上海交大醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)考試重點(diǎn)

1、一、顯微鏡技術(shù)1、分辨率（resolution）:用于表示人眼和儀器，能夠辨別兩點(diǎn)之間最小距離的標(biāo)志，是衡量顯微鏡性能的重要指標(biāo)。人眼的分辨率由人眼的生理結(jié)構(gòu)決定。光鏡由光波波長和物鏡數(shù)值孔徑?jīng)Q定。電鏡由電子束半波長決定。分辨率極限：人眼（0.1mm）;光鏡（0.2pm）;電鏡（0.2nm）顯微鏡技術(shù)優(yōu)化核心是提高分辨率，體現(xiàn)在兩個(gè)方面:（1）光源的采用（2）樣品制備和信號(hào)呈現(xiàn)方法使信噪比提高。2、顯微鏡分類:（1）光學(xué)顯微鏡:普通光學(xué)顯微鏡；熒光顯微鏡（激光掃描共聚焦顯微鏡、超高分辨率熒光顯微鏡、活細(xì)胞熒光工作站）；相差顯微鏡：觀察活細(xì)胞；微分干涉相差顯微鏡（DIC）:活細(xì)胞三維立體投影影像

2、（2）電子顯微鏡：透射電子顯微鏡（TEM）;掃描電子顯微鏡（SEM）;分析電子顯微鏡；高壓電子顯微鏡；冷凍電子顯微鏡（3）掃描探針顯微鏡：原子力顯微鏡3、普通光學(xué)顯微鏡主要三部分：聚光鏡、物鏡、目鏡;光源：可見光樣品制備5步：固定（甲醛）；脫水（乙醇）；包埋（石蠟）；冰凍切片（1-10pm）;蘇木精伊紅染色（HE染色）4、熒光顯微鏡光源：高壓汞燈、弧光燈熒光的來源：（1）細(xì)胞和組織自發(fā)熒光（2）外源導(dǎo)入熒光蛋白：動(dòng)態(tài)檢測、活體檢測、長時(shí)間檢測、容易融合（3）熒光染料：吖啶橙染色DNA（綠XRNA（橙）（4）熒光標(biāo)記抗體：熒光染料與抗體共價(jià)結(jié)合（5）熒光探針：金屬離子探針、細(xì)胞內(nèi)pH值、細(xì)胞內(nèi)活

3、性氧、線粒體跨膜電位。5、熒光素（Fluorphore）:吸收能量后具有發(fā)光現(xiàn)象的物質(zhì)，通常為吸收短波長的能量后發(fā)散出長波長的光，并隨照射停止而消失。熒光素發(fā)射光減弱（光漂白）或消失（淬滅）。6、激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）:以激光作為激發(fā)光源，采用光源針孔與檢測針孔共聚焦技術(shù)，對樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)。7、簡述激光掃描共聚焦顯微鏡的原理（光源點(diǎn),物點(diǎn),像點(diǎn)，三點(diǎn)共軛）以激光作為激發(fā)光源；結(jié)構(gòu)上采用雙針孔裝置，形成物像共聚焦的獨(dú)特設(shè)計(jì)；激光經(jīng)過聚光鏡焦平面上針孔形成點(diǎn)光源，再經(jīng)物鏡在焦平面對樣品逐點(diǎn)掃描。樣品上每個(gè)照射點(diǎn)經(jīng)反射鏡在像焦平面的探測針孔處成像，

4、被光電倍增管探測器接收，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號(hào)傳輸至計(jì)算機(jī)，最終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面共聚焦圖像。8、激光掃描共聚焦顯微鏡的功能:（1）薄層斷層掃描（光學(xué)切片）（2）多通道同時(shí)掃描:激光共聚焦顯微鏡可以多激光多通道同時(shí)掃描（3）ZOOM成像:在不變換鏡頭的情況下，對某幅圖片的局部放大，并進(jìn)行精細(xì)逐點(diǎn)掃描成像，獲得高分辨率圖像。（4）多維度掃描：Z軸掃描（垂直）或T掃描（時(shí)間）（5）熒光定量分析9、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中的應(yīng)用（1）靜態(tài):分子定位、定量分析、分子間相互作用（2）動(dòng)態(tài)：分子或細(xì)胞活動(dòng)的動(dòng)態(tài)變化：蛋白質(zhì)的移位；蛋白質(zhì)相互作用的研究（FRET）；分子運(yùn)動(dòng)的測量（FR

5、AP）;離子濃度變化趨勢的檢測10、簡述激光掃描共焦顯微鏡與熒光顯微鏡的差別。LSCM的優(yōu)缺點(diǎn)。類別LSCM熒光顯微鏡光源激光(紫外光、可見光、近紅外)短波長光源(多為紫外光)照明方式點(diǎn)照明、逐點(diǎn)掃描落射式樣本信號(hào)焦平面的樣本信號(hào)幾乎無次可有多個(gè)平面的樣本信號(hào)伴級熒光干擾隨相鄰部位干擾圖像采集系統(tǒng)熒光信號(hào)被PMT探測器接收實(shí)時(shí)觀測擻字化圖像，可以進(jìn)行圖像處理和定量分析照相機(jī)的原理LSCM的優(yōu)缺點(diǎn)：LSCM優(yōu)點(diǎn):(1)高水平分辨率：0.18pm(2)高垂直分辨率：沿Z軸逐層掃描(3)高靈敏度，信噪比良好(4)能定時(shí)、定位、定性、定量缺點(diǎn):(1)分辨率極限：0.15pim(2)觀測厚度：50-10

6、0pim(3)逐點(diǎn)掃描，成像速度慢(4)偽彩色11、LSCM和電子顯微鏡的區(qū)別激光共聚焦顯微鏡電子顯微鏡工作原理光波的透射電子的透射成像效果微米級(熒光標(biāo)記)納米級研究目的觀察分布、表達(dá)量觀察細(xì)微結(jié)構(gòu)12、超高分辨率熒光顯微鏡的原理：“突破”衍射極限，提高分辨率(50nm)(1)基于點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)調(diào)制：點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)變小(2)基于隨機(jī)單分子定位：不會(huì)有兩個(gè)靠的很近的點(diǎn)同時(shí)亮起來13、電子顯微鏡：以電子束為光源，電磁場為透鏡，利用電子信號(hào)成像，具有高分辨率和放大倍數(shù)的顯微鏡，用于研究組織和細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。14、電子束：又稱電子射線，電子束帶負(fù)電荷，具有光的波動(dòng)性、可折射性，電鏡利用電子束作為“光源”成像

7、。15、透射電子：當(dāng)樣品厚度小于100nm時(shí)，部分電子可穿透樣品，將穿透樣品的電子叫做透射電子,利用透射電子信息成像的稱為透射電鏡。16、二次電子：在入射電子的轟擊下,樣品表面5-50nm深度激發(fā)出來的電子稱為二次電子，利用二次電子信息成像的稱為掃描電鏡。17、TEM成像和工作原理：（1）電子束投射在樣品上，部分電子直接穿透樣品產(chǎn)生透射電子（2）帶有樣品信息的透射電子經(jīng)成像系統(tǒng)放大，投射到熒光屏上（3）透射電子多，熒光屏亮；反之熒光屏暗，熒光屏的亮暗程度與樣品微細(xì)結(jié)構(gòu)一一對應(yīng)，產(chǎn)生具有一定反差的黑白影像18、超薄切片：將環(huán)氧樹脂包埋的組織塊切成100nm以下的薄切片稱為超薄切片，超薄切片經(jīng)電子

8、染色后在TEM下觀察組織細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)。19、血管灌注固定：血管灌注固定是通過血管灌注適量的固定劑，在動(dòng)物體內(nèi)把活細(xì)胞在原位及時(shí)固定。血管灌注固定速度快，固定均勻，可減少離體或死亡后缺氧引起自發(fā)性的變化影響，特別是對腦、心肌、腎臟等對缺氧比較敏感的組織尤為重要。20、TEM的樣品制備（1）超薄切片技術(shù)（9步）：取材（1分鐘內(nèi)將新鮮標(biāo)本放入固定液）；預(yù)固定（新鮮配制2.5%戊二醛）；后固定（1%鋨酸）；脫水（乙醇和丙酮）；浸透；包埋聚合（環(huán)氧樹脂）；修塊；切片（半薄切片：500nm;超薄切片：50-100nm）;染色（甲苯胺藍(lán)）（2）負(fù)染色技術(shù)：通過重金屬鹽在樣品四周堆積,加強(qiáng)樣品外周的電子

9、密度，襯托樣品的形態(tài)和大小。(染色液：磷鎢酸、醋酸雙氧鈾)(3)免疫電鏡技術(shù)：是將免疫學(xué)方法與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，利用抗原與抗體特異結(jié)合的特性，在超微結(jié)構(gòu)水平定位特異大分子的技術(shù)。A、包埋前法：先免疫標(biāo)記，后包埋，制備超薄切片；包埋后法：先包埋，制備超薄切片，后免疫標(biāo)記；冷凍超薄切片法：將標(biāo)本直接切成超薄切片，進(jìn)行免疫反應(yīng)，電鏡觀察。B、推薦固定液：34%多聚甲醛+0.1%0.5%戊二醛；C、要求：免疫組化結(jié)果一定要好；固定液配制要新鮮;盡快處理標(biāo)本。21、在樣本制備過程中為什么要進(jìn)行半薄切片定位？(1)選取超薄切片的部位，超薄切片的面積一般要小于0.5mm2，要經(jīng)過半薄切片來選取有意義的部

10、位。(2)對同一部位進(jìn)行光、電鏡對比觀察，在較大范圍內(nèi)了解組織結(jié)構(gòu)、病變部位和病理性質(zhì)，有利于更確切的認(rèn)識(shí)超薄切片中的結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系。22、要了解細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)變化，選擇哪種類型的電鏡，為保證生物樣品良好的超微結(jié)構(gòu)，在樣本取材及固定時(shí)應(yīng)注意什么？了解細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)變化應(yīng)選擇透射電子顯微鏡(TEM)為保證良好的超微結(jié)構(gòu)，在樣本取材及固定時(shí)應(yīng)注意做到快、小、輕、冷。(1)快：在1分鐘內(nèi)固定組織，盡可能保持其活體狀態(tài)，因?yàn)樗查g的拖延都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。(2)?。航M織塊必須切成1mm3的小塊，組織塊過大其中央得不到及時(shí)固定會(huì)發(fā)生細(xì)胞自溶現(xiàn)象。(3)輕：不要牽拉、鋸、擠壓組織。要用銳利

11、的刀片，避免細(xì)胞受到損傷。(4)冷：低溫操作，49保存，降低酶的活性，避免組織發(fā)生自溶。23、在透射電鏡樣本取材時(shí)，樣本不可大于1mm3，并在1分鐘以內(nèi)完成固定。請問如果組織塊過大會(huì)出現(xiàn)什么后果？沒有及時(shí)固定的組織電鏡下會(huì)出現(xiàn)何種改變？由于電鏡固定液戊二醛對組織的穿透能力較弱，如果組織塊過大會(huì)造成組織中心得不到及時(shí)固定，在電鏡下沒有得到及時(shí)固定組織細(xì)胞的細(xì)胞器會(huì)發(fā)生變性，特別是對缺血乏氧十分敏感的線粒體會(huì)出現(xiàn)腫脹和空泡變性等改變。24、如何描述一張電鏡圖片。（1）細(xì)胞整體：大小、形狀、細(xì)胞膜和突起以及細(xì)胞間的連接（2）細(xì)胞核：大小、形狀、核仁、染色質(zhì)等（3）細(xì)胞質(zhì)：各種細(xì)胞器的數(shù)量、分布、形狀

12、等（Mit、RER、Ri、Ly、Gol.）25、TEM在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用（1）細(xì)胞器、組織器官的超微結(jié)構(gòu)（2）原核細(xì)胞、病毒的超微結(jié)構(gòu)（3）超微病理變化（病理診斷）（4）細(xì)胞成分定位（5）生物材料復(fù)合體26、掃描電鏡的樣品制備過程（6步）：取材（充分暴露并保護(hù)觀察面：5x5mm）;清洗（用生理鹽水仔細(xì)漂洗觀察面）；固定（2.5%戊二醛和1%鋨酸固定）；脫水（丙酮逐級脫水，醋酸異戊酯置換）；干燥：（臨界點(diǎn)干燥）；鍍膜（離子濺射鍍膜或真空鍍膜）27、掃描電子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用：（1）血細(xì)胞、細(xì)菌、培養(yǎng)細(xì)胞的整體形態(tài)、表面突起和細(xì)胞間相互關(guān)系（2）消化道,呼吸道,血管等空腔組織的表面結(jié)構(gòu)（3）

13、植物、昆蟲等（4）生物材料復(fù)合體28、掃描電鏡用于觀察組織表面結(jié)構(gòu)，因此取材時(shí)必需要充分暴露組織表面結(jié)構(gòu)，請問常用的方法和注意事項(xiàng)有哪些？在樣品取材時(shí)必須保護(hù)好并充分暴露觀察面，避免損傷要觀察的部位，易卷曲的樣品,如氣管、胃、腸粘膜可固定在濾紙上展平，要將表面的血液、粘液用生理鹽水或緩沖液仔細(xì)漂洗干凈，對于粘稠附著物還可以使用酶消化法。29、請從成像信號(hào)、樣品制備、圖象特點(diǎn)和應(yīng)用幾方面對TEM和SEM做以比較。類別TMESEM分辨率0.1nm0.6nm放大100萬倍80萬倍成像信號(hào)透射電子信號(hào)利用二次電子信號(hào)成像樣品制備制成超薄切片等，制備過程復(fù)雜方法較簡單，標(biāo)本可大而厚圖像特點(diǎn)二維結(jié)構(gòu)，平面

14、圖像三維結(jié)構(gòu)圖像，立體感強(qiáng)應(yīng)用觀察組織細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)觀察樣品表面及其斷面立體構(gòu)形貌二、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)1、原位觀察化學(xué)成分，提供的信息：（1）推測化學(xué)成分（大分子）的可能性（2）觀察生理、病理狀態(tài)下大分子動(dòng)態(tài)變化指示大分子所在的特異細(xì)胞，觀察細(xì)胞在組織的分布2、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的條件下，借助細(xì)胞中的化學(xué)反應(yīng)在細(xì)胞原位確定化學(xué)成分的分布及這些成分在細(xì)胞活動(dòng)中的動(dòng)態(tài)變化的技術(shù)，用以闡明細(xì)胞化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。包括酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、放射自顯影技術(shù)和原位雜交等。3、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)特點(diǎn)：(1)原位(保持組織細(xì)胞的天然結(jié)構(gòu))(2)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)及可見性(3)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的

15、觀察：顯微鏡、流式4、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要包括：(1)酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：1.酶+底物反應(yīng)；2.顯色反應(yīng)。顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的分布及酶活性強(qiáng)弱。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：1.抗原+抗體反應(yīng)；2.顯色反應(yīng)(3)放射自顯影：1.放射性同位素衰變和射線的釋放反應(yīng)；2.感光(4)原位雜交技術(shù)等：1.核酸雜交反應(yīng)；2.顯色反應(yīng)5、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)通用流程：(1)組織細(xì)胞固定(保持原位)(2)石蠟包埋或冷凍(3)切片(利于反應(yīng)，利于觀察)(4)化學(xué)反應(yīng)(5)顯色反應(yīng)6、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(IHC):把組織細(xì)胞中的特異分子作為抗原，利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，用顯微鏡下可見的標(biāo)記物直接或間接標(biāo)記抗體或抗原抗體復(fù)

16、合物，使之在顯微鏡下可見，從而間接地顯示抗原，達(dá)到在細(xì)胞或細(xì)胞器水平定位特異分子的目的。特異蛋白質(zhì)定位：1.大分子的組織和細(xì)胞水平定位2.細(xì)胞內(nèi)大分子的固定亞細(xì)胞定位3.細(xì)胞內(nèi)大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)或移位4.細(xì)胞內(nèi)定位固定的大分子的動(dòng)態(tài)變化5.細(xì)胞內(nèi)大分子的共定位7、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)原理一、抗原：凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體特異結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原，酶、受體、抗體二、抗體：結(jié)合抗原、結(jié)合抗種屬抗體：識(shí)別一抗的種屬特異性，并能夠因此結(jié)合一抗,稱為二抗三、免疫反應(yīng)的特異性四、免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)：（1）直接法；（2）間接法優(yōu)點(diǎn)：避免標(biāo)記造成對抗體與抗原結(jié)合的影響；信號(hào)增強(qiáng)；標(biāo)記物多。五、標(biāo)記物的顯色反應(yīng)（光鏡和

17、電鏡）：（1）免疫熒光；（2）免疫酶；（3）免疫膠體金顆粒8、免疫熒光技術(shù)（IF）:免疫熒光技術(shù)將熒光素作為標(biāo)記物使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質(zhì)的定位。（培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物組織）9、免疫熒光技術(shù)優(yōu)點(diǎn):（1）雙重或多重標(biāo)記，同時(shí)比較不同分子的位置及量的關(guān)系。（2）雙重或多重標(biāo)記，同時(shí)染色細(xì)胞器和感興趣分子，可顯示分子的亞細(xì)胞定位信息。（3）根據(jù)熒光素的強(qiáng)度，進(jìn)行半定量分析。10、免疫酶技術(shù):是將酶作為標(biāo)記物使組織細(xì)胞中形成的抗原抗體復(fù)合物得到標(biāo)記，再通過酶細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顯微鏡下可見的顯色物質(zhì)，間接顯示抗原物質(zhì)的定位。普通光學(xué)顯微鏡即可觀察。（動(dòng)物組織、多種類型

18、細(xì)胞）常用標(biāo)記酶：辣根過氧化物酶（HRP）;堿性磷酸酶（AKP）11、親和物質(zhì)：具有多價(jià)能力的物質(zhì)，與另一種親和物質(zhì)有高度親和力，又能與抗體、蛋白質(zhì)及各種標(biāo)記物（尤其是酶）結(jié)合。12、生物素系統(tǒng)標(biāo)記酶和抗體：（1）LSAB法：標(biāo)記鏈球菌親和素-生物素技術(shù)特異性抗體（一抗）先與組織細(xì)胞中的抗原結(jié)合生物素化抗體（二抗）再與一抗結(jié)合鏈球菌親和素聯(lián)接的過氧化物酶與生物素化抗體結(jié)合（2）ABC法：親和素-生物素-酶復(fù)合物技術(shù)親和素與生物素偶聯(lián)的過氧化物酶組合成親和素生物素酶復(fù)合物特異性抗體（一抗）先與組織細(xì)胞中的抗原結(jié)合生物素化抗體（二抗）再與一抗結(jié)合復(fù)合物與生物素化抗體結(jié)合13、免疫親和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：（1

19、）觀察定位信息時(shí)，可觀察感興趣分子在細(xì)胞中的相對定位，也可觀察分子在組織中的細(xì)胞特異性；（在組織樣品中應(yīng)用較多）（2）同時(shí)觀察陽性信號(hào)和陰性信號(hào)；（3）反應(yīng)后標(biāo)本材料可長期保存。14、免疫膠體金技術(shù)：以電鏡下可見的膠體金作為抗體標(biāo)記物，間接顯示組織細(xì)胞中特異分子的技術(shù)。（培養(yǎng)細(xì)胞）15、原位雜交技術(shù)（ISH）:利用核苷酸堿基配對原理，用含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈即探針，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，通過檢測標(biāo)記探針，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。變性：雙鏈DNA分子在一些因素作用下兩條鏈解離的過程稱為變性復(fù)性：變性的兩條互補(bǔ)DNA單鏈在適當(dāng)條件下重

20、新締合成雙鏈的過程稱為復(fù)性雜交探針：經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈，其序列已知，或序列未知但已知其針對何靶分子。主要有cDNA、RNA和寡核苷酸三種。盎靶分子：指所要探測的核酸分子或核苷酸序列嚴(yán)格度：在某些條件下，探針可以與含不相配堿基的核酸序列結(jié)合而形成不穩(wěn)定的雜交體。決定探針是否與含不相配堿基的核酸序列結(jié)合的條件稱為嚴(yán)格度。高嚴(yán)格度條件下，堿基完全互補(bǔ)的雙鏈才可形成雜交體。低嚴(yán)格度條件下，堿基對不完全互補(bǔ)的雙鏈也能形成雜交體。16、原位雜交技術(shù)中如何應(yīng)用了其他幾種細(xì)胞化學(xué)技術(shù)？為什么說原位雜交技術(shù)是分子生物學(xué)和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的結(jié)合？標(biāo)記的核酸探針與組織細(xì)胞中靶核酸分子按堿基配對的原則結(jié)合形成雜交體這是分

21、子生物學(xué)技術(shù)檢測雜交體的存在可選用放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，如探針標(biāo)記的是同位素，則選用放射自顯影技術(shù)；如用地高辛標(biāo)記核酸探針，使用堿性磷酸酶聯(lián)結(jié)的小鼠抗地高辛抗體與探針結(jié)合，這里應(yīng)用的是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)為了使酶可見，再加入其底物四唑氮藍(lán)和吲哚酚，最終形成藍(lán)紫色物質(zhì)，這就是酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，最終產(chǎn)生的藍(lán)紫色物質(zhì)-酶的定位-探針-靶核酸17、原位雜交技術(shù)常常組合了其他組織化學(xué)技術(shù)。簡述如果你使用其中一種組合你需要準(zhǔn)備。(1)選擇地高辛標(biāo)記的特異性CDNA探針-用AKP標(biāo)記的小鼠抗地高辛抗體與雜交體結(jié)合-在孵育液中加入AKP的反應(yīng)與捕捉底物對NCIP/NBT-得到藍(lán)紫色的沉淀。(2)使用光學(xué)顯微

22、鏡觀察藍(lán)紫色沉淀即可間接定位雜交體，驗(yàn)證靶核苷酸的存在。18、如果你的研究課題分別涉及到在培養(yǎng)細(xì)胞或組織切片上定位蛋白質(zhì)的要求，你如何考慮對技術(shù)的選擇。(1)組織和細(xì)胞水平定位：IHC+光鏡(酶標(biāo))/熒光顯微鏡(熒光標(biāo))/共聚焦(熒光標(biāo))(2)亞細(xì)胞定位：IHC+電鏡(膠體金標(biāo))熒光+共聚焦(3)細(xì)胞內(nèi)大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)或移位translocation實(shí)驗(yàn)處理+綜合1/2/5(4)細(xì)胞內(nèi)定位固定的大分子含量的動(dòng)態(tài)變化dynamics實(shí)驗(yàn)處理+綜合1/2/5(5)細(xì)胞內(nèi)大分子的共定位co-localization免疫熒光+confocal共定位(轉(zhuǎn)染+重組tag+免疫熒光；或轉(zhuǎn)染+重組GFP);也可以

23、用連續(xù)切片也可用大小金標(biāo)+電鏡19、簡述如何應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)初步闡明一個(gè)新的蛋白質(zhì)的定位和功能。(1)定位如上題(2)弄清了定位、動(dòng)態(tài)及共定位之后，需要了解功能還可以了解生成：DNA水平：SouthernblotDNAchip；qPCRmRNA水平：northernblotq-rtPCR(不過這些好像都是分生的內(nèi)容)(3)功能：作為酶的功能、作為遞質(zhì)的功能、作為轉(zhuǎn)錄因子的功能找出了相互作用的蛋白，再從這associate著手確定新蛋白的功能。:比如新蛋白是否影響已知蛋白的生成和降解，是否影響已知蛋白行使功能降解/轉(zhuǎn)運(yùn)。Plus尋找互相作用方式的分生方法cDNA文庫+酵母雙雜交，蛋白質(zhì)體外結(jié)合

24、實(shí)驗(yàn)(pull-downassay)+質(zhì)譜分析，CoIP首先按蛋白質(zhì)組學(xué)的方法做蛋白指紋圖譜比對數(shù)據(jù)庫尋找類似結(jié)構(gòu)域，對它的功能進(jìn)行合理的預(yù)測；然后根據(jù)預(yù)測的結(jié)果設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)大體可以由“過表達(dá)會(huì)怎樣“”敲除會(huì)怎樣”兩個(gè)角度出發(fā)，從宏觀上觀察細(xì)胞的形狀、功能改變，從微觀上定性定量上下游分子量的改變，最后在活體環(huán)境中驗(yàn)證。20、定量檢測一批光鏡切片上含有某種蛋白質(zhì)的細(xì)胞的數(shù)目首先對切片上的全部細(xì)胞進(jìn)行針對目的蛋白的熒光探針特異性標(biāo)記（熒光染料，熒光標(biāo)記抗體，外源導(dǎo)入熒光蛋白），同時(shí)對細(xì)胞行核復(fù)染。再以熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。三、離心技術(shù)1、離心技術(shù)（Centrifuge）:利用溶

25、液中顆粒密度、大小等特性，用旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力使不同特性顆粒從溶液中分離并沉降，從而達(dá)到分離、濃縮、提純和鑒定的目的，稱為離心技術(shù)。2、決定離心行為的主要因素:（1）顆粒的屬性:顆粒大小、密度等特性（2）溶液和設(shè)備:離心機(jī)、離心介質(zhì)“三要素”：顆粒的沉降系數(shù)、相對離心力（RCF）離心時(shí)間3、沉降系數(shù):顆粒在單位離心力的作用下的移動(dòng)速度。決定沉降速度的因素:顆粒大??；顆粒密度；溶液介質(zhì)密度和粘度4、相對離心力:離心分離時(shí)，作用在懸浮顆粒上的力與其地球重力（平時(shí)質(zhì)量）的比值。5、離心的適用范圍:（1）分離細(xì)胞或其他的懸浮顆粒；（2）從組織或細(xì)胞勻漿中分離細(xì)胞器；（3）分離病毒和大分子，包括DNA、R

26、NA、蛋白質(zhì)和脂類。6、差速離心法:通過一系列遞增速度的離心，將不同大小顆粒分離。先在低速離心條件下把大的顆粒沉降到管底，其它顆粒留在上清液中；然后以較高的速度離心，把較大的顆粒沉淀于管底。這樣依次把不同大小的顆粒逐級分離。用途:分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分特點(diǎn):介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心；操作簡單；分離純度不高。7、密度梯度離心法理想的溶液介質(zhì)（蔗糖）:形成的溶液密度范圍大；粘度低；對細(xì)胞成分損傷?。浑x心分離后容易去除；濃度容易測定；便宜。（1）移動(dòng)區(qū)帶離心法原理：用梯度蔗糖或甘油作為介質(zhì)，將要分離的樣品放在介質(zhì)表面，形成一個(gè)狹帶，然后超速離心，使不同大小的顆粒以不同的速度

27、向管底方向移動(dòng)，形成一系列區(qū)帶，從管底小孔中分次收集各種顆粒成分。用途：分離有大小和密度差異的細(xì)胞或細(xì)胞器。特點(diǎn)：介質(zhì)為密度梯度溶液，且密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度（rprm）;必須注意離心時(shí)間（t），不能使所有顆粒都沉到管底。（2）等密度離心法原理：離心時(shí)采用包括各種顆粒密度范圍的梯度介質(zhì)，被分離顆粒達(dá)到與其相同的密度介質(zhì)時(shí)不再移動(dòng)，形成一系列區(qū)帶，然后從管底收集。用途：分離密度不等的顆粒，適用于病毒、DNA、RNA、蛋白質(zhì)等。特點(diǎn)：介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度（rprm）。所需的力場通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超

28、速離心。8、細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的分離：（1）細(xì)胞沉淀（2）細(xì)胞破碎（滲透壓、超聲波、機(jī)械力研磨或剪切、反復(fù)凍融）（3）細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的分離離心技術(shù)（差速分離、梯度純化）（4）分離細(xì)胞器的鑒定和評價(jià)（形態(tài)：顯微鏡；生化分析：細(xì)胞器標(biāo)志酶）四、細(xì)胞培養(yǎng)1、細(xì)胞培養(yǎng)：從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，對這些組織或細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之生存和生長，并保持一定的結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。2、簡述培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞的異同。培養(yǎng)細(xì)胞體內(nèi)細(xì)胞無神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)體液調(diào)節(jié)無其他類型細(xì)胞影響多種類型細(xì)胞相互影響細(xì)胞的許多外來信號(hào)被切斷基因表達(dá)受到外來信號(hào)調(diào)節(jié)1特定分化基因表達(dá)減

29、弱或停止增殖過程中不斷發(fā)生著分化2增殖活動(dòng)維持（由一般到特殊）（由特殊到一般）與體內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的差異高度特化的結(jié)構(gòu)和功能特征：失去原有形態(tài)，分化特性減弱，形態(tài)特征：高度特化；細(xì)胞更新，干細(xì)胞來源的和功能趨于單一；一定代數(shù)后衰老死亡，或細(xì)胞分化發(fā)生轉(zhuǎn)化，獲不死性而成為能無限傳代；對營養(yǎng)要求高；大部分貼壁生長3、培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件：（1）高要求的營養(yǎng)物質(zhì)：A、合成培養(yǎng)基：提供基本的、與體內(nèi)相同的小分子營養(yǎng)物質(zhì)，如：葡萄糖、氨基酸、無機(jī)離子、維生素、微量元素。B、添加物：血清（5-10%），提供多種生長因子等活性物質(zhì)（大分子物質(zhì)）（2）嚴(yán)格的環(huán)境條件：溫度（35-37度）；氣體（5%CO2）；酸

30、堿度（pH7.2-7.4酚紅指示）；支持物：玻璃、塑料、滋養(yǎng)層4、培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn)：（1）貼附型：貼附于支持物表面，單層生長；失去在體內(nèi)原有形態(tài);反映胚層起源情況；有接觸抑制特征。大多數(shù)細(xì)胞屬此型（2）懸浮型：不貼附在支持物表面，以懸浮狀態(tài)生長；單個(gè)分散或成團(tuán)。各種源自血液的細(xì)胞、骨髓、脾細(xì)胞。5、傳代：培養(yǎng)容器中細(xì)胞增殖至一定密度后，生存空間及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，需按一定比例分離，接種至新的培養(yǎng)容器并更新培養(yǎng)液的過程。6、生命期:細(xì)胞在體外培養(yǎng)中持續(xù)增殖和存活的時(shí)間。一般可分為原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。（1）原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出細(xì)胞接種后到第一次傳代。一般維持14周。（2）傳代期：原代細(xì)胞

31、一經(jīng)傳代就成為細(xì)胞系（cellline），進(jìn)入傳代期。持續(xù)時(shí)間最長。一般傳1050代（Hayflick極限）。（3）衰退期：細(xì)胞增殖緩慢、停止至死亡。7、Hayflick極限：體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力不是無限的，傳代次數(shù)有一定的界限。8、細(xì)胞凍存（液氮罐）：目的：（1）保存細(xì)胞株（2）保持盡量少的傳代次數(shù)和較均一的細(xì)胞狀態(tài)方法：培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑：二甲基亞砜（DMSO）;緩慢地凍結(jié)；貯存在-1809以下低溫。（原理：在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會(huì)形成結(jié)晶，影響細(xì)胞功能甚至死亡，凍存失敗。）9、細(xì)胞復(fù)蘇（慢凍速融）：將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入37-409水浴。1m

32、in內(nèi)融化，去除凍存保護(hù)液，更換正常培養(yǎng)基。（胞外結(jié)晶很快融化，減少水分滲入細(xì)胞）10、培養(yǎng)細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)及局限優(yōu)點(diǎn)：（1）人工培養(yǎng)條件易于改變并能嚴(yán)格控制，便于研究觀察各種因素對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和各種生命活動(dòng)規(guī)律的影響；（2）細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中可以長期存活和傳代，因此可以比較經(jīng)濟(jì)地、大量地提供在同一時(shí)期、條件相同、性狀相似的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)樣本。局限性：（1）主要是細(xì)胞離體以后失去與體內(nèi)環(huán)境的密切聯(lián)系，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和不同細(xì)胞間的相互作用，分化能力降低，增殖活動(dòng)維持，細(xì)胞性狀由特殊趨向一般，其形態(tài)功能與體內(nèi)細(xì)胞存在差異（2）對環(huán)境適應(yīng)力差；容易污染；對營養(yǎng)要求高；大部分需要附著載體生長11、

33、如果是培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量一定要達(dá)到多少？細(xì)胞數(shù)量一定要達(dá)到1x10-7五、細(xì)胞工程1、細(xì)胞工程：運(yùn)用現(xiàn)代的細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等手段，根據(jù)實(shí)踐需要，對細(xì)胞、細(xì)胞器、生物大分子進(jìn)行各種操作，重組/重塑細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、成分組成或特性，以達(dá)到研究基因功能、蛋白質(zhì)和細(xì)胞性狀，或獲得特定的大分子、細(xì)胞或生物體的目的。（核酸導(dǎo)入技術(shù)、細(xì)胞重編程技術(shù)、基因編輯技術(shù)）2、核酸導(dǎo)入：將特異的核酸（DNA或RNA）導(dǎo)入到真核細(xì)胞中3、核酸導(dǎo)入方法分類：（1）化學(xué)方法：構(gòu)建非病毒載體（脂質(zhì)體載體、DEAE-葡聚糖法、磷酸鈣法）（2）生物學(xué)方法：構(gòu)建病毒載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒）（3）物理方法：DNA直

34、接注射、顆粒轟擊技術(shù)4、脂質(zhì)體法：陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合體，通過膜的融合或細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞5、病毒感染：病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞復(fù)制周期：吸附、侵入、增殖、成熟（裝配）、裂解（釋放）。6、電轉(zhuǎn)法：應(yīng)用短暫的高壓電流脈沖使多種哺乳動(dòng)物與植物細(xì)胞質(zhì)膜形成納米級微孔，DNA通過這些微孔關(guān)閉時(shí)膜成分的再分布而直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。7、核酸導(dǎo)入方法比較類別脂質(zhì)體法病毒法電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染方式穩(wěn)定轉(zhuǎn)染穩(wěn)定/瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞所有細(xì)胞宿主細(xì)胞所有細(xì)胞特點(diǎn)使用方法簡單用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高可攜帶大片段DNA需考慮安全因素！但致死率

35、咼沒有免疫原性轉(zhuǎn)染效率高但有細(xì)胞毒性8、細(xì)胞重編程：細(xì)胞核移植；轉(zhuǎn)錄因子（在特定條件下，如：存在外源轉(zhuǎn)錄因子、mRNA、蛋白質(zhì)，和/或化學(xué)小分子，將分化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成為具有全能性的細(xì)胞類型的技術(shù)。）9、細(xì)胞重編程基本步驟：載體構(gòu)建、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、感染MEF、細(xì)胞培養(yǎng)、克隆鑒定、細(xì)胞凍存。10、CRISPR技術(shù)的原理和應(yīng)用原理：CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。crRNA（CRISPR-derivedRNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activatingRNA）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此

36、復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白與crRNA配對的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。應(yīng)用：對基因進(jìn)行定點(diǎn)的精確編輯、基因激活、疾病模型構(gòu)建、基因治療六、流式細(xì)胞術(shù)1、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）:是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項(xiàng)能快速、精確的對單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。（分析型、分選型）2、流式細(xì)胞術(shù)光信號(hào)檢測（1）散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光（FSC）;側(cè)向散射光（SSC）.（2）熒光信號(hào):自發(fā)熒光（細(xì)胞色素因子、核黃素）；微弱特異熒光:標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。3、前向散射光:FSC信號(hào)方向與激光束平行，偏離度一般在1-6度范圍內(nèi)，亦稱小

37、角度散射光，主要反映被測細(xì)胞的體積大小和活力。4、側(cè)向散射光：SSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直，亦稱90度散射光，其信號(hào)強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化。5、標(biāo)記抗體的熒光素?zé)晒馑胤肿蛹ぐl(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）中文名FITC490520異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白6、核酸熒光染料（1）PI（碘化丙啶535,623:可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于DNA分析，需要用RNase處理細(xì)胞排除RNA對DNA熒光定量的影響；PI不能透過活細(xì)胞膜，常用于鑒定死細(xì)胞。（2）DAPI（358,456:可

38、以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料，一種理想的DNA定量染料。（3）PY（派若寧560,573:RNA染料，能進(jìn)入活細(xì)胞。（4）A0（吖啶橙509,525:DNA、RNA染料，染色后DNA呈黃綠色熒光，RNA呈橙黃色熒光，可進(jìn)行DNA/RNA雙參數(shù)分析。7、FCM的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)方式:流式細(xì)胞術(shù)采用ListMode方式存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。即用表格的方式將每一個(gè)被測細(xì)胞的眾多原始測量數(shù)據(jù)全部記錄下來，成為一個(gè)數(shù)據(jù)文件。8、FCM的顯示方式:（1）單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示:以分布直方圖來顯示，橫軸為該參數(shù)測量強(qiáng)度相對值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以是線性的，也可以是對數(shù)的?？v軸一般是細(xì)胞

39、數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。（2）雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示:細(xì)胞雙參數(shù)測定不僅能提供二個(gè)參數(shù)各自與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，更重要的是獲得了這二參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，其中包含了更多的生物學(xué)信息。1）二維散點(diǎn)圖：在二維圖上，X軸代表第一個(gè)測量參數(shù)，丫軸代表第二個(gè)測量參數(shù)。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞.2）等高線圖:在散點(diǎn)圖的基礎(chǔ)上，用等高線來表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。3）二維密度圖:在散點(diǎn)圖的基礎(chǔ)上，用不同的顏色的點(diǎn)代表該點(diǎn)處不同的細(xì)胞數(shù)。4）假三維圖:縱軸與橫軸分別代表被測細(xì)胞的兩個(gè)測量參數(shù)，Z軸為細(xì)胞數(shù)。（3）三參數(shù)及多參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示：三維坐標(biāo)圖：X、丫、z軸分別代表一測量參數(shù)。用若干個(gè)單參數(shù)

40、直方圖及雙參數(shù)圖組合來顯示數(shù)據(jù)。選取感興趣的參數(shù)范圍，調(diào)出該范圍內(nèi)細(xì)胞群體的其他參數(shù)即“設(shè)門”分析。可以是單參數(shù)設(shè)門，也可以是雙參數(shù)設(shè)門。單參數(shù)設(shè)門調(diào)出雙參數(shù)顯示簡稱“一調(diào)二?！辈浑y理解也有“一調(diào)一”和“二調(diào)一”和“二調(diào)二”等。9、FCM設(shè)門與數(shù)據(jù)分析（1）H（Gate，簡寫G）是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語，F(xiàn)CM數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。（2）R（Region，區(qū)域）。門可以是單一區(qū)域（G=R1），也可以是幾個(gè)區(qū)域組合在一起:G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2。10、流式細(xì)胞術(shù)操作流程：（1）培養(yǎng)細(xì)胞，血液骨髓，新鮮組織（2）單細(xì)胞懸液制備（3）熒光染色（

41、4）上機(jī)檢測（表型測定、細(xì)胞分選）11、樣品制備涉及到的：（1）制備單個(gè)分散細(xì)胞懸液的技術(shù)（2）選擇性分離細(xì)胞亞群的技術(shù)（3）熒光細(xì)胞化學(xué)染色的技術(shù)12、FCM技術(shù)中常用的制備單細(xì)胞懸液的方法及各有哪些特點(diǎn)?方法：（1）單層培養(yǎng)細(xì)胞、血液、各種脫落細(xì)胞等樣品，標(biāo)本經(jīng)過簡單的制備懸液，離心分離處理，就可以得到分散較好的單個(gè)細(xì)胞懸液，是理想的流式細(xì)胞術(shù)檢測對象。（2）對于不同組織來源的實(shí)體組織標(biāo)本，采用酶消化法、機(jī)械法和化學(xué)試劑處理法來分散細(xì)胞。特點(diǎn)：（1）機(jī)械法往往常成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，制成的細(xì)胞懸液中細(xì)胞碎片、團(tuán)塊多，細(xì)胞產(chǎn)量低。需采用適當(dāng)?shù)姆绞饺コ绊慒CM結(jié)果的細(xì)胞碎片與團(tuán)塊。如用低速離心去

42、碎片，用尼龍網(wǎng)過濾團(tuán)塊等，也可利用數(shù)據(jù)處理的方法排除團(tuán)塊和碎片的干擾。酶學(xué)法對實(shí)體組織的分散效果較理想，但會(huì)對所測化學(xué)成份造成不良影響。(3)化學(xué)試劑處理法：用化學(xué)法細(xì)胞存活率低、細(xì)胞產(chǎn)額低，細(xì)胞碎片和聚集量不穩(wěn)定?？傊瓼CM所測細(xì)胞是單個(gè)分散狀態(tài)；要求細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞碎片盡可能少；細(xì)胞的活性不受損害，以保證下一步的熒光染色處理不受影響。所以在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，一個(gè)理想的單個(gè)細(xì)胞分散的細(xì)胞懸液樣品的制備往往是兩種或多種方法的結(jié)合使用，才能獲得理想的細(xì)胞懸液。13、酶消化法應(yīng)注意哪些條件：(1)配制酶溶液試劑時(shí)要兼顧酶反應(yīng)的適宜條件與活細(xì)胞要求的生理環(huán)境，其中包括滲透壓，pH值(緩沖液)，各種離子濃度，

43、酶激動(dòng)劑等。(2)根據(jù)標(biāo)本種類和實(shí)驗(yàn)要求選擇適宜的酶及濃度：胃蛋白酶0.5%；膠原酶0.1%；胰蛋白酶0.25%(含1-10pg/mlDNase)。(3)作用溫度作用時(shí)間與酶的用量：一般選擇379,15-20分鐘，每克組織10-15ml。具體操作時(shí)根據(jù)組織類型與選用的酶進(jìn)行調(diào)整。一次消化未徹底可反復(fù)數(shù)次，直至組織塊完全消失。終止酶消化反應(yīng)的方法和措施：加酶抑制劑(如大豆胰蛋白酶抑制劑等)；降低酶反應(yīng)溫度,將細(xì)胞懸液管移至冰水浴中；反復(fù)離心漂洗,移去酶消化液,徹底終止酶消化過程等。對于蛋白酶,加入少量血清以減弱酶對細(xì)胞的不利影響。14、熒光標(biāo)記物：熒光染料、熒光素偶聯(lián)抗體、熒光蛋白。通過熒光染色

44、，F(xiàn)CM可檢測下列細(xì)胞成分：(1)表面標(biāo)記物(2)胞漿標(biāo)記物(3)核內(nèi)標(biāo)記物15、熒光細(xì)胞化學(xué)的2個(gè)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：(1)特異性：所用熒光染料與所感興趣的細(xì)胞成份的特異性結(jié)合。(2)化學(xué)定量關(guān)系：在相同的條件下,標(biāo)記的熒光強(qiáng)度與被標(biāo)記的生化成份的含量或活性之間有嚴(yán)格的化學(xué)定量關(guān)系。16、對照的設(shè)置：（1）空白對照：細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被FCM靈敏的檢測到，這種未染色的細(xì)胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。（2）陽性對照：設(shè)置陽性對照是為了檢測熒光抗體是否有效，并不是每次分析時(shí)都必須設(shè)置（3）單標(biāo)對照：兩色或多色實(shí)驗(yàn)時(shí)須設(shè)置單標(biāo)對照，用于補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)；單標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)不需要。17、光譜重疊：目前使用的各

45、種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射的峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，因而少量的熒光信號(hào)會(huì)被另一通道檢測到的現(xiàn)象。18、FCM熒光補(bǔ)償：因?yàn)闊晒夤庾V彼此之間有重疊，為排除多信號(hào)相互之間的干擾，利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)。19、敘述層流及其在FCM中的應(yīng)用.層流是流體的一種流動(dòng)狀態(tài)。若流體在管內(nèi)流動(dòng)時(shí)，其質(zhì)點(diǎn)沿著與管軸平行的方向作平滑直線運(yùn)動(dòng)，此種流動(dòng)稱為層流。在管道中液體穩(wěn)定流動(dòng)時(shí)是以管道的軸線為中心分層流動(dòng)的。中心軸處液流速度最快，中心軸外流速遞減。層流只出現(xiàn)在雷諾數(shù)Re（Re=dpV/n）2300的情況中，即流體密度p、平均流速

46、V和管徑直徑d都較小，或流體粘度n很大的情況中。流式細(xì)胞術(shù)中所用的流動(dòng)室就是根據(jù)層流技術(shù)設(shè)計(jì)的。它采用液體動(dòng)力學(xué)分層鞘流技術(shù)，以鞘液包圍在樣品流周圍，保證樣品中的每一細(xì)胞都沿流動(dòng)室的中心軸運(yùn)動(dòng)。從而實(shí)現(xiàn)每一細(xì)胞以相同的速度、相同方向、相同的軌跡逐個(gè)依次通過檢測區(qū)，流動(dòng)室也可稱為單細(xì)胞流發(fā)生器。20、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用（1）檢測細(xì)胞周期：處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞DNA含量不同，G0/G1期細(xì)胞含有二倍體量的DNA,G2/M期細(xì)胞含有四倍體量的DNA，而S期細(xì)胞DNA含量處于二倍體和四倍體量之間。DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的

47、多少。（PI標(biāo)記法）（2）檢測細(xì)胞凋亡：1）凋亡細(xì)胞核小體崩解，DNA含量減少，加之由于DNA的降解，與熒光染料的結(jié)合減少，因此DNA染料的著色能力下降，熒光強(qiáng)度降低，表現(xiàn)在G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰，即亞G1峰（凋亡峰）。2）AnnexinV/PI雙染法：早期凋亡時(shí)，PS外翻到胞外側(cè)。AnnexinV是一種Ca2+依賴性的對PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識(shí)別膜表面是否有PS，從而識(shí)別凋亡細(xì)胞。PI常用于鑒別死細(xì)胞。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然是完整的，所以PI不能進(jìn)入早期凋亡細(xì)胞核內(nèi)。（3）免疫細(xì)胞亞型檢測：CD分子是細(xì)胞（包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等）在分化為不同譜系（linea

48、ge）、不同階段以及活化過程中或疾病狀態(tài)下出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記。（4）檢測細(xì)胞因子：細(xì)胞因子（cytokine）是一類能在細(xì)胞間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)等功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽。根據(jù)功能可以分為6大類：白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、生長因子和趨化因子。（ELISA、流式）（5）流式分選：免疫細(xì)胞亞群分選:GFP陽性穩(wěn)轉(zhuǎn)株分選；干細(xì)胞分選（造血干細(xì)胞分選、腫瘤干細(xì)胞分選、側(cè)群細(xì)胞分選）21、側(cè)群細(xì)胞（SP細(xì)胞）：廣泛分布于胚胎、成體組織以及腫瘤細(xì)胞系中，具有自我更新和多向分化潛能，因此代表了一種新的干細(xì)胞類型，SP特征可能作為干細(xì)胞功能性標(biāo)記。22、側(cè)群細(xì)胞產(chǎn)生的分子

49、機(jī)制：(1)干細(xì)胞表面高表達(dá)ABC(ATPbindcassette)運(yùn)輸?shù)鞍譈crpl/ABCG2，能將Hoechst333452泵出細(xì)胞外，所以SP細(xì)胞染色較低，而其他細(xì)胞沒有這種能力。(2)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑維拉帕米，能夠阻斷SP細(xì)胞將細(xì)胞內(nèi)的Hoechst33342泵出細(xì)胞外，可以作為SP檢測的對照組。23、簡要敘述下列圖形這是一張顯示細(xì)胞DNA含量的單參數(shù)分布直方圖，使用PI對細(xì)胞DNA染色。PI染色劑插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)之間。其熒光強(qiáng)度與DNA分子量成正比橫軸以PI熒光強(qiáng)度的相對值代表DNA含量，縱軸代表細(xì)胞數(shù)目第一峰代表2倍體細(xì)胞。，細(xì)胞數(shù)目最多，熒光染料的強(qiáng)度相對值約為230。代表

50、G0G1期細(xì)胞第二峰代表4倍體細(xì)胞。熒光染料強(qiáng)度相對值約為460。代表G2M期細(xì)胞兩峰之間為S期細(xì)胞，其熒光染料強(qiáng)度及其代表的DNA含量逐漸增加第一峰之前為亞二倍體細(xì)胞或細(xì)胞碎片第二峰之后為細(xì)胞團(tuán)塊或非特異性染色DNA含量分布直方圖可用于細(xì)胞周期DNA含量變化的分析這是一張同時(shí)顯示細(xì)胞樣本FITC及PI熒光強(qiáng)度的二維雙參數(shù)散點(diǎn)圖。橫軸為FITC熒光強(qiáng)度相對值的對數(shù)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜磷脂雙分子層中PS（磷酸酰絲氨酸）分子外翻，可被annexin-V結(jié)合。使用FITC標(biāo)記annexin-V即可定量顯示細(xì)胞膜表面PS分子量?？v軸為PI熒光強(qiáng)度的相對值，由于PI染料可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)之間，

51、其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞DNA分子量成正比。當(dāng)胞膜完整時(shí)，PI不能進(jìn)入核內(nèi)，此時(shí)細(xì)胞拒染。LL:PI及FITC雙陰性細(xì)胞。為正常細(xì)胞。LR:FITC陽性，PI陰性。即磷脂雙分子層PS外翻而胞膜完整，為凋亡早期的細(xì)胞。UR:PIFITC雙陽性。即磷脂雙分子層PS外翻而且細(xì)胞膜通透性改變，PI進(jìn)入核內(nèi)，DNA著色，為凋亡晚期細(xì)胞。UL:PI陽性，F(xiàn)ITC陰性。為壞死細(xì)胞，其胞膜崩解，僅余裸核，僅PI著色。該方法可用于研究理化因素對細(xì)胞凋亡的影響。24、定量檢測幾十萬個(gè)分散的細(xì)胞的DNA含量應(yīng)用流式細(xì)胞檢測技術(shù)（FCM）（1收集單細(xì)胞懸液（1X106個(gè)）緩慢加入1ml預(yù)冷的70%乙醇于49固定過夜或-209

52、長期固定。（2離心收集細(xì)胞，再以1mlPBS徹底洗去乙醇；（3）去上清后加入染色液（包含50ug/mlPI，100ug/mlRNaseA，0.2%TritonX-100），37C染色30min后上機(jī)檢測。（4）DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過流式檢測就能反映細(xì)胞內(nèi)DNA的含量。七、觀察和分析分子間相互作用的技術(shù)1、細(xì)胞信號(hào)通路的基本組成：（1）細(xì)胞外信號(hào)分子（2）受體蛋白（3）細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（4）效應(yīng)蛋白（5）細(xì)胞反應(yīng)。2、觀察和分析分子間相互作用的技術(shù)（1）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)：酵母雙雜交技術(shù)、GSTpull-

53、down實(shí)驗(yàn)、免疫熒光（IF）、免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）（2）蛋白質(zhì)-核酸：電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）報(bào)告基因assay3、酵母雙雜交系統(tǒng)原理：酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的，其中有DNA結(jié)合功能域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（DNA-AD）這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列的啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。在酵母雙雜交系統(tǒng)中“誘餌”蛋白X克隆至DNA-BD載體中，表達(dá)DNA-BD/X融合

54、蛋白；待測試蛋白丫克隆至AD載體中，表達(dá)AD/Y融合蛋白。一旦X與丫蛋白間有相互作用，則DNA-BD和AD也隨之被牽拉靠近，恢復(fù)行使功能，激活報(bào)告重組體中LacZ和HIS3基因的表達(dá)。4、GSTpull-down實(shí)驗(yàn)是一個(gè)行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白固化在谷胱甘肽親和樹脂上，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”當(dāng)目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白）,洗脫結(jié)合物后通過SDS電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白以及體外翻譯等方法獲得。5、免疫共沉淀技術(shù)（

55、co-IP）:以抗原和抗體的專一性作用為基礎(chǔ)，用一種特定蛋白質(zhì)的抗體與總蛋白質(zhì)樣品溶液混合，將抗原-抗體復(fù)合物沉淀下來，在此過程中與抗原相互作用的蛋白質(zhì)也共同沉淀下來。co-IP操作流程:（1）細(xì)胞裂解（2）沉淀抗體：孵育得到沉淀復(fù)合物（3）蛋白A/G-瓊脂糖珠：洗脫（4）蛋白質(zhì)SAS電泳：分離蛋白質(zhì)（5）免疫印跡（6）檢測抗體6、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）:熒光能量共振轉(zhuǎn)移是距離很近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)供體熒光分子（D）的發(fā)射光譜與受體熒光分子（A）的吸收光譜重疊，并且兩個(gè)分子的距離在10nm范圍以內(nèi)時(shí)，就會(huì)發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，使得供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多（熒光

56、猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)（敏化熒光）。檢測FRET的效率，代表分子之間的距離，指示分子間是否有相互作用。7、FRET的條件：（1）D/A距離：1-10nm（2）D的Emi光譜和A的Exi光譜必須有顯著的重迭，一般大于30%.8、常用的熒光分子對:FITC-TRITC;Cy3-Cy5;EGFP-Cy3;CFP-YFP;EGFP-YFP9、檢測FRET效率的方法：（1）敏化熒光：共振能量轉(zhuǎn)移后，受體發(fā)射能量的增強(qiáng)（2）受體光漂白：受體漂白后，由于共振能量不能轉(zhuǎn)移，供體能量的增強(qiáng)（3）供體熒光時(shí)長的縮短10、凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）:也稱GelShift，是一種研究核酸結(jié)合蛋白

57、和其相關(guān)的核酸結(jié)合序列相互作用的技術(shù)。將目的蛋白與同位素標(biāo)記的核酸分子共同孵育，結(jié)合的復(fù)合物進(jìn)行電泳時(shí)較未結(jié)合的核酸分子移動(dòng)得更慢。在實(shí)驗(yàn)組與對照組反應(yīng)物數(shù)量相同的條件下，還可以根據(jù)復(fù)合物條帶的濃淡對蛋白質(zhì)核酸結(jié)合能力進(jìn)行半定量分析。11、EMSA原理:（1）蛋白質(zhì)：細(xì)胞核蛋白粗提物（2）探針標(biāo)記DNA:32P標(biāo)記的DNA（感興趣蛋白質(zhì)特異識(shí)別的已知序列）（3）1與2孵育（體外）（4）凝膠電泳分離（5）放射自顯影結(jié)果判定:（1）游離探針和DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物條帶位置；（2）復(fù)合物條帶強(qiáng)度12、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP）:研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定

58、蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。該技術(shù)主要應(yīng)用:（1）組蛋白修飾研究（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析（3）藥物開發(fā)研究（4）有絲分裂研究（5）DNA損失與凋亡分析13、ChIP實(shí)驗(yàn)流程:（1）甲醛交聯(lián)，固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物（2）超聲或核酸酶將染色質(zhì)水解為小的片段（3）蛋白質(zhì)的抗體沉淀復(fù)合物（4）檢測復(fù)合物中DNA的序列或結(jié)合的量14、負(fù)顯性突變:對影響蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，所得突變體不僅喪失了原有功能，并且可以抑制內(nèi)源性蛋白質(zhì)

59、的功能。15、DNA微陣列（DNAmicroarray）:是一種用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高通量技術(shù)它由一系列成千上萬個(gè)精微的DNA寡核苷酸點(diǎn)排列而成。它們被作為探針，在非常嚴(yán)格的條件下和一個(gè)叫做靶分子的cDNA或cRNA樣本雜交。由于靶分子帶有熒光標(biāo)記，因此通過探針-靶分子的雜交，并根據(jù)雜交后熒光的有或無，強(qiáng)或弱，對靶分子中特定核酸序列的豐度進(jìn)行檢測。16、共激活因子：是一種蛋白，本身不能與DNA結(jié)合，但能夠通過與具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的激活因子（或轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合來增強(qiáng)基因的表達(dá)。共激活因子可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的許多其他過程，如轉(zhuǎn)錄的延長、終止、RNA剪接以及激活因子和共激活因子復(fù)合體的降解等。17共激

60、活因子（co-activator）或共抑制因子（co-repressor）往往就是通過調(diào)節(jié)組蛋白的翻譯后修飾實(shí)現(xiàn)其功能的。這些修飾會(huì)影響組蛋白的構(gòu)象，從而影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合體與DNA的結(jié)合。組蛋白可以有多種翻譯后修飾形式：磷酸化、乙?；?、泛素化、甲基化18、報(bào)告基因:是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。19、報(bào)告基因來檢測轉(zhuǎn)錄因子的活化：（1）綠色熒光蛋白（2）半乳糖苷酶（3）熒光素酶20、siRNA（s