分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理第1頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一第一節(jié) 分子生物學(xué)發(fā)展概述第2頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一分子生物學(xué)molecular biology是在分子水平上研究生物的結(jié)構(gòu)、組織和功能的科學(xué)。1950年，Astbury在一次學(xué)術(shù)報(bào)告中，首次提出并使用了分子生物學(xué)這一名詞術(shù)語(yǔ)。廣義和狹義之分醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)和理論來(lái)闡明人體正常生理活動(dòng)和病理過(guò)程及其調(diào)控的分子機(jī)理。第3頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一分子生物學(xué)理論與實(shí)際應(yīng)用的成就理論方面1.關(guān)于腫瘤的發(fā)生： 提出了腫瘤起源于細(xì)胞增殖和分

2、化調(diào)控的失常和細(xì)胞同它周?chē)M織關(guān)系的紊亂。 癌基因：100多種；抑癌基因：20多種 細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng) 細(xì)胞凋亡 端粒酶第4頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一2.關(guān)于艾滋病 Acquired Immune Deficiency Syndrome HIV序列；疫苗3.關(guān)于慢性病chronic disease，如心血管疾病、肥胖、糖尿病、骨質(zhì)疏松，發(fā)現(xiàn)了相關(guān)基因及其多態(tài)性。4.關(guān)于生長(zhǎng)、發(fā)育與進(jìn)化的統(tǒng)一理論，也深入到了分子水平。第5頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一實(shí)際應(yīng)用方面1.轉(zhuǎn)基因植物目前已鑒定和克隆化的用于轉(zhuǎn)基因植物的基因有100多個(gè)?？钩輨?/p>

3、、抗昆蟲(chóng)、抗病毒、抗不良環(huán)境因素（抗寒、抗鹽堿地、抗旱、抗?jié)常?、提高作物的產(chǎn)量、提高蛋白質(zhì)含量、改善氨基酸構(gòu)成等。第6頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 1983年，超級(jí)小白鼠，體重是正常鼠的2倍。隨后出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬、羊、雞、兔、牛、鯉魚(yú)等。我國(guó)目前研究了金魚(yú)、鯉魚(yú)、圓頭魴。3.基因工程多肽藥物與疫苗 主要指DNA體外重組技術(shù)所研制的產(chǎn)品，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物所研制的產(chǎn)品，以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)所研制或改進(jìn)的產(chǎn)品。第7頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 4.基因診斷與基因治療 基因診斷gene diagnosis是指通過(guò)直接探查基因的存在狀態(tài)

4、或缺陷，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。 目的物：DNA或RNA 方法：核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、 DNA芯片技術(shù) 疾?。哼z傳性疾??；傳染病或感染性疾病第8頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一基因治療gene therapy 指將正常的外源基因?qū)肷矬w靶細(xì)胞內(nèi)，以彌補(bǔ)所缺失的基因，關(guān)閉或降低異常表達(dá)的基因，以達(dá)到治療疾病的目的。治療疾?。?遺傳病 惡性腫瘤 傳染病第9頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一5.環(huán)境監(jiān)測(cè)與凈化 area survey and depollution 監(jiān)測(cè)：可檢測(cè)環(huán)境中的病毒和細(xì)菌 凈化：改造細(xì)菌分解環(huán)境中的石油、殘留的農(nóng)藥

5、和有毒金屬6.克隆動(dòng)物Clone animal 1997年“多利”克隆羊 克隆器官（干細(xì)胞stem cell技術(shù)）第10頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一7.人類(lèi)基因組計(jì)劃human genome project;HGP1990年，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH） 和美國(guó)能源部聯(lián)合發(fā)表了人類(lèi)基因組計(jì)劃。30億個(gè)堿基對(duì)，估計(jì)有3萬(wàn)4萬(wàn)個(gè)人類(lèi)基因。2000年6月26日，首次繪成人類(lèi)基因組“工作框架圖” 。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國(guó)科學(xué)家及領(lǐng)導(dǎo)人宣布人類(lèi)基因組序列圖繪制成功，人類(lèi)基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)。 第11頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，

6、9點(diǎn)59分，星期一 意 義與“阿波羅”登月計(jì)劃相媲美1996年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主羅伯特柯特認(rèn)為，20世紀(jì)是物理學(xué)和化學(xué)的世紀(jì)，21世紀(jì)將是生物學(xué)的世紀(jì)。推動(dòng)分子生物學(xué)更加快速地發(fā)展：蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)、毒物蛋白質(zhì)組學(xué)、營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)組學(xué)及各種計(jì)劃第12頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一對(duì)其他相關(guān)學(xué)科的影響1.向其他學(xué)科滲透2.形成了許多新興的邊緣學(xué)科 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)方面：腫瘤分子生物學(xué)、免疫分子生 物學(xué)、神經(jīng)分子生物學(xué)等 預(yù)防醫(yī)學(xué)方面：分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)、分子毒理學(xué)、分 子流行病學(xué)、遺傳流行病學(xué)、人 類(lèi)基因組流行病學(xué)、 公共衛(wèi)生 遺傳學(xué)第13頁(yè)，共150頁(yè)，2022

7、年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一在預(yù)防醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用及發(fā)展方向1.慢性病的研究 慢性病的發(fā)病原因絕大多數(shù)是基因與外界環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。2.環(huán)境因素對(duì)人類(lèi)遺傳物質(zhì)損傷的研究及“三致”毒性的研究：生物標(biāo)志物的研究和評(píng)價(jià)方法的建立3.環(huán)境監(jiān)測(cè)與污染物的凈化。第14頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一4.遺傳病的產(chǎn)前診斷（基因型預(yù)防）及早期診斷（表型預(yù)防）。5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。 6.對(duì)環(huán)境因素敏感基因及易感人群的研究環(huán)境基因組計(jì)劃（環(huán)境基因組學(xué)） （1）環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)基因 （2）篩選多態(tài)性及易感性 （3）根據(jù)易感性制定不同的干預(yù)計(jì)劃第15頁(yè)，共150頁(yè)，20

8、22年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一一、分子生物學(xué)一些重要的理論知識(shí)1.分子生物學(xué)發(fā)展史上一些重要的事件（1）1865年，“遺傳學(xué)之父”G.Mendel根據(jù)豌豆雜交試驗(yàn)結(jié)果，創(chuàng)立了遺傳因子學(xué)說(shuō)，即遺傳的分離律和自由組合律。（2）1903年W.Sutton提出染色體是Mendel遺傳單位的載體的概念。（3）1909年，W.Johannsen將這種在染色體上的遺傳單位定名為基因（gene）。第16頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一（4）1910年，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)遺傳學(xué)奠基人TH.Morgan和他的研究生在研究果蠅的遺傳規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)了基因的連鎖律和交換律。（5）1944年，OT.A

9、very等人（3人）分離出細(xì)菌 DNA，并發(fā)現(xiàn)DNA是攜帶生命遺傳物質(zhì)的分子。（6）1950年，Astbury在一次演講中，首次使用了 “分子生物學(xué)” 術(shù)語(yǔ)。（7）1953年，Watson和Crick提出了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，揭示了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的機(jī)制。第17頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick 等人破譯了DNA遺傳密碼，1966年 破譯了64個(gè)遺傳密碼。 提出了遺傳信息由DNA RNA蛋白質(zhì)傳遞的中心法則。 （9）1969年，Jonathan Beckwith及其同事在哈佛大學(xué)成功分離出第一個(gè)基因。（10

10、）1970年，發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。（11）1961年，F(xiàn).Jacob和J.Monod提出了乳糖操縱子學(xué)說(shuō)。第18頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一（12）自1946年起的20年當(dāng)中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多質(zhì)粒；1968年至1970年又發(fā)現(xiàn)了許多限制性?xún)?nèi)切酶，為DNA體外重組提供了有利工具。（13）1973年，重組DNA技術(shù)問(wèn)世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技術(shù)（15）1990年，人類(lèi)基因組計(jì)劃。第19頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 2.三個(gè)重要理論important theory(1)DNA的結(jié)構(gòu)、復(fù)制、中心法則基本構(gòu)成單位是核苷酸

11、核苷酸由脫氧核糖、堿基和磷酸構(gòu)成。堿基分別是腺嘌呤 (A)、鳥(niǎo)嘌呤 (G)、胸腺嘧啶 (T)和胞嘧啶(C)。相鄰的兩個(gè)核苷酸以磷酸二酯鍵相連進(jìn)一步盤(pán)旋、折疊，形成三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)第20頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一RNA與DNA有如下不同點(diǎn)：五碳糖為核糖(不是脫氧核糖)；堿基中有尿嘧啶U(uracil)而沒(méi)有胸腺嘧啶RNA為單鏈，不是雙鏈，但RNA單鏈之間相鄰的堿基可由氫鍵作用形成局部雙鏈。 DNA存在于細(xì)胞核的染色體、線粒體以及染色體以外的質(zhì)粒中(質(zhì)粒是一些雙鏈，閉環(huán)的DNA分子)。第21頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 DNA(或RNA)

12、 結(jié)構(gòu)給我們的啟示 DNA(或RNA)是水溶性的。這是由于含有磷酸基因、羥基和氨基。在核酸提取過(guò)程中，我們保留的是水相、而不是有機(jī)相。核酸是兩性電離，既帶正電荷，又帶負(fù)電荷。它的等電點(diǎn)(PI)為22.5。在中性溶液中帶負(fù)電荷。對(duì)核酸進(jìn)行電泳時(shí)，點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)點(diǎn)在負(fù)極；雜交時(shí)選擇尼龍膜時(shí)，最好選擇帶正電荷的尼龍膜。(核酸帶負(fù)電荷，容易吸附到帶正電荷的膜上，牢固，不掉) 第22頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一DNA在細(xì)胞中存在部位不同(細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)粒)，所以應(yīng)注意提取方法的不同 由于DNA空間構(gòu)象不同，在電泳時(shí)遷移率不同。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，可設(shè)計(jì)引物和探針雜交。由于D

13、NA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和RNA易由于分子內(nèi)氫鏈作用形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，所以在進(jìn)行雜交等反應(yīng)時(shí)，首先應(yīng)加熱變性，破壞二級(jí)結(jié)構(gòu)。第23頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 在解旋酶的作用下，打開(kāi)DNA雙鏈 在特定的復(fù)制起始點(diǎn) 以每條DNA鏈為模板 在DNA聚合酶的催化下 以4種脫氧核苷酸為前體物，合成一條互補(bǔ)DNA鏈。DNA的復(fù)制雙稱(chēng)為半保留復(fù)制。DNA的復(fù)制第24頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一DNA 半 保 留 復(fù) 制第25頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一DNA在復(fù)制起始點(diǎn)，由解旋酶打開(kāi)雙鏈，形成復(fù)制叉，合成新鏈的方向?yàn)?-3端前導(dǎo)

14、鏈與后隨鏈后隨鏈的合成是不連續(xù)的。 先合成RNA引物 再合成不連續(xù)的小片段(岡崎片段，1001000核苷酸長(zhǎng)度) 最后在DNA連接酶作用下，將小片段連接起，形成完整的DNA鏈。 第26頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一DNA 半 不 連 續(xù) 復(fù) 制第27頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一DNA的復(fù)制給了我們一些啟示 PCR技術(shù)的原理：在體外要靠溫度(90以上)打雙鏈，而不是解旋酶，也是以DNA為模，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP為前體。PCR與體內(nèi)(細(xì)胞內(nèi))DNA復(fù)制的最大差異是溫度。檢測(cè)核分裂指數(shù)：在細(xì)胞培養(yǎng)中，加入3H標(biāo)記的dNTP前

15、體物，被細(xì)胞攝取后，參與DNA復(fù)制，復(fù)制速度越快，參入的3H標(biāo)記的dNTP越多，可用液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)放射性強(qiáng)度，據(jù)此判斷。第28頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一遺傳信息的傳遞是： DNARNA多肽(蛋白質(zhì))在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，RNA可形成cDNA，然后再由RNA蛋白質(zhì)以上就是完整的中心法則理論，亦可稱(chēng)為基因的表達(dá)(expression)。中心法則第29頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一中 心 法 則第30頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 轉(zhuǎn)錄(transcription) 以DNA為模板，合成RNA的過(guò)程。 非模板鏈稱(chēng)為

16、有意義鏈，而模板常稱(chēng)為反義鏈。 轉(zhuǎn)錄的過(guò)程大致是這樣的： 以DNA一條鏈為模板， 誘導(dǎo)RNA聚合酶活性、RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 以ATP、GTP、CTP和UTP為前體，合成(轉(zhuǎn)錄)RNA 當(dāng)遇到轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)時(shí)，轉(zhuǎn)錄即停止。第31頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一有意義鏈反義鏈第32頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一轉(zhuǎn)錄后的初級(jí)產(chǎn)物剪切掉內(nèi)含子，并將外顯子連接起來(lái)，這樣才能變成成熟的RNA分子還需要在5-端加一個(gè)特殊的核苷酸，7-甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷酸，這個(gè)過(guò)程叫戴帽另外，mRNA的，這一過(guò)程又叫穿靴， 3-端還要加上一串腺苷酸(AMP)p

17、oly(A)或多聚腺苷酸化。同一機(jī)體不同的細(xì)胞具有相同的DNA或基因，但基因在不同細(xì)胞的表達(dá)是不同的，具有組織特異性，使不同的細(xì)胞具有不同的功能第33頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一由RNA 蛋白質(zhì)的過(guò)程，又叫翻譯。只有聚合酶II催化的反應(yīng)產(chǎn)物是mRNA，而只有mRNA才翻譯成蛋白質(zhì)?；?DNA)上三個(gè)相鄰的堿基組成一個(gè)密碼子，一個(gè)密碼子決定一種特定的氨基酸，共有43=64個(gè)密碼子。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，基因上的三聯(lián)密碼子轉(zhuǎn)錄成mRNA上的三聯(lián)密碼子。mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿中的核糖體上，以三聯(lián)密碼子指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)。翻譯后的蛋白質(zhì)需要加工修飾。 第34頁(yè)，共150頁(yè)，20

18、22年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一中心法則給了我們一些啟示：遺傳信息由DNA上的基因決定。一旦基因發(fā)生突變，將最終導(dǎo)致所翻譯的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致生理功能改變，甚至出現(xiàn)疾病，如癌癥、肥胖等。 mRNA更能準(zhǔn)確簡(jiǎn)便地反映DNA上基因所攜帶的遺傳信息。因此對(duì)基因序列的分析，常分析mRNA的序列即可。第35頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 基因的表達(dá)有組織特異性，且受許多因素的影響，使mRNA的表達(dá)增強(qiáng)、降低甚至關(guān)閉，從而影響機(jī)體正常生理功能，甚至出現(xiàn)疾病。因此常需要檢測(cè)mRNA的表達(dá)的豐度(含量)，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定量(Real

19、time)PCR等。這里需要特別強(qiáng)調(diào)：在檢測(cè)mRNA(或蛋白)表達(dá)時(shí)，一定要先弄清該基因在某種組織中是否有表達(dá)。第36頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 根據(jù)中心法則，可以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下形成cDNA，于是建立了RT-PCR的方法。 根據(jù)mRNA的3端有poly(A)的特點(diǎn)，在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，就以poly(A)為模板設(shè)計(jì)了引物。并且純化mRNA的方法，也是根據(jù)poly(A)的原理設(shè)計(jì)的。根據(jù)最后的翻譯蛋白質(zhì)去向的不同，建立不同的蛋白質(zhì)提取方法，如在線粒體，在細(xì)胞核、在細(xì)胞漿、分泌到血液中。 第37頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一（2

20、）基因表達(dá)調(diào)控 以乳糖操縱子學(xué)說(shuō)為例 乳糖操縱子的基本組成元件 調(diào)節(jié)基因 結(jié)構(gòu)基因 I P O 抑制基因(I) ：是阻遏物編碼區(qū)啟動(dòng)基因(P) ：有cAMP受體蛋白(CRP) 和RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)操縱基因(O)：是阻遏物結(jié)合位點(diǎn) ：-半乳糖苷酶結(jié)構(gòu)基因：透過(guò)酶結(jié)構(gòu)基因：轉(zhuǎn)乙酰酶的結(jié)構(gòu)基因第38頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一調(diào)節(jié)方式 當(dāng)乳糖時(shí),cAMP含量增高 cAMP與CAP (分解產(chǎn)物激活劑蛋白)結(jié)合成CRP該復(fù)合物與啟動(dòng)基因上對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)結(jié)合后使DNA雙鏈不穩(wěn)定；隨后RNA聚合酶則容易與啟動(dòng)基因緊密結(jié)合；若此時(shí)操縱基因上無(wú)阻遏物，則基因被打開(kāi)RNA聚合酶從DN

21、A的5端開(kāi)始滑動(dòng)，即開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，并合成了3種酶。第39頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一當(dāng)葡萄糖cAMPCRPRNA聚合酶則不能與啟動(dòng)基因結(jié)合，也就不能轉(zhuǎn)錄和合成3種酶。抑制基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成阻礙蛋白，并與操縱基因結(jié)合,阻止RNA聚合酶滑動(dòng)而抑制轉(zhuǎn)錄。這種情況又稱(chēng)為負(fù)調(diào)節(jié)如果阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合(此處為乳糖) 。則這個(gè)復(fù)合物不能與操縱基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄和翻譯就能進(jìn)行。 第40頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一操縱子學(xué)說(shuō)擴(kuò)大了基因的概念。即結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因發(fā)揮正、負(fù)調(diào)節(jié)受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境因素的影響。形成了基因調(diào)控和表達(dá)的概念?；虮磉_(dá)調(diào)控理論，不僅有

22、助于理解生命現(xiàn)象的本質(zhì)，而且對(duì)基因工程的建立是至關(guān)重要。 第41頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 （3）DNA重組(基因工程)基因工程的兩個(gè)重要工具：一是內(nèi)切酶，能特異地識(shí)別DNA的堿基序列，并在DNA鏈當(dāng)中將DNA切開(kāi)。二是載體，如質(zhì)粒、噬菌體、病毒。載體的共同特點(diǎn)： 環(huán)狀DNA；都能專(zhuān)一感染某一類(lèi)細(xì)胞；具有某種選擇性標(biāo)記；都具有一些內(nèi)切酶位點(diǎn)；都能隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，隨著細(xì)胞分裂而擴(kuò)增。 第42頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一基因工程的基本程序： 取得所需要的目的基因； 將目的基因同載體連接； 再將這個(gè)重組環(huán)狀DNA引入受體細(xì)胞(或稱(chēng)

23、寄主細(xì)胞)； 使目的基因得以表達(dá)，即基因轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)。第43頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一第二節(jié) 核酸的提取技術(shù)extractive technique of nucleic acid 第44頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 1. 結(jié)合狀態(tài) 2.形態(tài)：分線形和環(huán)形；分雙鏈和單鏈 3.分布： DNA分布在細(xì)胞核和細(xì)胞； RNA 分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞器（一）核酸在細(xì)胞中的存在狀態(tài)和分布第45頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一（二）核酸分離提取的原則、要求 1.原則：(1)應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； (2)排

24、除其它分子的污染，純度要高。 2.對(duì)于核酸純度的要求： (1)對(duì)于核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用 的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子； (2)其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子 污染應(yīng)降低到最低程度； (3)排降其它核酸分子的污染，如提取DNA時(shí)， 應(yīng)去除RNA，反之亦然。 第46頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一3.注意事項(xiàng) (1)盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞(2)減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解，為避免過(guò)酸、過(guò)堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的 破壞，操作多在pH410條件下進(jìn)行。第47頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一(3

25、)減少物理因素對(duì)核酸的降解。物理因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力主要來(lái)源于溶液的快速振蕩，攪拌等。常規(guī)操作溫度為04。(4)避免生物因素對(duì)核酸的降解。細(xì)胞內(nèi)外均存在核酸酶，尤其是RNA酶存在廣泛、穩(wěn)定，極易降解核酸。因此提取過(guò)程中，應(yīng)注意采用核酸酶抑制劑和破壞方法。第48頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 (三)DNA的提取、純化 真核細(xì)胞染色體DNA的制備(提取、純化) 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，可有不同的DNA提取方法，如酚抽提法，甲酰胺解聚法，玻璃棒纏繞法，異丙醇沉淀法等。但這些方法在基本原理及大致步驟上是基本相同的。而且酚抽提法比較經(jīng)典常用，下面就以此方法

26、為例進(jìn)行介紹。第49頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 酚抽提法 酚抽提法的基本原理：用SDS和蛋白酶K破壞和消化細(xì)胞用酚去除水相中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)通過(guò)鹽和乙醇沉淀獲得DNA。 第50頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一試劑： 1 磷酸鹽緩沖液PBS 2 DNA抽提緩沖液： 10mmol/L Tris.cl (緩沖溶液的pH值，pH8.0)。 0.1mol/L EDTA(金屬離子絡(luò)合劑，可抑制DNA聚合酶活性)。 20g/ml 胰RNA酶(破壞降解RNA) 0.5% SDS(表面活性劑，破壞細(xì)胞) 。 蛋白酶K (消化細(xì)胞、破壞細(xì)胞)第51頁(yè)，

27、共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一320mg/ml蛋白酶K，消化細(xì)胞，破壞細(xì)胞4酚（用0.5 mol/L TrisCl，pH 8.0飽和），主要作用是沉淀蛋白質(zhì)等510 mol/L NH4Ac，其作用是沉淀DNA6乙醇，其作用是沉淀DNA7TE（Tris和EDTA混合液），是溶解保存DNA的最好溶液8透析液： 50 mmol/L TrisCl，pH 8.0 10 mmol/L EDTA，pH 8.0第52頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 樣品前處理 (1)生物組織：新鮮的生物組織，先用剪切刀清除組織中筋膜等結(jié)締組織，吸干血液。若不能馬上進(jìn)行DNA提

28、取，可將生物組織貯存于液氮中或-70冰箱中。a.取13g左右的組織，用8層紗布包好，外層再包多層牛皮紙，浸入液氮中使組織結(jié)凍，取出后用木錘將其敲碎。b.將敲碎的組織放入搪瓷研缽中，加入少許液氮，用研杵碾磨。需反復(fù)添加液氮。第53頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一C.在離心管中加入10ml DNA抽提液，用玻璃棒邊攪動(dòng)邊加入組織粉末，然后37保溫1小時(shí)。(先加抽提液，后加組織粉末，有利于充分溶解，用玻璃棒而不用金屬棒，減小損傷DNA的機(jī)率，37保溫1小時(shí)，一方面有利于SDS破壞細(xì)胞，更主要是為了使溶液平衡溫度達(dá)到37，為下一步反應(yīng)準(zhǔn)備適宜條件)。 第54頁(yè)，共150頁(yè)，2

29、022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一(2)培養(yǎng)的細(xì)胞 a.收集細(xì)胞，懸浮培養(yǎng)(生長(zhǎng))的細(xì)胞；可以直接經(jīng)1500g離心(4,10分鐘)，以收集細(xì)胞；貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，用胰酶消化后再離心收集。細(xì)胞數(shù)應(yīng)在5107左右。 b.漂洗細(xì)胞，將離心沉淀的細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS液或生理鹽水，漂洗1次再離心，棄上清收集細(xì)胞?？芍貜?fù)漂洗1-2次(目的去除培養(yǎng)液成分和細(xì)胞分泌的蛋白) c.保溫，再用10ml DNA抽提液將細(xì)胞沉淀懸浮，并在37保溫1小時(shí)。第55頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 (1)消化 向上述預(yù)處理好的樣品溶液中(樣品溶解在DNA抽提液并保溫1小時(shí))，加入20mg/ml

30、的蛋白酶K，至終濃度為100g/ml，邊加邊用玻璃棒輕輕攪拌，使溶液至粘稠狀(細(xì)胞破裂，蛋白、核酸釋放)。將反應(yīng)液在50水浴上，保溫3h，裂解細(xì)胞，消化蛋白。保溫過(guò)程中，應(yīng)不時(shí)輕輕搖勻反應(yīng)液。 DNA提取步驟第56頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一(2)加酚混勻 將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入等容積已飽和的酚溶液，輕輕地上下轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，混勻兩相，反復(fù)該動(dòng)作10min，直至水相與酚相混勻并成乳狀液。若沒(méi)有達(dá)到這種效果，可用多角度振蕩器溫和地混勻1小時(shí)(3)離心 室溫5000g，離心15min，使兩相分開(kāi)(水相在上層，酚相在下層)，(DNA在水相，因水溶性，帶負(fù)電荷)。(4)取上

31、層水相用酚重復(fù)抽提兩次，取上層水相時(shí)，應(yīng)用大口徑(0.3cm)吸管，因水相粘稠 第57頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一(5)又分兩種情況 a.透析處理：為提取大分子量DNA(200Kb以上)，在第3次酚抽提后，將DNA溶液裝入透析袋中，并放入4透析液中。每次透析液1升，換4次透析液，直至透析物OD270小于0.05，才算透析完畢。b.沉淀處理，對(duì)于100150Kb大小的DNA提取，在第三次酚抽提后，將上層水相移入一個(gè)新的離心管中，加入0.2倍容積的10mol/L乙酸銨和2倍容積95%乙醇。室溫下輕輕搖動(dòng)，立刻就可看到乳白色絲狀沉淀出現(xiàn)，用一個(gè)前端為鉤狀的玻璃棒(挑)出

32、DNA纖維，立即放入70%乙醇中漂洗2次。室溫5000g，離心5min，棄上清。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。但注意不要使DNA沉淀完全干燥。然后加TE(pH8.0)溶解DNA 1224h 。第58頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一(6)測(cè)定樣品在260nm和280nm的OD值，計(jì)算DNA含量和A260/A280比值。 260nm處，是核酸的最大吸收波長(zhǎng)，在280nm處是蛋白質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)。 在260nm紫外線下，1OD的光密度值相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA或RNA為40g/ml。因此根據(jù)核酸的OD值，計(jì)算核酸樣品的濃度或含量。第59頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，

33、5月20日，9點(diǎn)59分，星期一根據(jù)A260/A280比值，可判斷所提取核酸(DNA)的純度。DNA純度比較理想的比值是1.8，RNA比值是2.0。若DNA比值高于1.8，說(shuō)明有RNA的污染，低于1.8或1.75，則認(rèn)為是蛋白質(zhì)或酚污染。RNA比值小于2.0，則認(rèn)為也是蛋白質(zhì)或酚的污染。DNA樣品純度不符合要求(尤其是A260/A280比值小于1.8時(shí)) 可用酚或酚/氯仿和氯仿抽提2-3次， 用乙醚除去殘留氯仿，再揮掉乙醚。 最后用鹽和乙醇沉淀，用TE溶解。第60頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 本方法需要說(shuō)明的幾點(diǎn)：(1) 5107細(xì)胞提取產(chǎn)量為200g左右。(2)對(duì)

34、于上層水相比較粘稠，吸取上層水相時(shí)，會(huì)牽動(dòng)兩相之間的蛋白質(zhì)沉淀層。此時(shí)可用吸管插到管底吸取酚相(采用負(fù)壓)，至蛋白質(zhì)層時(shí)，停止。并離心(5000g,20分鐘)，沉淀蛋白質(zhì)，吸取上清液。(3)由于0.5% SDS的存在，可抑制部分胰RNA酶活性，故應(yīng)加大該酶用量，一般為20 g/ml(4)所用酚，應(yīng)重蒸酚，并用水飽和。第61頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一（四）RNA的分離與純化1. 創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶(RNase)的環(huán)境RNA酶在環(huán)境中無(wú)處不在：空氣中灰塵、微生物，人體汗液、唾液，以及各種器皿和試劑等，均存在RNase 。RNase非常穩(wěn)定，耐熱、耐酸，耐堿。蛋白質(zhì)變

35、性劑可使之暫時(shí)失活。 RNase活性不需要輔助因子，因此EDTA對(duì)此酶無(wú)抑制作用。第62頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 (1)去除外源性RNase的污染空氣中的細(xì)菌、霉菌等微生物都含有RNase，所以整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在比較清潔的環(huán)境中進(jìn)行。因此有必要對(duì)操作場(chǎng)所的空氣進(jìn)行消毒。操作者操作應(yīng)戴口罩和手套、帶帽子。玻璃器皿常規(guī)洗凈后，應(yīng)用0.1%DEPC(二乙基焦碳酸鹽)浸泡處理(37，2h)，再用滅菌去離子水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后250烘烤4h以上或200干烤過(guò)夜。第63頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一塑料器材最好使用滅菌的一次性塑

36、料用品。Eppendorf管，微量加樣吸頭最好是新的，使用前進(jìn)行高壓消毒。所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05-0.1%，室溫過(guò)夜，然后高壓消毒。以去除殘留的DEPC。RNA提取所用的酚，應(yīng)單獨(dú)配制和使用。配制飽和酚鹽溶液時(shí)，使用的水應(yīng)預(yù)先以DEPC處理且高壓消毒，酚飽和以后，加入8-羥基喹啉至0.1%。8-羥喹啉不但抗氧化，而且有一定的RNA酶抑制作用。 第64頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一DEPC的分子式為C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5二乙基焦碳酸鹽。是一種粘性液體，對(duì)核酸酶有很強(qiáng)的抑制作用。作用機(jī)制是通過(guò)與蛋白質(zhì)中的組氨酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性。DEPC又能

37、與RNA或單鏈DNA反應(yīng)，破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤，但它破壞單鏈核酸的濃度要比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100-1000倍。使用DEPC的一個(gè)原則是，在達(dá)到使用目的后，一般要高溫處理以便破壞除掉DEPC，使DEPC不與RNA接觸。 第65頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一DEPC可與Tris發(fā)生反應(yīng)，分解成CO2和乙醇，使pH值下降（所以要去除）配制Tris溶液時(shí)，先將所用水用DEPC處理高壓消毒配完Tris溶液后，再經(jīng)高壓消毒。DEPC與肝素聯(lián)合使用，增強(qiáng)使用效果。DEPC應(yīng)在4或液氮中保存，以防降解。第66頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 (2

38、)抑制內(nèi)源性RNase的活性。細(xì)胞裂碎的同時(shí)，RNase釋放出來(lái)。原則上應(yīng)盡早去除細(xì)胞內(nèi)蛋白，加入RNase抑制劑，力爭(zhēng)在提取的起始階段對(duì)RNase活力進(jìn)行有效地抑制。不同組織細(xì)胞中內(nèi)源性RNase的數(shù)量不同，胰腺、脾組織細(xì)胞中RNase的含量極為豐富，在對(duì)這些組織提取RNA時(shí)，更要使用強(qiáng)有力的RNase抑制劑。 第67頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一抑制劑可分為以下幾類(lèi)： 低特異性RNase抑制劑，如皂土、復(fù)合硅酸鹽、肝素、多胺等，因作用較弱，現(xiàn)已不大使用。去除蛋白質(zhì)物質(zhì) 蛋白質(zhì)變性劑，蛋白K、陰離子去污劑，常與RNA酶抑制劑聯(lián)合使用，以加強(qiáng)對(duì)RNase的抑制作用。

39、凡能破壞蛋白質(zhì)的物質(zhì)，對(duì)RNase均有一定作用，因?yàn)槊副旧砭褪堑鞍踪|(zhì)。 第68頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一a.酚、氯仿 這類(lèi)有機(jī)溶劑不但能使核蛋白與核酸解聚(但不能破壞核酸)，而且對(duì)蛋白質(zhì)有變性作用。因而對(duì)酶(RNase)有抑制作用。酚不能完全抑制RNase活性，但酚一般都加入了8羥基喹啉(一種抗氧化劑，一種指示劑)，因而加強(qiáng)了對(duì)RNase的抑制效果。氯仿的抑制效果比較強(qiáng)，因此酚與氯仿常聯(lián)合使用。 蛋白酶K也能抑制RNase活性。有一種情況挺特殊，即該酶在12的SDS存在下，其活性反而會(huì)增加。第69頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 b.去

40、污劑 包括SDS(十二烷基硫酸鈉)，十二烷酰肌氨酸鈉，脫氧膽酸鈉等陰離子去污劑。這些陰離子去污劑可使核酸與蛋白質(zhì)解聚，并可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上帶正電荷的基團(tuán)結(jié)合，在高濃度KCl存在下，形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物而沉淀。 c.解偶劑（胍類(lèi)）鹽酸胍，異硫氰酸胍，作用非常強(qiáng)的一種蛋白變性劑，可完全破壞蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核酸與核蛋白分離，所以又稱(chēng)解偶劑。第70頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 RNase的特異抑制劑a. RNase阻抑蛋白(RNasin)，是一種酸性糖蛋白可與RNase以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合，從而抑制RNase活性， RNasin最好不與蛋白質(zhì)變性劑一同

41、使用，因變性劑亦可破壞RNasin ，從而使其喪失作用。但可與二巰基乙醇一同使用，可增強(qiáng)RNasin的使用效果。b.氧釩核糖核苷復(fù)合物，這也是一種RNase特異性抑制劑，幾乎可完全抑制RNase的活性。 為達(dá)到完全、徹底抑制RNase活性的目的，常聯(lián)合使用，而且有些抑制劑(去除蛋白質(zhì)物質(zhì))一般有4種作用；破壞細(xì)胞膜，使核酸與蛋白質(zhì)分離，沉淀蛋白質(zhì)、抑制RNase活性。因此幾乎包括了RNA提取、分離、純化的所有目的。第71頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 2.RNA的分離、提取方法步驟： (1)創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNase環(huán)境； (2)組織或細(xì)胞的勻漿，同時(shí)得加入RNase抑制

42、劑 (3)裂解細(xì)胞； (4)去除蛋白、DNA等大分子物質(zhì)； (5)沉淀RNA； (6)漂洗； (7)溶解RNA。 第72頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 酚：使核酸與核蛋白分離、變性沉淀蛋 白質(zhì)，抑制RNase活性。異硫氰酸胍：破壞裂解細(xì)胞，使核酸與核蛋白分離，變性沉淀蛋白質(zhì)，同是具有很強(qiáng)的RNase抑制作用。這是一個(gè)關(guān)鍵的試劑，由于它是萬(wàn)能的，所以實(shí)驗(yàn)步驟變得簡(jiǎn)單。Trizol試劑盒所提供的試劑：第73頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一自己需要配制的試劑氯仿：蛋白質(zhì)變性作用，增強(qiáng)對(duì)RNase抑制作用。異丙醇：沉淀RNA。75乙醇：漂洗、去除鹽

43、、殘留有機(jī)溶劑等雜質(zhì)。無(wú)RNase水或0.5%SDS溶液(后者較好)(必須用DEPC處理)。第74頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 勻漿化 a.組織：取50-100mg組織放在勻漿管中，加1ml Trizol試劑，然后進(jìn)行勻漿，此時(shí)裂解細(xì)胞和RNase抑制同時(shí)進(jìn)行。 b.貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞：倒掉培養(yǎng)液，然后直接向培養(yǎng)瓶(皿)中加入Trizol試劑(按10cm2加1ml Trizol試劑計(jì)算加入量)。 c.懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，然后加入Trizol試劑（按510106或1107細(xì)菌加入1ml比例計(jì)算加入量)。操作步驟第75頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59

44、分，星期一兩相分離 將勻漿化的樣品在1530環(huán)境中放置5min，以便核酸蛋白復(fù)合物充分解聚。（加Trizol試劑之前，樣品一定要保持低溫，防止RNase 發(fā)揮作用，在研磨過(guò)程中可加液氮）然后按每1ml Trizol試劑加入0.2ml氯仿的比例加入氯仿。蓋緊試管蓋，用手劇烈振蕩15秒，之后在1530條件保溫23min。離心：12000g離心15min，離心時(shí)溫度要控制在28。（12000g離心是一個(gè)關(guān)鍵步驟，也是該方法獨(dú)到之處，可將蛋白質(zhì)，DNA等大分子沉淀)。離心之后，就會(huì)形成三相：下層是紅色的酚和氯仿（含有蛋白質(zhì)和DNA）；中間層是白色的DNA和蛋白質(zhì)沉淀；上層是水相，RNA就在此層，水相大

45、約占總體積的60第76頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 RNA沉淀 將水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的試管中，并加入異丙醇混勻，加入量按每ml Trizol試劑加0.5ml異丙醇計(jì)。在1530條件下，保溫10min。然后在28條件下，12000g離心10min，此時(shí)就會(huì)在管底或底部邊上出現(xiàn)RNA沉淀，離心之前，RNA沉淀通?？床灰?jiàn)，離心之后常?？煽匆?jiàn)膠樣沉淀。 RNA漂洗 移去上清液，加入75乙醇至少1ml，渦旋振動(dòng)幾次，然后以7500g離心5min(溫度28)，又可形成RNA沉淀，并移去上清液。第77頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 重新溶解RNA 將R

46、NA沉淀在空氣中放量510min，以便揮發(fā)掉殘留的乙醇。注意干燥時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以防RNA完全干燥。完全干燥的RNA很難溶解。最后用無(wú)RNase水或0.5SDS溶液溶解RNA，并用移液管吹打幾次，并在55 60保溫10min，以便使RNA完全溶解。 第78頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一判定純度和計(jì)算含量，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量溶液的吸光度質(zhì)（A）。A260/280在1.61.8之間表明比較純凈，符合實(shí)驗(yàn)要求。1OD值40g RNA,據(jù)此再計(jì)算RNA含量。第79頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 一般來(lái)講，該方法可從1mg組織中提取的RNA含量分別

47、為：肝和脾為610g ；腎34g ，肌肉和腦為15g ，胎盤(pán)14g 。對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)講，1106個(gè)上皮細(xì)胞中可提取815g ，成纖維細(xì)胞57g 。 用Trizol試劑盒法提取的RNA，基本上可滿(mǎn)足所有實(shí)驗(yàn)的需要，如Northern blot，斑點(diǎn)雜交，mRNA分離、體外翻譯，分子克隆等。 該方法操作簡(jiǎn)便，提取的RNA完整，整個(gè)提取過(guò)程僅需1h，故現(xiàn)在廣泛使用。第80頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù) 第81頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 1.探針的概念：在化學(xué)及生物學(xué)意義上的探針(Probe)，是指能與特定的靶分子發(fā)生

48、特異性相互作用的分子，并可被特殊的方法所探知(檢測(cè)到)。所謂核酸分子探針則是指特定的已知核酸片段，并帶有標(biāo)記物，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，因此可以用于待測(cè)核酸樣品中特定基因順序的探測(cè)（可定性、定量）。(一)探針的概念、種類(lèi)及其選擇、探針的標(biāo)記第82頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一2.探針的種類(lèi)、選擇及特點(diǎn)種類(lèi)：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探 針、寡核苷酸探針選擇：寡核苷酸探針 寡核苷酸探針是指人工合成的短鏈核苷 酸片段，并帶有標(biāo)記物特點(diǎn)：人為控制，雜交時(shí)間短，特異性高，可 以用于點(diǎn)突變檢測(cè)；缺點(diǎn)是靈敏度低 第83頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)5

49、9分，星期一 設(shè)計(jì)寡核苷酸探針應(yīng)遵循的（以下）幾個(gè)原則： 探針長(zhǎng)度：一般要求1050bP。過(guò)短則特異性降低，過(guò)長(zhǎng)，則合成困難、雜交時(shí)間延長(zhǎng)，亦會(huì)出現(xiàn)非特異性雜交。應(yīng)不短不長(zhǎng)。 （一般20bp） G：C堿基對(duì)含量應(yīng)占4060；過(guò)少，則不易雜交，或雜交雙鏈不穩(wěn)定；過(guò)多，則會(huì)產(chǎn)生非特異性雜交，應(yīng)不多也不少。（一般AT、GC各占50%） 探針內(nèi)部的互補(bǔ)堿基對(duì)不應(yīng)大于4bP，否則會(huì)形成探針內(nèi)部的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)。 同一堿基的連續(xù)出現(xiàn)次數(shù)不應(yīng)超過(guò)4次。 探針設(shè)計(jì)完后，最好利用基因庫(kù)軟件進(jìn)行分析，并與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較，如果該探針與非目的基因序列有70以上的同源性，或連續(xù)有8個(gè)以上的堿基序列相同，

50、則應(yīng)重新設(shè)計(jì)探針序列。第84頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一3.探針的標(biāo)記物與標(biāo)記 標(biāo)記物： 放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I 非放射性標(biāo)記物：半抗原（生物素、地高辛）；配體；熒光素；化學(xué)發(fā)光物第85頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 根據(jù)待測(cè)核酸分子存在的部位不同，可分固相雜交（膜上印跡雜交、細(xì)胞原位雜交）和液相雜交。其中膜上印跡雜交應(yīng)用廣泛。 膜上印跡雜交是指將待測(cè)核酸序列片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。 （二）雜交第86頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星

51、期一 首先用凝膠電泳方法將待測(cè)核酸片段分離，然后用印跡技術(shù)將分離的核酸片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上（轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來(lái)的相對(duì)位置不變）。 再用標(biāo)記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交。 最后洗去未雜交的游離的探針?lè)肿樱ㄟ^(guò)放射自顯影等檢測(cè)方法顯示標(biāo)記的探針的位置及量的多少。 概括起來(lái)，雜交主要包括三個(gè)步驟：印跡、雜交和檢測(cè)。膜上印跡雜交的基本操作流程第87頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一1.印跡技術(shù) 印跡技術(shù)是指將待測(cè)核酸分子轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上的方法。 印跡技術(shù)主要包括兩個(gè)關(guān)鍵因素：選擇良好的固相支持物；有效的轉(zhuǎn)移方法。 第88頁(yè)，共150

52、頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 固相支持物的選擇 具有良好的機(jī)械性能，如柔軟性好，韌性強(qiáng)，以便操作 時(shí)不易損壞；具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力；與核酸分子結(jié)合后，應(yīng)不影響其與探針?lè)肿拥碾s交反應(yīng)；與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定、牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操 作過(guò)程，而不會(huì)脫落或脫落極少；非特異性吸附較少，即使有，在洗膜時(shí)也易被洗脫掉。 第89頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一硝酸纖維素濾膜尼龍膜化學(xué)活化膜濾紙其中前2種更為常用 目前常用的固相支持物第90頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一硝酸纖維素濾膜 具有較強(qiáng)的吸附結(jié)合單鏈DNA和RNA的能力，

53、特別是在高鹽濃度，其結(jié)合力可達(dá)80g/cm2100g/cm2。這種結(jié)合主要靠疏水作用。非特異性吸附核酸（探針）能力較弱，因此雜交信號(hào)本底值較低。 常用于Southern、Northern斑點(diǎn)印跡及克隆篩選等實(shí)驗(yàn)。第91頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一缺點(diǎn)：與核酸的結(jié)合力較弱（因?yàn)槭强渴杷饔茫?，在雜交及洗脫的進(jìn)程中，核酸會(huì)慢慢脫落，特別是在高溫情況下，更容易脫落，從而使雜交率下降。另外硝酸纖維素膜對(duì)于小分子量DNA片段結(jié)合力更弱，因此不太適合小分子DNA片段的雜交。硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆，特別是經(jīng)烘烤后更易破損，因此操作不方便，須特別小心。另外值得注意的是，硝酸纖維素膜

54、與核酸的結(jié)合，有賴(lài)于高鹽濃度，而高鹽溶液又不適合于電轉(zhuǎn)印跡法（電流大，產(chǎn)熱）。第92頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一尼龍膜 尼龍膜是目前較理想的一種核酸固相支持物，它有多種類(lèi)型。有的尼龍膜未經(jīng)特殊處理，叫普通尼龍膜。有些則是經(jīng)過(guò)了正電荷基團(tuán)的修飾，又叫特殊尼龍膜。特殊尼龍膜帶有正電荷，核酸帶有負(fù)電荷，因此二者可靠靜電吸引牢固結(jié)合。因此尼龍膜對(duì)核酸的結(jié)合力要比硝酸纖維素膜強(qiáng)好多倍。特別是經(jīng)短波紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的帶正電荷的氨基相互交聯(lián)，從而使結(jié)合更加牢固。因此特別適用于小分子核酸片段的雜交。另外堿處理也可使核酸牢固地結(jié)合在尼龍膜上，因此使DNA的

55、變性、吸附和固定可一步完成，特別適用于菌落原位印跡法。第93頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 尼龍膜質(zhì)地堅(jiān)韌，不易損壞，操作方便，可 進(jìn)行多次重復(fù)雜交。另外，在低離子強(qiáng)度條件下，也可與核酸牢固結(jié)合，因此適用于電轉(zhuǎn)印跡法。 缺點(diǎn)：由于結(jié)合力強(qiáng)，非特異性吸附較多，雜交信號(hào)本底較高，應(yīng)注意封閉。第94頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 印跡方法 轉(zhuǎn)移方法不同，可分為斑點(diǎn)或狹縫印跡，即直接將核酸樣品點(diǎn)樣于固相支持物上；虹吸印跡法，利用毛細(xì)管虹吸作用，由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動(dòng)核酸分子轉(zhuǎn)移到固相支持物上；電轉(zhuǎn)印跡法，即利用電場(chǎng)力的作用將核酸帶到固相支持物上；真空轉(zhuǎn)

56、移法，即利用真空抽濾作用，將核酸分子帶到固相支持物上。第95頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 根據(jù)要轉(zhuǎn)印核酸品種的不同，又可分為 Southern印跡法：是指將電泳分離的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程。 Northern印跡法：是指RNA的印跡過(guò)程。第96頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 步驟： a.DNA分子經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切。酶切變成合適長(zhǎng)度的DNA片段（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，突變檢測(cè)則短，定性定量則長(zhǎng)）。一般理想的是0.510Kb，因片段大小直接影響轉(zhuǎn)移效率。 b.在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。分離DNA片段，經(jīng)EB（溴化乙錠）染色后觀察D

57、NA片段大小，并與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物比較（Marker）。記錄或照像各DNA片段位置。尤其留意我們所感興趣的DNA片段。（瓊脂糖電泳常用于核酸，一般為水平板電泳 SDS電泳常用于蛋白質(zhì)，一般為垂直板電泳）Southern印跡法第97頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 c.將凝膠浸泡于適量的變性液中(1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室溫1h，其目的使DNA變性，即將雙鏈DNA變成單鏈DNA。如果DNA片段較大(大于15kb)，可在變性前，用稀鹽酸（0.2mol/L）處理10min，脫嘌呤后，再進(jìn)行堿變性處理，使之降解為小片段，因?yàn)槠蔚拇笮≈苯?/p>

58、影響轉(zhuǎn)移速率。小于15Kb，轉(zhuǎn)移1h，大于15Kb則需要18h。 d.印跡(轉(zhuǎn)移)方法：虹吸印跡法，電轉(zhuǎn)印跡法和真空印跡法。其中常用的是后兩種，本教研室常用后一種，真空印跡法。不論采用哪種方法，均是將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上（硝酸纖維素膜、尼龍膜）。 e.固定，上一步驟雖然將DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，但結(jié)合還不牢固，需進(jìn)一步固定。方法有：對(duì)于硝酸纖維膜，可真空下80烘烤2h(亦可無(wú)真空)，對(duì)尼龍膜還可用短波紫外線（波長(zhǎng)254nm）照射幾分鐘進(jìn)行固定，固定后方可進(jìn)行下一步的雜交。 第98頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 Northern印跡法是指將RNA變性及電泳

59、分離后，將其轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過(guò)程。從而可用于雜交反應(yīng)以鑒定其中特定mRNA的豐度。 基本原理與Southern印跡相同，但RNA變性方法與DNA不同，不能用堿變性，因?yàn)閴A導(dǎo)致RNA水解。RNA的變性常與電泳同時(shí)進(jìn)行，常有3種方法，即聚乙醛和二甲基亞砜變性電泳；甲醛變性凝膠電泳和甲基氧化汞電泳，常用的是第二種。 Northern印跡法第99頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一 RNA經(jīng)變性電泳后，一般可進(jìn)行轉(zhuǎn)移（印跡），其印跡方法與Southern方法相同。但對(duì)含甲醛的凝膠，可用DEPC預(yù)處理水漂洗，以去除甲醛。如果凝膠較濃（大于1）、較厚（如大于0.5cm）或待測(cè)RN

60、A片段較大（大于2.5kb），可預(yù)先將凝膠放在0.05mol/L NaOH溶液中浸泡20分鐘，以便充分使RNA變性。然后DEPC處理過(guò)的水漂洗，最后用20SSC浸泡45min。 固定方法，常用真空烘烤（80）2h。第100頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期一2雜交（固液相雜交）技術(shù) DNA分子雜交實(shí)際上是雙鏈DNA的變性和具有同源序列的兩條單鏈的復(fù)性過(guò)程。RNA分子雜交也涉及變性和復(fù)性過(guò)程（這種變性是單鏈RNA分子內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)過(guò)程），其基本原理和方法與DNA雜交基本一致。因此以DNA分子雜交為例進(jìn)行介紹。第101頁(yè)，共150頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)59分，星期