哺乳動(dòng)物硒蛋白的研究進(jìn)展

1、哺乳動(dòng)物硒蛋白的研究進(jìn)展摘要硒是哺乳動(dòng)物和人必需的微量元素。硒的生物學(xué)功能主要是以硒蛋白的形式表現(xiàn)的。到目前為止，已經(jīng)克隆并測定DNA順序的哺乳動(dòng)物硒蛋白有9種，它們是細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化酶、磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶、胃腸谷甘肽過氧化物酶。型碘化甲狀腺原氨酸5脫碘酶、硒蛋白P和硒蛋白。這些硒蛋白中硒參入到蛋白分子是通過硒半胱氨酸-tRNA識(shí)別RNA中特異的UGA密碼子將硒半胱氨酸插入硒蛋白中。關(guān)鍵詞硒；硒蛋白；生物功能；表達(dá)調(diào)控AbstratSeleniuisaessentialtraeeleentfranialsandhuans.Seleniuexertsitsbilgialfuntinla

2、rgelythrughselenprtEins.UptnnineselenprteinsDNAshavebeenlnedandsequened,hihareellularglutathineperxidase(GPX),extraellularglutathineperxidase(eGPX),phsphlipidhydrperxidaseglutathineperxidase(PHGPX),gastrintestinalglutathineperxidase(GPX-GI),typeIidthyrnine5-deindenase(ID)type2idthyrnine5deininase(ID

3、),typeidthyrnine5-deidinase(ID),selenprteinp(SeP)andselenprtein.InalltheseselenprteinsSeisinrpratedinttheprteinleuleviatheselenysteinyl-tRNAhihregnizesthespeifiUGAdnsinRNAtinsertselenysteineintthepriarystruturefselenprteins.KeyrdsSeleniu;Selenprtein;Bilgialfuntin;expressinandregulatin硒Se是1817年瑞典學(xué)者Be

4、rzelius發(fā)現(xiàn)的性質(zhì)似硫的元素。直到1957年Sharz和Fltz才證實(shí)Se是動(dòng)物必需的微量元素。硒與人類和其它和動(dòng)物的生長、發(fā)育和疾病的發(fā)生有著親密聯(lián)絡(luò)。硒已成為當(dāng)代國際上研究微量元素與安康問題上非常突出的興奮點(diǎn)。我國在硒與克山病關(guān)系的研究上獲得了舉世矚目的成果。當(dāng)前硒蛋白作為硒表現(xiàn)其生物學(xué)作用的主要形式已成為學(xué)者們研究的熱門課題，且近幾年進(jìn)展迅速。目前，有9種哺乳動(dòng)物硒蛋白DNA已克隆和測序，有證據(jù)說明還有更多的硒蛋白存在1。本文將簡要回憶9種硒蛋白的研究歷史，說明它們的特點(diǎn)及分布、生物學(xué)功能和表達(dá)調(diào)控方面的進(jìn)展。一、硒蛋白研究的歷史回憶硒蛋白的研究只有二十多年的歷史，其中近10年來獲

5、得了宏大成果。1973年Hedstra實(shí)驗(yàn)室的Rtruk首次證明細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶是一種含硒酶，硒是該酶的活性組份。因此，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶GPX是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最早的硒蛋白。自此，對(duì)硒代謝作用的理解有了打破，大量工作致力于對(duì)GPX功能的研究。在很多年內(nèi)它是的唯一的硒生化物化學(xué)功能的代表，因此用來作為評(píng)價(jià)硒的營養(yǎng)狀況的指標(biāo)。細(xì)胞外谷胱甘肽過氧化物酶Egpx在70年代被認(rèn)為與紅細(xì)胞內(nèi)GPX是同一種蛋白質(zhì)。1985年hen等發(fā)現(xiàn)二者不是一種蛋白質(zhì)。1987年Takahashi2等從人血漿中別離純化了這種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它在免疫、化學(xué)、電泳和某些功能上均不同于GPX，因存在于血漿中將其

6、命名為外谷胱甘肽過氧化物酶gpx。磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶PHGPX是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第二種含硒酶。1982年Ursini等從豬肝臟和心臟中部分別離并描繪了一種新的抑制過氧化的蛋白質(zhì)。1985年別離純化并確定為含硒的谷胱甘肽過氧化物酶，因它能特異性地使磷脂氫過氧化物復(fù)原，故名磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶3。胃腸谷胱甘肽過氧化物酶GPX-GI的DNA是hu等于1988年從人的肝細(xì)胞系克隆到的，并于1993年別離到蛋白質(zhì)，與GPX有同源性，是含硒的GPX家族中的第四個(gè)同工酶。因它的RNA只存在于鼠的胃腸道的細(xì)胞中，故名GPX-GI4。最早把硒和I型碘化甲狀腺5脫碘酶IDI聯(lián)絡(luò)在一起的是Arthur實(shí)

7、驗(yàn)室，他們于1987年報(bào)道了缺硒大鼠IDI活性降低。1990年Arhtur和Behne應(yīng)用雙標(biāo)記技術(shù)分別證明了IDI是含硒蛋白。1991年Berry克隆到IDI的DNA進(jìn)一步證實(shí)了IDI是含硒酶5。1995和1996年Galtn等克隆了型和型脫碘酶的DNA，發(fā)現(xiàn)了它們的讀碼框架含有TGA密碼子，從而證實(shí)它們也是含硒半胱氨酸的含硒酶6-8。硒蛋白P是Burk等發(fā)現(xiàn)的和Tappel命名的。1987年Burk實(shí)驗(yàn)第一次用單克隆抗體別離純化了大鼠血漿的硒蛋白P。1991年又克隆并測定了硒蛋白P的DNA。1993年才從人的血漿中別離純化了人的硒蛋白P9。1969年hanger實(shí)驗(yàn)室的Pedersen等在

8、羊的心臟和肌肉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)一種低分子量約10Kd的含硒蛋白質(zhì)。1984年hanger將它命名為硒蛋白G并確定硒以硒半胱氨酸Seys的形式存在。因與一組無關(guān)的G蛋白同名，故于1992年將它更名為硒蛋白。1993年從大鼠肌肉中別離純化了硒蛋白。1995年克隆到硒蛋白的DNA，清楚了所有的氨基酸順序10。在1973-1983年有一系列研究論文指出精子線粒體外膜的形成需要硒。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)硒存在于線粒體外的一個(gè)富含半胱氨酸和脯氨酸的構(gòu)造蛋白中。1979年alvin和per將它命名為線粒體外膜蛋白，而1990年Kleene認(rèn)為命名為線粒體外膜硒蛋白S似乎更恰當(dāng)11。但是1996年作者本人否認(rèn)了它是硒蛋白。二

9、、特點(diǎn)及分布一特點(diǎn)9種硒蛋白中的硒都以Seys形式在于蛋白質(zhì)多肽中，含硒酶中的硒都位于酶的活性中心。其中GPX、eGPX和GPX-GI都由4個(gè)一樣的亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基含一個(gè)硒原子，三者與PHGPX和IDI的動(dòng)力學(xué)反響都符合乒乓機(jī)制。從各種生物別離得到的GPX分子量為76-92kD。人的eGPX分子量約93kD。比GPX分子略大些。它的特異活性只有GPX的10%。與GPX不同，它是一種糖蛋白。PHGPX是一個(gè)單體，含一個(gè)原子的硒，分子量約為20kD左右。它的活性被碘乙酸抑制。這種酶有界面性質(zhì)，即作用于膜和水相之間的界面，是一種膜結(jié)合酶，它對(duì)卵磷脂過氧化物的活性比對(duì)氫過氧化物活性高3.5倍12。G

10、PX-GI每個(gè)亞基的分子量為22kD，與GPX和eGPX無穿插免疫原性。IDI是膜結(jié)合酶。具有很強(qiáng)的疏水性，分子量約27-29kD，每分子含一個(gè)硒原子，它結(jié)底物的親和性為rT3T4T3，對(duì)丙基硫氧嘧啶高度敏感5，13。ID和ID的動(dòng)力學(xué)機(jī)制都符合順序機(jī)制，丙基硫氧嘧啶對(duì)它們無影響，對(duì)底物的親的性ID是T4rT3，ID是T3T4。硒蛋白P是糖蛋白，分子量約為57kD，由一條多肽鏈構(gòu)成，是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)一條多肽鏈中含有多個(gè)Seys的硒蛋白。理論上含有10個(gè)Seys實(shí)測7.5個(gè)，二者差異原因不清。硒蛋白P有富硒區(qū)，還富含半胱氨酸17個(gè)和組氨酸23個(gè)，能與肝素結(jié)合。硒蛋白分子量約10kD，每分子蛋白含一

11、個(gè)硒原子。不同生物中硒蛋白的氨基酸順序高度同源10。二分布各種硒蛋白的分布都有種屬和組織特異性。GPX幾乎存在于機(jī)體各個(gè)組織的所有細(xì)胞中，但分布不均一，大鼠肝中GPX活性比腦中高13倍，羊紅細(xì)胞GPX活性高而肝細(xì)胞中活性低。GPX分布于細(xì)胞器內(nèi)由多到少的順序?yàn)榘?、線粒體、細(xì)胞核、微粒體12。EPX并不特異性地定位于血漿，還存在于人乳、膽汁、唾液、腦脊液及腎和肺的細(xì)胞外液15。PHGPX分布于哺乳動(dòng)物的各種組織，但在大鼠睪丸內(nèi)活性是肝臟內(nèi)的2倍；在細(xì)胞內(nèi)以胞核和線粒體內(nèi)程度最高12。GPX-GI位于人胃腸、肝和嚙齒類胃腸道的細(xì)胞內(nèi)4。IDI主要存在于肝臟、腎臟和甲狀腺中，后來發(fā)如今垂體和肌肉中

12、有IDI的RNA位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上13，16。ID主要存在于大腦、垂體和褐色脂肪組織，最近在人胚的心臟、骨骼肌和胎盤中有它的表達(dá)6、7。ID主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼和胎盤中8。硒蛋白P存在于血漿中，也存在于肝、腎、心、肺、腦等多種組織的細(xì)胞外。近年來報(bào)道，與生物膜有聯(lián)絡(luò)13。硒蛋白主要位于肌肉細(xì)胞的胞液內(nèi)，其他組織中也有，尚有很少與膜有聯(lián)絡(luò)。在羊的心臟細(xì)胞液內(nèi)硒蛋白和GPX含硒量一樣，在羊中，硒蛋白在骨骼肌和心臟中含量最高，肝臟中含量最低，而大鼠心臟中缺乏硒蛋白10，17。三、生物功能GPX是硒蛋白中研究最早功能最清楚的一種。GPX是體內(nèi)重要的抗氧化酶之一。它以復(fù)原型谷胱甘肽GSH作

13、為特異底物，催化復(fù)原很多化學(xué)上不同種類的氫過氧化物，包括過氧化氫H22、特丁基氫過氧化物、異丙基氫過氧化物和脂質(zhì)氫過氧化物，從而能去除組織中有害的過氧化物，保護(hù)生物膜和生物大分子構(gòu)造免受氧化損傷，GPX的抗氧化功能是硒的很多生物學(xué)作用如抗癌抗衰老等的生化基矗Sunde1994提出GPX可看作為硒的生物緩沖劑，因?yàn)樗{(diào)節(jié)硒參入到GPX和其它硒蛋白之間的量12。eGPX的功能不完全清楚。推測它利用GSH作為復(fù)原劑，可能作為氧自由基產(chǎn)生的有機(jī)氫過氧化物和過氧化物的抗氧化酶15。PHGPX還能復(fù)原很多種類的過氧化物，但它對(duì)過氧化氫的活性較低，對(duì)磷脂氫過氧化物的活性較高。它能保護(hù)細(xì)胞免受氧化型低密度脂蛋

14、白的損傷，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有預(yù)防作用12。作為抗氧化酶它在某些組織中是非常關(guān)鍵的，尤其是心臟和睪丸。人類克山病的病因有可能與PHGPX在心臟內(nèi)的功能有關(guān)。此外。它還調(diào)節(jié)白細(xì)胞5-脂肪氧合酶的活性與白三烯代射有關(guān)12。GPX-GI和GPX有相似底物特異性，不能催化磷脂過氧化物復(fù)原。在大鼠中以H22為底物，分析GPX-GI活性發(fā)現(xiàn)它在胃中活性最高，依次是食管、大腸、小腸。在胃腸道細(xì)胞內(nèi)檢測不到GPX的RNA，這提示在哺乳動(dòng)物中保護(hù)消化道的脂質(zhì)過氧化毒性損傷中GPX-GI起主要作用4。ID的生理作用是在外周組織中如肝和腎中發(fā)揮脫碘作用。把甲狀腺素產(chǎn)生的T4轉(zhuǎn)化為有生物活性的T3從而在很多生物過程中發(fā)揮

15、重要作用13。ID的作用是垂體、大腦和褐色脂肪組織部分T4脫碘，調(diào)節(jié)部分組織細(xì)胞中的T3程度。ID只能使T4苯環(huán)上5位的碘脫去，使T4轉(zhuǎn)化為rT3。三種脫碘酶的主要作用是維持機(jī)體甲狀腺激素代謝的動(dòng)態(tài)平衡：一是將低活性形式T4轉(zhuǎn)化為活性高的形式T3；二是使甲狀腺激素降解為活性低或無活性的形式5-8，13。硒蛋白P真正的生物學(xué)功能還不清楚。一般認(rèn)為硒蛋白P有運(yùn)輸硒的功能。硒蛋白P含有很多巰基和硒，提示它有很強(qiáng)的復(fù)原才能，這與它在血漿中抗自由基或其它反響的活性分子的保護(hù)劑一致。Burk等認(rèn)為硒蛋白P可能參與血紅素代射，保護(hù)diquat誘導(dǎo)的肝壞死和脂質(zhì)過氧化，提示它可能是自由基的去除劑14。硒蛋白的

16、功能不清。根據(jù)硒以Seys形式存在，推測可能作為抗氧化劑。它在肌肉中比在其它組織中含量高，提示它在肌肉代謝中可能起重要作用10。四、表達(dá)和調(diào)控基因表達(dá)包括DNA轉(zhuǎn)錄成RNA和RNA翻譯成蛋白質(zhì)。真核生物基因的表達(dá)受多級(jí)調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。本文主要闡述硒參入到硒蛋白中的機(jī)制和硒對(duì)硒蛋白合成的調(diào)節(jié)作用。在硒的生物化學(xué)領(lǐng)域中一個(gè)驚人的新進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)硒蛋白R(shí)NA中的終止密碼子UGA指導(dǎo)硒半胱氨酸Seys共價(jià)插入。應(yīng)用這一特殊密碼子特異插入Seys，提示Seys在核糖體蛋白質(zhì)合成方面可以看成是第21種氨基酸，UGA被定為Seys的遺傳密碼。這個(gè)發(fā)現(xiàn)明確了硒直接參與硒蛋白的翻譯過程而不是翻譯后參入。真核生物Se

17、ys的合成和插入是受轉(zhuǎn)運(yùn)Seys的TrnaSeys-tRNAse調(diào)節(jié)的與翻譯同時(shí)進(jìn)展的過程。Seys的碳鏈骨架來自于絲氨酸，有兩種具有獨(dú)特的二級(jí)和三級(jí)構(gòu)造的抑制性tRNAtRNAse連接絲氨酸和UGA密碼子。硒蛋白的合成是一個(gè)復(fù)雜的過程。原核生物中硒蛋白的合成過程已清楚。在原核生物中，Seys的合成和參入需要有RNA開放閱讀框架中的一個(gè)UGA密碼、UGA下游緊接的具有特異順序的莖環(huán)構(gòu)造、4種獨(dú)特的基因SELA、SELB、SEL、SELD產(chǎn)物和攜帶有UGA反密碼子的tRNAse。SELD基因產(chǎn)物是磷酸硒激酶它能催化ATP和硒化物生成磷酸硒。SEL基因的產(chǎn)物的絲氨酰-tRNA合成酶，催化作為Sey

18、s骨架來源的絲氨酸酯化成獨(dú)特的tRNAse。SELA基因產(chǎn)物是硒半胱氨酸合成酶，催化L-絲氨酸的痙基脫去而換上Se生成Seys。SELB基因產(chǎn)物類似于延長因子EF-Tu。它與GTP結(jié)合形成RNA-SELB-GTP-Seys-RNAse復(fù)合物，使Seys插入到肽鏈中UGA所在的特殊位置而形成硒蛋白12，14。真核生物硒蛋白的合成與原核生物中硒蛋白的合成有類似之處，但要復(fù)雜得多且某些細(xì)節(jié)還不清楚。真核生物所有硒蛋白的基因都包括5端非翻譯區(qū)5-UTR、含TGA讀碼框架的外顯因子、內(nèi)含子和3端非翻譯區(qū)3-UTR。Seys-tRNAse識(shí)別正確的UGA而不是作為終止密碼的UGA需要rna3-UTR的特殊

19、構(gòu)造順序，即Seys插入順序SEIS。它包括穩(wěn)定的環(huán)構(gòu)造和莖環(huán)上特定的核苷酸順序。Berry13等發(fā)現(xiàn)IDRNA的3-UTR的200個(gè)堿基中有Seys插入必需的莖環(huán)節(jié)構(gòu)造，GPXRNA的3-UTR也有類似的莖環(huán)構(gòu)造，硒蛋白PRNA的3-UTR有2個(gè)莖環(huán)構(gòu)造，它們都有共同的保守順序，即環(huán)上的AAA、莖5端非配對(duì)的UGAU和3端非配對(duì)的GAU。環(huán)上AAA是SEIS中發(fā)揮最正確功能所必需的，莖上非配對(duì)的保守核酸是SEIS發(fā)揮最正確功能關(guān)鍵。到目前為止，已測序的所有哺乳動(dòng)物硒蛋白R(shí)NA的3-UTR預(yù)測都包含穩(wěn)定莖環(huán)節(jié)構(gòu)造，它可能抑制釋放因子在UGA密碼子和核糖體作用而抑制翻譯完畢。另外，SEIS中莖環(huán)

20、構(gòu)造的二級(jí)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)Seys插入也是重要的，但密碼子UGA周圍順序和莖環(huán)位置與Seys插入關(guān)系不大。核糖體結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示通常的延長因子不能識(shí)別Seys-tRNAse和UGA作用，需要有特殊的延長因子，但這種延長因子在真核細(xì)胞中還未別離到。哺乳動(dòng)物基因有個(gè)調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)硒蛋白的表達(dá)。潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位于5-UTR、3-UTR和/或內(nèi)含子。在RNA一樣的位置的同一密碼既可編碼Seys又可作為終止密碼，這受3UTR的SEIS及其多聚腺苷酸的調(diào)節(jié)。且多聚腺苷酸還調(diào)節(jié)RNA的穩(wěn)定性。硒蛋白基因的表達(dá)受硒營養(yǎng)狀況的影響。研究說明硒不影響基因轉(zhuǎn)錄，即RNA的生成量，便它影響RNA的穩(wěn)定性，PHGPXRNA例外，它受硒

21、的影響較少18。硒缺乏時(shí)硒蛋白R(shí)NA穩(wěn)定性降低，RNA程度降低，硒過多時(shí)RNA程度不升高。翻譯程度的調(diào)節(jié)為硒影響Sey-tRNAse的合成和tRNAse反密碼子的甲基化。膳食硒充足的大鼠比缺硒者總SeystRNAse量高，tRNAse反密碼子搖擺位置甲基化增加使tRNASse處于更開放更穩(wěn)定時(shí)構(gòu)型。硒缺乏時(shí)，所有硒蛋白合成都降低，但各種蛋白對(duì)缺硒的敏感性和降低的程度不同，其中GPX最敏感，降低幅度最大，這主要取決于各種硒蛋白R(shí)NA的穩(wěn)定性不同，硒調(diào)節(jié)RNA穩(wěn)定性的機(jī)制還不清楚19。硒蛋白合成還受其它因素的影響，如動(dòng)物種屬和組織差異的影響。GPX基因表達(dá)還受鐵的影響，缺鐵導(dǎo)致GPXrnat蛋白質(zhì)

22、的量及酶活性都降低20，GPX受硒的調(diào)節(jié)在甲狀腺與肝和腎中不同，在甲狀腺中，碘對(duì)它的影響比硒大16。ID除受硒影響外，還受甲狀腺機(jī)能狀態(tài)的影響，甲狀腺功能亢進(jìn)時(shí)IDRNA及酶活性都升高，甲狀腺功能減退時(shí)都降低。近年來，哺乳動(dòng)物硒蛋白的研究突飛猛進(jìn)，但仍有很多未解決的問題，尤其是硒蛋白基因表達(dá)非常復(fù)雜，且受多種因素影響，許多問題有待于進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1BehneD,Eiss-Nak,Kalhlsh,etal.Studiesnthedistrbutinandharateristisfneaalianprteins.Analyst,1995,120:823-825.2TakahashiK,Avi

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