烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠肺微血管通透性及肺組織PEDF表達(dá)的影響

1、烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠肺微血管通透性及肺組織PEDF表達(dá)的影響蔡施霞，鄧烈華，佟琳，孫小聰【摘要】目的觀察烏司他丁注射液對(duì)膿毒癥大鼠肺微血管通透性及肺組織色素上皮衍生因子(PEDF)表達(dá)的影響，探討烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠肺保護(hù)的作用機(jī)制。方法30只健康的雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(A組)、陽(yáng)性對(duì)照組(B組)、烏司他丁治療組(組)，每組10例。除假手術(shù)組外，其他組均施行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(LP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型，治療組同時(shí)給予烏司他丁腹腔注射(100ku/kg)，術(shù)后4h隨機(jī)處死大鼠5只取組織標(biāo)本，剩余5只大鼠經(jīng)頸外靜脈注射伊文思藍(lán)觀察肺微血管通透性。分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PR)法

2、和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)肺組織中PEDF的表達(dá)。結(jié)果B組肺微血管通透性明顯高于A、組，組肺微血管通透性高于A組;B組肺組織PEDF表達(dá)水平明顯低于A、組，組肺組織PEDF表達(dá)水平低于A組(P0.05)。結(jié)論烏司他丁能明顯抑制膿毒癥大鼠肺微血管通透性增高，這種肺保護(hù)作用的機(jī)制可能與增加PEDF表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】烏司他丁注射液;膿毒癥;肺微血管通透性;PEDF【Abstrat】bjetiveTbservethepereabilityfpulnaryirvasularandexpressinfPigentepitheliu-derivedfatrinseptiratstreatedith

3、Ulinastatininjetin,andtinvestigatetheatinehanisfUlinastatinininpulnaryfuntinprtet.ethdsAttalf30healthyaleSDratsererandlydividedintthreegrups,andeahgruphas10rats,GrupAreEivedshaperatinandthethersunderentealligatinandpunture(LP)peratin.Alltheratsereaeptedintraperitnealinjetinfnralsaline(grupA,B)rUlina

4、statin(100ku/kg).Afterfurhurs,LungtissueexpressfPEDFinallratseredetetedbyreversetransriptin-plyerasehainreatin(RT-PR)andEnzye-linkediunsrbentassay(ELISA)ethdsrespetivelyandthepereabilityfpulnaryvasularerebservedbyinjetingEvansBlueintjugularveinfrats.ResultsThepereabilityfpulnaryirvasularingrupBeresi

5、gnifiantlyhigherthangrupAand,hihingruperehigherthangrupA.TheexpressinlevelsfPEDFingrupBeresignifiantlylerthangrupAand,hihingruperelerthangrupA.nlusinsUlinastatinisareliableprtetinagentfrseptiindueautelunginjury,anditsehanisfatinaybeinvlvedintheinreasefPEDFexpressin.【Keyrds】Ulinastatininjetin;Sepsis;

6、Pulnaryirvasular;PEDF膿毒癥(sepsis)是合并感染的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systeiinflaatinrespnsesyndre,SIRS)，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(DS),其中呼吸功能障礙發(fā)生率較高,出現(xiàn)時(shí)間早,其主要的病理生理改變?yōu)榉蚊?xì)血管通透性增加。而色素上皮衍生因子(PEDF)可使血管通透性降低，雖然臨床研究證實(shí)烏司他丁有明確的肺保護(hù)作用，但其作用機(jī)制仍有待研究，本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(LP)復(fù)制大鼠膿毒癥模型觀察烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠肺微血管通透性和PEDF影響，探討烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠肺微血管通透性影響及其作用機(jī)制。1材料與方法1.1動(dòng)物實(shí)

7、驗(yàn)分組SPF級(jí)SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量250300g(由廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供),按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組:假手術(shù)組(A組)，無(wú)菌狀態(tài)下開腹尋找到盲腸后再將其還納腹腔,然后逐層關(guān)腹,術(shù)后立即腹腔注射生理鹽水(NS)2l;LP組(B組)，LP后立即腹腔注射NS2l;烏司他丁(UTI)治療組(組),LP后立即腹腔注射UTI20ku/kg,加NS至2l。術(shù)后4h隨機(jī)選取5只頸外靜脈注射伊文思藍(lán)液，剩余5只大鼠活殺取肺組織標(biāo)本。為避免伊文思藍(lán)影響肺組織PEDF表達(dá)測(cè)定，隨機(jī)各取5只大鼠實(shí)驗(yàn)。1.2LP模型制備方法2動(dòng)物在乙醚吸入麻醉下無(wú)菌開腹手術(shù),在距盲腸末端1處用7號(hào)絲線結(jié)扎盲腸,用22G針頭在被結(jié)

8、扎盲腸上對(duì)穿3次,注意避免糞便污染,并用生理鹽水2l濕潤(rùn)腸管,按生理位置還納腸管。術(shù)畢逐層關(guān)腹,并于腹壁皮下注射林格氏液50l/kg抗休克處理。術(shù)后自由進(jìn)食水。1.3觀察指標(biāo)及標(biāo)本處理觀察大鼠術(shù)后活動(dòng)、進(jìn)食、豎毛、腹瀉、眼球凹陷、呼吸以及活殺后腹腔腸管擴(kuò)張、充血、腹水、病灶包裹、肝腫大、肺表面充血等情況。活殺取標(biāo)本時(shí)大鼠在乙醚吸入麻醉下,開腹留取右葉肺緣組織100g,用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后立即置液氮凍存,置-80冰箱待逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PR)檢測(cè)肺組織PEDFRNA表達(dá)。取右下肺組織200g,快速PBS漂洗兩次后,置碾缽中用液氮制備肺組織勻漿,采用酶聯(lián)免疫吸附ELISA法檢測(cè)

9、肺組織PEDF蛋白表達(dá)。1.4檢測(cè)肺組織PEDFRNA表達(dá)采用RT-PR技術(shù)檢測(cè)。取肺組織100g置碾缽中用液氮制備肺組織勻漿,采用Trizl(Siga公司)一步法提取肺組織總RNA。采用兩步法RT-PR試劑盒(Invitrgen公司)進(jìn)行RT-PR,以GAPDH作為內(nèi)參照,以10l擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)115%瓊脂糖凝膠電泳后,用Labrk410UVP成像系統(tǒng)照相并分析結(jié)果。以目的基因與內(nèi)參照在凝膠上的灰度值比值為基因表達(dá)的相對(duì)含量。大鼠PEDF序列(擴(kuò)增片段為374bp):上游5-ATGATGTAGATA-3,下游5-GGGGATAAAAAGGATG-3,PR反應(yīng)條件:942in預(yù)變性,946

10、0s變性,5630s退火,7250s延伸,共計(jì)30個(gè)循環(huán),727in延伸。RT-PR操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。1.5檢測(cè)肺組織PEDF蛋白表達(dá)采用ELISA法檢測(cè)。嚴(yán)格按照大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒(武漢中美科技有限公司)說明書操作，酶標(biāo)儀(BI-RAD680)波長(zhǎng)450n下讀取吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出PEDF濃度。1.6肺微血管通透性的測(cè)定(1)伊文思藍(lán)含量測(cè)定法。按20g/kg經(jīng)左側(cè)頸外靜脈注射2%伊文思藍(lán)液(北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司)，30in后將動(dòng)物麻醉開胸取部分左肺，剪去周圍組織，吸干表面水分及血液，稱量濕質(zhì)量，將肺組織剪成約103小塊浸泡于甲酰胺溶液中(0.2g/kg)，置

11、60恒溫水浴中抽提24h，待組織中色素全部浸出，取出組織，離心，取上清液，在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的條件下，用紫外分光光度計(jì)(島津2000)在620n波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定光密度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出EB含量，以每克肺組織干重含EB質(zhì)量表示。(2)濕/干質(zhì)量比測(cè)定:稱肺組織濕質(zhì)量后，置烤箱80，72h，稱干質(zhì)量，計(jì)算濕/干質(zhì)量比值。1.7數(shù)據(jù)處理采用SASv8.1統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所得資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用SNK-q檢驗(yàn),P0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1大鼠一般情況觀察B組大鼠術(shù)后2h活動(dòng)度即明顯下降,并逐漸表現(xiàn)出厭食、豎毛、眼球下陷、呼吸急促、對(duì)外界刺激反應(yīng)淡漠等。腹腔腸系膜充血、腸管顯著擴(kuò)張、被

12、結(jié)扎盲腸壞死、血性腹水、病灶處大網(wǎng)膜包裹不佳、肝腫大、肺充血明顯。組亦有厭食、豎毛、活動(dòng)度減少等情況,但明顯較B組輕微,且組腸管僅輕度擴(kuò)張,腹水減少,壞死盲腸被大網(wǎng)膜及周圍腸管包裹明顯。A組沒有相關(guān)表現(xiàn)。2.2大鼠肺組織PEDFRNA表達(dá)B組明顯低于A、組，組低于A組(P0.05)，見表1。2.3大鼠肺組織PEDF蛋白表達(dá)B組明顯低于A、組，組低于A組(P0.05)，見表1。2.4肺組織EB含量B組明顯高于A、組，組高于A組(P0.05)，見表1。2.5肺組織濕/干質(zhì)量比B組明顯高于A、組，組高于A組(P0.05)，見表1。表1各組大鼠實(shí)驗(yàn)測(cè)定值注：*P0.05paredithgrupA，#P

13、0.05paredithgrupB3討論膿毒癥主要表現(xiàn)為系統(tǒng)炎癥和器官功能損害，而微血管通透性增高是器官功能受損的重要特征之一。血管通透性增高，一方面使大量液體滲入組織間隙，增加毛細(xì)血管與細(xì)胞間的距離，加重組織細(xì)胞的缺氧;另一方面還使炎癥細(xì)胞過多聚集于局部組織，通過釋放蛋白酶及氧自由基等，直接造成組織細(xì)胞的損傷1。國(guó)外學(xué)者的研究顯示,組織的缺血缺氧可使組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)增強(qiáng)2。VEGF是一種特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，是目前已知的最強(qiáng)烈的血管滲透劑，低氧和VEGF能調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(atrixetallprtEinases,Ps)的活性,PEDF是Ps-2和Ps-9

14、的作用底物,這樣,低氧和VEGF通過Ps的蛋白溶解作用使PEDF水平下調(diào),VEGF/PEDF升高,病理變化隨之發(fā)生3。PEDF能夠阻止缺氧導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物VEGF-及其受體VEGF-R3的減少，VEGF-、VEGF-R3轉(zhuǎn)錄水平的穩(wěn)定阻止低氧環(huán)境中血管的滲漏4，5。烏司他丁注射液是從人尿中提取的一種具有廣譜蛋白酶抑制作用的糖蛋白，研究證實(shí)它可以有效抑制膿毒癥向多器官功能障礙綜合征(DS)轉(zhuǎn)化，可有效降低膿毒癥患者的死亡率6，國(guó)內(nèi)外目前并未見有關(guān)烏司他丁對(duì)膿毒癥血管通透性影響的報(bào)道。本研究通過向膿毒癥大鼠頸外靜脈內(nèi)注射伊文思藍(lán)測(cè)定肺組織對(duì)這種染料的通透性，證實(shí)烏司他丁可以阻止大鼠微血管通透性增高的

15、推測(cè)，進(jìn)一步了解烏司他丁治療膿毒癥的作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)外源性給予烏司他丁后，大鼠微血管通透性明顯降低，同時(shí)亦檢測(cè)到大鼠肺組織PEDF的表達(dá)較LP組明顯升高。我們推測(cè)烏司他丁可能通過增加大鼠肺組織PEDF的表達(dá)降低大鼠微血管通透性，從而起到肺保護(hù)作用。這與國(guó)外相關(guān)研究7,8表明在膿毒癥患者血清中色素上皮衍生因子(PEDF)顯著降低，PEDF可使血管通透性降低是一致的。當(dāng)然對(duì)于膿毒癥發(fā)生及發(fā)展過程肺組織表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化以及烏司他丁作用的時(shí)間依賴性，還有待于我們進(jìn)一步深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1PedraA,Razandi,LevinER.Deipheringvasularendthelialellgr

16、thfatr/vasularpereabilityfatrsignalingtvasularpereability.Inhibitinbyatrialnatriuretipeptide.JBilhe,2002,277(46):44385-44398.2BekerP,AlasabasA,YuAY,etal.xygen-independentupregulatinfvasularendthelialgrthfatrandvasularbarrierdysfuntinduringventilatedpulnaryisheiainislatedferretlungs.AJRespirelllBil,2

17、000,22(3):272-279.3NtariL,illerA,artinezA,etal.Pigentepitheliuderivedfatrisasubstratefratrixetallprteinasetype2andtype9:ipliatinsfrdnregulatininhypxia.InvestphthallVislSi,2005,46:2736-2747.4YaagishiS,atsuiT,NakauraK,etal.Pigent-epitheliu-derivedfatr(PEDF)inhibitsangitensin-II-induedvasularendthelialgrthfatr(VEGF)expressininLT-3Tellsthrughanti-xidativeprperties.irvasRes,2006,71(3):222-226.5RenJG,Jie,Talbt.HPEDFpreventsangigenesis:ahypthesizedpathay.edHyptheses,2005,64(1):74-78.6尹勇,高乃榮,李兆麗.烏司他丁對(duì)急性壞