在氧分壓低的毛細血管中，溶解度低的HbS聚合形成凝膠化的棒狀結構，使紅

6、細胞變成鐮刀狀。 ATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA ATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCA 已知突變Gene部位和性質，合成寡和苷酸探針，32P標記，

7、進行Southern Blot 雜交/斑點雜交。Normal Gene ProbeMutation S Gene ProbeASO探針診斷正常探針突變探針/ /S S/S斑點雜交結果正常 雜合子 純合子珠蛋白生成障礙性貧血 分布最廣和最嚴重的珠蛋白生成障礙性貧血珠蛋白生成障礙性貧血 地中海貧血（常顯）212112111211表型基因型正常人/靜止型地中海貧血/輕型地中海貧血/HbH病/Hb Bart綜合征/PCR是首選方案大范圍缺失：Southern印跡地貧的基因診斷基因不同程度的缺失引起不同類型的地貧，基因缺失14個。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個 Gene

8、時可得到10kb片段。BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe珠蛋白生成障礙性貧血 分布最廣和最嚴重的珠蛋白生成障礙性貧血珠蛋白生成障礙性貧血 珠蛋白生成障礙性貧血-珠蛋白生成障礙性貧血中發(fā)病率最高的類型 地中海貧血（常隱）地中海貧血珠蛋白基因位于11號染色體上突變-主要發(fā)病原因點突變-單核苷酸置換（主要）堿基的插入缺失（少見 ）中國人地貧突變位點與頻率1PCR-RDB （反向點雜交）2PCR-ASO 3AS-PCR4基因芯片5突變寡核苷酸延伸擴增 反向點雜交同時診斷基因多個點突變M1 M2 M3 M4 M5 M6 正常探針突變探針 基因芯片技術 現在已經開發(fā)了多種診斷地貧的

9、芯片檢測閱讀系統(tǒng)，系統(tǒng)多采用國際先進的PCR體外擴增結合DNA芯片反向點雜交檢測技術，可快速準確檢測全血樣本中珠蛋白基因上多個基因位點的突變 珠蛋白生成障礙性貧血的遺傳咨詢PCR-RFLP連鎖分析技術珠蛋白基因5端有一限制性內切酶HgiA的多態(tài)性位點通過PCR擴增包括這一酶切位點在內的110bp片段用HgiA限制酶消化為65bp和45bp兩個片段當父母均為雜合子時，則具有110bp、65bp及45bp三個片段結果判讀待測胎兒若具有65bp和45bp二個片段，則為正常若有110bp、65bp和45bp三個片段， 則為珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者若僅110bp片段一條帶，則為患兒 血友病是一種遺

10、傳性出血性疾病。發(fā)病原因是由于患者的血液中先天缺乏某種因子，根據缺乏因子的不同分為三種類型：血友病甲（缺乏凝血因子V，又稱血友病A）、血友病乙（缺乏凝血因子，又稱血友病B）和血友病丙（缺乏凝血因子）。血友病A和血友病B均屬X性聯隱性遺傳，一般由女性傳遞，男性發(fā)病。血友病丙較少見，為常染色體不完全隱性遺傳，男女均可發(fā)病。通常所說的血友病是指血友病甲。第三節(jié) 血友病的分子生物學檢驗血友病F的基因結構 F基因位于X染色體長臂末端（Xq28），包括26個外顯子和25個內含子，全長186kb 血友病的遺傳方式和基因突變遺傳方式：X連鎖隱性遺傳至1994年已報道F基因點突變174種，缺失117種，插入10

11、種。由于導致HA F基因的點突變多，故在實際工作中不可能對每一病人作點突變的檢測，所以DNA多態(tài)性的連鎖分析仍然是血友病基因診斷的常用手段。 FVIII基因倒位 （一）直接診斷：LD-PCR （二）間接診斷PCR-RFLP法 基因的非編碼區(qū)DNA序列相對穩(wěn)定，可以作為特定的多態(tài)性標志，如果某一致病基因與特定的多態(tài)性標志物緊密聯鎖，就可以利用該多態(tài)性標志物作為一種遺傳標記，來診斷家系成員或胎兒基因組中是否攜帶該致病基因較常用作因子基因的多態(tài)性標志物有位于內含子18的Bcl內含子19的Hind 內含子22的Xba內含子13和22的CA二核苷酸重復序列(STR)肌營養(yǎng)不良癥（muscular dys

12、trophies，MD）是一類常見的骨骼肌變性的遺傳性疾病。臨床表現為骨骼肌進行性萎縮和肌無力，主要累及肢體的近端肌肉，極少數累及遠端肌肉，腱反射消失、肌肉假性肥大。分為多種類型（根據患者的臨床表現、累及肌肉的分布、遺傳方式等）假性肥大性肌營養(yǎng)不良（pseudohypertrophic muscular dystrophy）:最常見的肌營養(yǎng)不良，X連鎖性隱性遺傳病杜氏肌營養(yǎng)不良癥 (Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)貝氏肌營養(yǎng)不良癥(Becker Muscular Dystrophy，BMD)Emery-Dreifuss型肌營養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy）肢-帶型肌營養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy）遠端肌營養(yǎng)不良(distal muscular dystrophy）先天性肌營養(yǎng)不良(congenital muscular dystrophy）強直性肌營養(yǎng)不良(myotonic m