轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹

1、轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第1頁(yè)主要內(nèi)容轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因敲除技術(shù)文件轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第2頁(yè)一、轉(zhuǎn)基因（Transgenesis）技術(shù)定義：將人工分離和修飾過基因?qū)氲缴矬w基因組中，因?yàn)閷?dǎo)入基因表示，引發(fā)生物體性狀可遺傳修飾技術(shù)微生物中基因轉(zhuǎn)移植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第3頁(yè)1、微生物中基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)接合溶原性轉(zhuǎn)換原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第4頁(yè)2、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌經(jīng)過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。

2、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：利用火藥爆炸或高壓氣體加速（這一加速設(shè)備被稱為基因槍），將包裹了帶目標(biāo)基因DNA溶液高速微彈直接送入完整植物組織和細(xì)胞中?；ǚ酃芡ǖ婪ǎ涸谑诜酆笙蜃臃孔⑸浜繕?biāo)基因DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并深入地被整合到受體細(xì)胞基因組中，伴隨受精卵發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因新個(gè)體。轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第5頁(yè)3、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)顯微注射法：在顯微鏡下，直接將DNA注射到胚胎細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常幼仔。反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法：把含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體病毒顆粒去感染卵裂期胚胎，于是攜帶外源基因逆轉(zhuǎn)錄DNA能夠在感染

3、過程中，整合到宿主細(xì)胞染色體上。體細(xì)胞核移植轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第6頁(yè)二、基因敲除技術(shù)定義：經(jīng)過一定路徑使機(jī)體特定基因失活或缺失技術(shù)。1、應(yīng)用DNA同源重組原理進(jìn)行基因敲除。2、利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除3、RNA干擾也能夠引發(fā)基因敲除轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第7頁(yè)1 利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除 應(yīng)用最為廣泛其詳細(xì)原理和應(yīng)用將在后面重點(diǎn)介紹轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第8頁(yè)2.利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除 基因捕捉法 利用一些能隨機(jī)插入基因序列病毒，細(xì)菌或其它基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變細(xì)胞庫(kù)，然后 經(jīng)過對(duì)應(yīng)標(biāo)識(shí)進(jìn)行篩選取得對(duì)應(yīng)基因敲除細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因

4、和基因敲除技術(shù)介紹第9頁(yè)3.RNA干擾引發(fā)基因敲除 RNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解現(xiàn)象。簡(jiǎn)單說是指一個(gè)分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)基因緘默現(xiàn)象。所以RNAi反應(yīng)過程也能夠用于基因敲除。轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第10頁(yè)基因敲除技術(shù)與諾貝爾獎(jiǎng) 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域諾貝爾獎(jiǎng)（年）已經(jīng)揭曉。三位在基因敲除技術(shù)方面進(jìn)行了卓越、開拓性工作并取得了顯著成就科學(xué)家分享了諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他們是美國(guó)鹽湖城猶他州大學(xué)Marie Capecchi教授、美國(guó)北卡羅來納州大學(xué)Ol

5、iver smithies教授以及英國(guó)加蒂夫大學(xué)Martin Evans教授 摘自中華醫(yī)學(xué)信息 年第22卷第21期轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第11頁(yè)文件：Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonasputida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：在P.Putida KT2442基因組中敲掉目標(biāo)基因phaC1-phaZ-phaC2,檢測(cè)不一樣phaC基因特異性利用原理：同源重組基因敲除轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)

6、介紹第12頁(yè)P(yáng)seudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chain-length poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3-hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was

7、 knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant K

8、TOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps fromAbstract轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第13頁(yè)P(yáng)seudomonas stutzeri 1317, were expressed in the mutant strains to test the P

9、haC enzyme substrate specificity. The result showed P. putida KTOY01 or KTOY02 could provide not only mcl PHA monomers but also 3-hydroxybutyrate from fatty acids, which may allow the production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA). Plasmid pCJY10 containing phaC2Ps, phbA, and phbB genes encoding PH

10、A polymerase, b-ketothiolase, and acetoacetyl-CoA reductase, respectively, were transformed into P. putida KTOY01 and KTOY02. Shake-flask culture showed P. putida KTOY01 or KTOY02 (pCJY10) could accumulate poly(3HB-co-mcl 3HA) from glucose. The above result showed pha operon knockout mutant of P. pu

11、tida KT2442 was a very useful host of great potential not only for studying PhaC synthase, but also for microbial production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA), which is very difficult to abtain.轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第14頁(yè)RECOMBINATION轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第15頁(yè)ab構(gòu)建質(zhì)粒ABA1A2a1a2A1a2ba1A2目標(biāo)基因B目標(biāo)基因第一次重組A、B為一段DNA序列，并非是基因轉(zhuǎn)基

12、因和基因敲除技術(shù)介紹第16頁(yè)A1a2ba1A2目標(biāo)基因BA1a2ba1A2目標(biāo)基因Bb1b2B1B2A1a2b1B2B1b1a1A2目標(biāo)基因第二次重組第一個(gè)情況轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第17頁(yè)A1a2ba1A2目標(biāo)基因BA1a2a1A2ABA1A2目標(biāo)基因a2a1bb目標(biāo)基因B第二次重組第二種情況轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第18頁(yè)x 目標(biāo)基因還是在基因組上目標(biāo)基因不在基因組上第二次重組第一次重組轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第19頁(yè)轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第20頁(yè)轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第21頁(yè)轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第22頁(yè)致謝轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第23頁(yè)轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第24頁(yè)轉(zhuǎn)基因和

13、基因敲除技術(shù)介紹第25頁(yè)轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第26頁(yè)轉(zhuǎn)導(dǎo)：由噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞間進(jìn)行遺傳交換一個(gè)方式 一個(gè)細(xì)胞DNA經(jīng)過病毒載體感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)不足轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)給體染色體任何個(gè)別到受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)過程在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,如所轉(zhuǎn)導(dǎo)只限于供體菌染色體上特定基因,則稱為不足或特異性轉(zhuǎn)導(dǎo).轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第27頁(yè)轉(zhuǎn)染：經(jīng)過感染方式將外來DNA引入宿主細(xì)胞，并造成宿主細(xì)胞遺傳性狀改變過程稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化一個(gè)特殊形式。 轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第28頁(yè)接合：是供體菌經(jīng)過性菌毛相互溝通，將供體菌遺傳物質(zhì)（質(zhì)粒）轉(zhuǎn)移給受體菌。轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第29頁(yè)溶原性轉(zhuǎn)換：溫和噬菌體感染細(xì)胞后使之發(fā)生溶源化，因噬菌體基因整合到宿主染色體上，而使后者取得了新性狀現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第30頁(yè)原生質(zhì)體融合：將兩個(gè)不一樣細(xì)菌在溶菌酶或青霉素作用下，失去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后進(jìn)行融合過程 在聚乙二醇存在下，使兩個(gè)細(xì)胞原生質(zhì)融合，融合后細(xì)胞形成二倍體細(xì)胞，含有兩套染色體，表現(xiàn)二者特征。常見作生物工程研究 轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)介紹第31頁(yè)補(bǔ)充資料“基因敲除小鼠”：他們利用“基因敲除”方法創(chuàng)造了一套完整“基因敲除小鼠”方式，把任意改變小鼠基因變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，不但能夠研究單個(gè)基因在動(dòng)物體內(nèi)功效，而