十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳法(CE-SDS法)標準操作規(guī)程SOP

1、第 頁/共10頁十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳法（CE-SDS法）標準操作規(guī)程類別工作標準文件文件編號XXXXX版本號V01頁碼共頁執(zhí)行日期年月日（禁止復?。徟撈鸩萑藢徍巳藢徍巳伺鷾嗜瞬块T分析研究部分析研究部分析研究部質(zhì)量保證部姓名簽名日期年月曰年月曰年月曰年月曰頒發(fā)部門：質(zhì)量保證部分發(fā)部門：分析研究部拷貝號：NO/文件變更歷史版本號執(zhí)行日期變更原因、依據(jù)及變更內(nèi)容V002019年03月10日新起早目錄TOC o 1-5 h z1目的42范圍43定義44環(huán)境、健康和安全45培訓46職責47程序（內(nèi)容）4 HYPERLINK l bookmark4 7.1原理47.2實驗材料47.3操作步驟5

2、7.4結(jié)果分析97.5判定標準97.6注意事項98相關(guān)文件109參考文獻1010流程圖1011附錄10 HYPERLINK l bookmark8 十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳法（CE-SDS法）測定記錄1 HYPERLINK l bookmark10 十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳法（CE-SDS法）測定記錄（適用于多個樣品）11目的規(guī)范十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳法（CE-SDS法）檢驗的操作過程。范圍本規(guī)程適用于常規(guī)十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳檢驗，涉及到蛋白質(zhì)純度相關(guān)指標的測定。定義CE-SDS:十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳。4環(huán)境、健康和安全還原電泳中使用的巰基乙醇為揮發(fā)性液體，具有較

3、強烈的刺激性氣味，會刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚，吞食有害，與皮膚接觸有毒，取液時穿戴適當?shù)姆雷o服、手套和護目鏡或面具。如不慎與眼睛接觸后，請立即用大量清水沖洗并征求醫(yī)生意見。該液體對水體環(huán)境能產(chǎn)生長期污染等不良影響，切勿倒入下水道，應(yīng)倒入廢液桶，由專業(yè)部門回收。與空氣混合、受熱、明火可爆，如其燃燒可用二氧化碳、干粉類滅火劑。儲存庫房應(yīng)通風低溫干燥，與氧化劑、食品分開儲運。5培訓培訓部門:分析研究部。培訓對象:分析研究部相關(guān)人員。培訓方式和時數(shù):自學，0.5小時?？己朔绞?問答。6職責質(zhì)量保證部:負責監(jiān)督本文件的執(zhí)行。分析研究部:負責嚴格執(zhí)行本規(guī)程規(guī)定。程序（內(nèi)容）7.1原理該方法是指以彈性石英毛

4、細管為分離管道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，通過目標蛋白在含有膠的溶液中的遷移速率不同而得到分離，較小分子量的分子遷移速度更快則其遷移時間短，較大分子的遷移速度慢則其遷移時間更長。該方法主要能檢測分子量在10kDa以上的降解片段。實驗材料7.2.1試藥與試液721.1超純水：電阻率不低于18.2MQcm，本方法所有試液均用超純水配制。SDS-MWAnalysisKitBeckman生產(chǎn)，貨號390953，該試劑盒中包含SDS-MW凝膠分離緩沖液、SDS-MW樣品緩沖液（樣品稀釋液）、酸性清洗液（0.1mol/L鹽酸溶液）、堿性清洗液（0.1mol/L氫氧化鈉溶液）、內(nèi)標物質(zhì)（10kDaIntern

5、alStandard）。也可采用北京博思雅生化技術(shù)研究院生產(chǎn)的SDS試劑盒，貨號BSYK018,該試劑盒中包含CE-SDSGelBuffer、CE-SDSSampleBuffer（樣品稀釋液）。也可采用同類型其它品牌的商品化試劑盒。7.2.1.3烷基化溶液（0.25mol/L碘乙酰胺溶液）：稱取約0.046g碘乙酰胺，加入1ml超純水溶解混勻，可于28C避光保存7天。7.2.1.42-巰基乙醇。7.2.1.5系統(tǒng)適用性樣品：如無特殊規(guī)定，應(yīng)采用經(jīng)特殊處理后的系統(tǒng)適用性專用樣品（處理方法見各項目下規(guī)定）；也可選用相應(yīng)原研藥或各項目自制工作對照品。儀器與用具毛細管電泳儀：ABSCIEX公司PA80

6、0plus或CESI8000Plus。7.2.2.2毛細管卡盒：適用于7.2.2.1中毛細管電泳儀的毛細管卡盒。7.223毛細管：非涂層-熔融石英毛細管（內(nèi)徑50pm）,切割至總長為30.2cm，高分辨率方法有效分離長度為20cm，高效方法有效長度為10cm。7.224孔塞：孔塞大小8（100pmX800pm）o7.225其他：CE通用樣品瓶、藍色橡膠通用樣品瓶瓶蓋、200pl微量管（內(nèi)插管）、移液器、水浴鍋（或金屬?。?、臺式離心機、離心管、超濾管。7.3操作步驟供試品制備7.3.1.1供試品稀釋（1）空白對照：取當次檢測供試品對應(yīng)的緩沖液（如原液緩沖液或制劑緩沖液），分別用稀釋液（SDS樣品

7、緩沖液）進行稀釋（稀釋倍數(shù)同供試品），作為空白對照。（2）系統(tǒng)適用性：取各項目下規(guī)定的系統(tǒng)適用性樣品，用稀釋液（SDS-MW樣品緩沖液）稀釋至終濃度約為1.0mg/ml。（3）原液：根據(jù)待測原液濃度，用稀釋液（SDS-MW樣品緩沖液）稀釋至終濃度約為1.0mg/ml。（4）成品：若為液體制劑，根據(jù)標示含量，直接用稀釋液（SDS-MW樣品緩沖液）稀釋至終濃度約為l.Omg/ml；若為凍干制劑，則先用水復溶后，根據(jù)復溶后理論含量，再用稀釋液（SDS-MW樣品緩沖液）稀釋至終濃度約為l.Omg/ml。731.2非還原供試品溶液制備：取稀釋后供試品溶液各95卩1,各加入lOkDaInternalSta

8、ndard2卩1，再各加入0.25mo1/L碘乙酰胺溶液5卩1，渦旋混勻。7.3.1.3還原供試品溶液制備：取稀釋后供試品溶液各95卩1，各加入lOkDaInternalStandard2卩1，再各加入2-巰基乙醇5卩1，渦旋混勻。7.3.1.4將各供試品溶液在70C孵育，非還原供試品溶液孵育5分鐘，還原供試品溶液孵育510分鐘。冷卻至室溫后以每分鐘6000轉(zhuǎn)離心1分鐘。從樣品管中分別取出樣品至200卩1微量管中，將200卩1微量管放入CE通用樣品瓶中，蓋好藍色橡膠通用樣品瓶瓶蓋，放置樣品盤中待檢測分析。7.3.2緩沖液瓶的準備和擺放按下圖和下表加入各入口緩沖液，并用藍色橡膠通用樣品瓶瓶蓋蓋好

9、。(fiO17-14ft)瀟壞第也24腑幡環(huán)料16ft）17-24ft)(IMS11ft)susMK分臬給沖撤（解劉加SDS勒分席蟻沖険【fii碑対吐(ifiOj-WK)盤瞅ABCDE圖7.1入口緩沖液擺放圖示表7.1入口緩沖液加入體積及用途CE通用瓶位置入口緩沖液加入體積入口緩沖液用途A1至A6超純水1.5ml沖洗毛細管B4至B6超純水1.5ml沖洗毛細管B1至B3SDS凝膠分離緩沖液1.2ml沖洗毛細管C1至C3SDS凝膠分離緩沖液1.1ml供試品分離D1至D3堿性清洗液（0.1mo1/L氫氧化鈉溶液）1.5ml每針之前沖洗毛細管El至E3酸性清洗液（O.lmol/L鹽酸溶液）1.5ml每

10、針之前沖洗毛細管Fl至F3超純水1.5ml每針之前沖洗毛細管7.3.2.2按下圖和下表加入各出口緩沖液，并用藍色橡膠通用樣品瓶瓶蓋蓋好。（解第17-24嵐）編牌JM6妁酬斛M胎備耳第】$薊mi嵋耳第1妣曲醐17-M船(17-21)17-24ft)（胸第1栩禾）17-24)曲理壞第肋拓曲的魏沖險Ocm-16曲邯壞第已吧墉誹壞第14旳B:I)EF圖7.2出口緩沖液擺放圖示表7.2出口緩沖液加入體積及用途CE通用瓶位置出口緩沖液加入體積出口緩沖液用途A1至A6超純水1.5ml沖洗毛細管B1至B3超純水0.8ml沖洗SDS凝膠分離緩沖液的廢液瓶B4至B6超純水1.5ml沖洗毛細管C1至C3SDS凝膠分

11、離緩沖液1.1ml供試品分離D1至D3超純水0.8ml沖洗堿性清洗液的廢液瓶E1至E3超純水0.8ml沖洗酸性清洗液的廢液瓶F1至F3超純水0.8ml沖洗超純水的廢液瓶7.3.3編輯方法并調(diào)用方法表7.3電泳操作參數(shù)（高分辨率分離法）分離參數(shù)參數(shù)設(shè)置檢測器波長214nm或220nm,帶寬10nm毛細管溫度20C樣品溫度102C分析方法步驟事件總結(jié)1堿性溶液沖洗0.1mol/L氫氧化鈉，70psi下3分鐘，向前2酸性性溶液沖洗0.1mol/L鹽酸，70psi下1分鐘，向前3水沖洗70psi下1分鐘，向前4SDS凝膠沖洗/灌裝SDS凝膠灌裝，70psi下10分鐘，向前5凝膠后浸潤1水浸潤0.0分鐘

12、6凝膠后浸潤2水浸潤0.0分鐘7樣品注射5kv下20秒，反相極性8注射后浸潤水浸潤0.0分鐘9電壓分離15kv下40分鐘，溫度為20C,Ramp=1.00分鐘，反相極性10自動歸零5分鐘表7.4電泳操作參數(shù)（高效分離法）分離參數(shù)參數(shù)設(shè)置檢測器波長214nm或220nm，帶寬10nm毛細管溫度20C樣品溫度102C分析方法步驟事件總結(jié)1堿性溶液沖洗0.1mol/L氫氧化鈉，70psi下3分鐘，反向2酸性性溶液沖洗0.1mol/L鹽酸，70psi下1分鐘，反向3水沖洗70psi下1分鐘，反向4SDS凝膠沖洗/灌裝SDS凝膠灌裝，70psi下10分鐘，反向5凝膠后浸潤1水浸潤0.0分鐘6凝膠后浸潤2

13、水浸潤0.0分鐘7樣品注射5kv下20秒，正常極性8注射后浸潤水浸潤0.0分鐘9電壓分離15kv下30分鐘，溫度為20C,Ramp=1.00分鐘，正常極性10自動歸零2分鐘7.3.4供試品檢測：將供試品位置號編輯入序列表中，輸入相應(yīng)供試品名稱與文件名稱，并調(diào)用相關(guān)方法。序列表中樣品排列順序依次為毛細管活化、空白對照、系統(tǒng)適用性1、供試品、系統(tǒng)適用性2、關(guān)機，各進樣檢測一次（其中系統(tǒng)適用性1、系統(tǒng)適用性2為同一管樣品）；若稀釋后供試品溶液終濃度小于l.Omg/ml,貝U可適當增加序列表中樣品注射時間以增加進樣量。運行序列開始檢測分析。7.4結(jié)果分析還原條件：按面積歸一化法計算，以重鏈、非糖基化重

14、鏈和輕鏈的校正峰面積分別占所有校正峰面積之和的百分比分別計算重鏈、非糖基化重鏈和輕鏈的純度，三者之和即為產(chǎn)品純度。（注：根據(jù)樣品功能決定總純度是否包含非糖基化重鏈）。非還原條件：按面積歸一化法計算，以供試品主峰的校正峰面積占所有校正峰面積之和的百分比計算單體的純度。7.5判定標準空白對照判定標準：與系統(tǒng)適用性圖譜進行比較，在供試品降解片段、單體、聚合體的遷移時間范圍內(nèi)，空白對照應(yīng)無明顯的干擾峰出現(xiàn)。系統(tǒng)適用性判定標準非還原型電泳或還原后呈現(xiàn)單一主帶的還原型電泳：系統(tǒng)適用性1與系統(tǒng)適用性2圖譜中主峰遷移時間的極差應(yīng)W2.0min；主峰校正峰面積百分比極差應(yīng)W0.6%。7.5.2.2還原后呈現(xiàn)輕鏈

15、、重鏈的還原型電泳：系統(tǒng)適用性1與系統(tǒng)適用性2圖譜中重鏈遷移時間的極差應(yīng)W2.0min；輕鏈校正峰面積百分比極差應(yīng)W0.6%；重鏈校正峰面積百分比極差應(yīng)W0.6%。7.5.2.3若空白對照與系統(tǒng)適用性同時滿足要求，貝本次實驗結(jié)果有效，否貝實驗結(jié)果無效，供試品需復檢。7.6注意事項為保證供試品能與SDS樣品緩沖液中的SDS充分結(jié)合，供試品的稀釋倍數(shù)應(yīng)三2倍。緩沖液瓶的數(shù)量取決于樣品的個數(shù)，保證每810個循環(huán)都能使用新的緩沖液。若供試品溶液的緩沖體系會干擾實驗結(jié)果（如純化中間樣品），可用截距為10kD的超濾管置換緩沖體系后，再進行樣品檢測。如果供試品初始濃度較低，可用截距為10kD的超濾管進行超濾

16、濃縮，使終濃度接近2.0mg/ml。依據(jù)進樣口離檢查窗口的距離，分離方法分為高分辨率方法和高效分離方法。在高分辨率方法中，將樣品放置在左側(cè)樣品托盤中，入口緩沖液放置在左側(cè)緩沖液托盤，出口緩沖液放置在右側(cè)緩沖液托盤；在高效分離方法中，將樣品放置在右側(cè)樣品托盤中，入口緩沖液和出口緩沖液互換位置。根據(jù)分子量大小選擇高分辨率方法和高效分離方法，建議分子量約為3070kD的供試品選擇高分辨率方法，分子量大于70kD的供試品選擇高效方法。具體選用何種分離方法見各項目下規(guī)定。方法中各參數(shù)，如還原、非還原處理時孵育溫度、孵育時間等，可依據(jù)各項目在該方法下的驗證結(jié)果進行調(diào)整。相關(guān)文件參考文獻BECKMANCOU

17、LTER.PA800plusPharmaceuticalAnalysisSystem:SDS-MWAnalysisM.B25803AA,January2013BECKMANCOULTER.PA800plusPharmaceuticalAnalysisSystem:IgGPurity/HeterogeneityAssayM.B25801AA,January20139.3中國藥典2015年版，通則3127“單抗分子大小變異體測定法（CE-SDS法）”10流程圖11附錄十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳法（CE-SDS法）測定記錄品名批號編號規(guī)格開檢日期年月日檢驗依據(jù)一、實驗材料1、試藥與試液名稱編號/批

18、號（來源）系統(tǒng)適用性樣品（）SDS凝膠分離緩沖液稀釋液（SDS樣品緩沖液）堿性清洗液（O.lmol/L氫氧化鈉溶液）酸性清洗液（O.lmol/L鹽酸溶液）InternalStandard（kD）2-巰基乙醇碘乙酰胺溶液（0.25mol/L）復溶溶劑（滅菌注射用水）原液緩沖液（）成品緩沖液（）2、儀器與用具名稱生產(chǎn)廠家/型號設(shè)備編號毛細管電泳儀ABSCIEX/PA800plusABSCIEX/CESI8000Plus水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司/DKB-501S其它第1頁/共5頁第 頁/共5頁臺式高速（冷凍）離心機Eppendorf/CentrifUge5418R其它金屬浴Thermo/Dig

19、italCoolingDrybath其它UncoatedABSCIEX（內(nèi)徑um）,有效分離長度：cm,毛細管批Capillary號：，毛細呂編號：二、操作步驟1、待測樣品稀釋空白對照：取緩沖液卩1,加入稀釋液卩1,混勻，稀釋倍數(shù)為倍。系統(tǒng)適用性：樣品初始濃度為mg/ml,取對照品卩1,加入稀釋液卩1，混勻，稀釋倍數(shù)為倍，稀釋后終濃度為mg/ml。原液：原液蛋白質(zhì)初始濃度為mg/ml，取待測原液卩1，加入稀釋液卩1,混勻，稀釋倍數(shù)為倍，稀釋后終濃度為mg/ml。成品（液體制劑）：成品標示量為，取待測成品卩1,加入稀釋液卩1,混勻，稀釋倍數(shù)為倍，稀釋后終濃度為mg/ml。成品（凍干制劑）：成品標

20、示量為，取成品用ml/瓶的注射用水復溶。取復溶后成品卩1,加入稀釋液卩1,混勻，稀釋倍數(shù)為倍，稀釋后終濃度為mg/ml。其它2、供試品溶液制備非還原供試品溶液制備：分別取稀釋后樣品溶液各卩1,加入lOkDaInternalStandard卩1,再加入0.25mmo1/L碘乙酰胺水溶液卩1,渦旋混勻后在C孵育分鐘。還原供試品溶液制備：分別取稀釋后樣品溶液各卩1,加入lOkDaInternalStandard卩1,再加入2-巰基乙醇卩1,渦旋混勻后供試品溶液在C孵育分鐘。3、將制備好的供試品溶液冷卻至室溫后以每分鐘6OOO轉(zhuǎn)離心l分鐘。從樣品管中分別取出樣品至200卩1微量管中，將200卩1微量管

21、放入CE通用樣品瓶中，蓋好藍色橡膠通用樣品瓶瓶蓋，放置樣品盤中待分析。4、緩沖液瓶的準備：SDS凝膠分離緩沖液分別加1.2ml（B列）與1.1ml（C列），超純水、酸性清洗液及堿性清洗液分別加1.5ml,廢液瓶中加超純水0.8ml。按照下圖位置放入相應(yīng)的緩沖液瓶。分離方法：高分辨率方法高效方法入口緩沖液，放置于側(cè)緩沖液托盤（入口緩沖液擺放見下圖）17-24at)17-14ft)鮒umi樹水H-24汨9濮膠廿離軟神秋E裾環(huán)第找】（M第檢】恢環(huán)第*24獻】（M第打-対撫孵U暢環(huán)弟仃-14撫趙純水ss8UH勰梯弧$51膠廿眾捌哦備環(huán)第丄咖【瞭F丄咖swsSUH燃柵撫srosJW冏港（解第i-m）哉怕制液（栢耳需口撫趣*術(shù)ABCDE出口緩沖液，放置于側(cè)緩沖液托盤（出口緩沖液排放見下圖）越魏水瞬環(huán)至17-24如趙純水|憎訊遨17-24）趙繪水（詡壞第I-*祝（韜壞第F3祝）趙純水#17-24ft)【梢環(huán)第H-243OSDS礙腔仆甜扭沖蔽（耆環(huán)第1閃4程）17-24ft)胡卑削打-刑沈、(#17-24ft)甜亮水熾耳第9-1&次SDS琥夜仆由盤沖嵌BCDE6、在計算機中打開軟件32Karat,建立新的序列程序，輸入對應(yīng)的供試品名稱與位置，并選擇相應(yīng)的分離方法對供試品進行分析測定。供試品分離方法關(guān)鍵參數(shù)見下表。電泳參數(shù)設(shè)定值樣品進樣5kV電動進樣秒樣品分離15kV下