植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的綜述

1、PAGE 廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第- PAGE - 12 - -頁(yè)P(yáng)AGE 植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的綜述李西雁（廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)技術(shù)工程系2002級(jí)應(yīng)用生物技術(shù)專業(yè)）摘要：脫除病毒是植物組織培養(yǎng)深入探討研究中的一個(gè)技術(shù)難題。本文結(jié)合在桂林萊茵生物科技股份有限公司的實(shí)踐情況，簡(jiǎn)要介紹植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法，綜述植物脫除病毒的熱處理、莖尖培養(yǎng)和抗病毒藥劑三種方法的原理、發(fā)展史和技術(shù)方法，并介紹了幾種常用的病毒檢測(cè)方法。本文以馬鈴薯為例，重點(diǎn)介紹了利用熱處理加莖尖組織培養(yǎng)法獲得馬鈴薯脫毒苗的具體技術(shù)方法，脫毒率可達(dá)100%。同時(shí)還對(duì)植物組織培養(yǎng)脫毒快繁技術(shù)的應(yīng)用前景作了分析。

2、關(guān)鍵詞：莖尖培培養(yǎng)，組組織培養(yǎng)養(yǎng)，快繁繁脫毒技技術(shù)，病病毒檢測(cè)測(cè)，應(yīng)用用前景1植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)研究概概況1.1研研究簡(jiǎn)史史自從19943年年懷特（Whiite）提出植植物細(xì)胞胞“全能性性”（Tottipootenncy）學(xué)說(shuō)及及諸多后后學(xué)者（Steewarrd，19558，Guhha和Marrtesshwaari，19664）相相繼證實(shí)實(shí)后，引引發(fā)植物物組織和和細(xì)胞培培養(yǎng)快繁繁技術(shù)的的勃然興興起。我我國(guó)的專專家學(xué)者者在200世紀(jì)700年代后后也在此此領(lǐng)域做做了大量量的研究究和開發(fā)發(fā)工作，創(chuàng)造了了很多新新方法、新技術(shù)術(shù)，提出出不少新新成果，開拓了了植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)快繁技技術(shù)的新新局面1。目前采采

3、用組織織培養(yǎng)脫脫病毒快繁繁及離體體快繁生生產(chǎn)株苗苗的技術(shù)術(shù)已發(fā)展展相當(dāng)成成熟22。脫毒株株苗具有有無(wú)雜菌菌、適應(yīng)應(yīng)能力較較強(qiáng)、繁繁育較快快、質(zhì)量?jī)?yōu)、抗性性好、分分蘗性強(qiáng)強(qiáng)、繁殖殖系數(shù)高、大批量生生產(chǎn)、周周年供應(yīng)應(yīng)、便于于運(yùn)輸?shù)鹊葍?yōu)點(diǎn)，已得到到有關(guān)專專家的鑒鑒定及高高度評(píng)價(jià)價(jià)和種植植試驗(yàn)區(qū)區(qū)、種植植產(chǎn)區(qū)果果農(nóng)的認(rèn)認(rèn)可。例例如脫毒毒馬鈴薯薯、脫毒毒紅薯、脫毒生生姜、脫脫毒大蒜蒜、脫毒毒草莓、脫毒苗苗木、脫脫毒花卉卉等等，已成為為現(xiàn)代農(nóng)農(nóng)民致富富的新寵寵2。1.2植植物組織織培養(yǎng)和和脫毒快快繁的定定義植物組織織培養(yǎng)（Plaant tisssuee cuultuure）是指在在無(wú)菌的的條件下下，將離離

4、體的植植物（根根、莖、葉、花花、果實(shí)實(shí)、種子子等）、組織（形成層層、花藥藥組織、胚乳、皮層等等）、細(xì)細(xì)胞（體體細(xì)胞和和生殖細(xì)細(xì)胞）以以及原生生質(zhì)體，培養(yǎng)在在人工配配制的培培養(yǎng)基上上，給予予適當(dāng)?shù)牡呐囵B(yǎng)條條件，使使其長(zhǎng)成成完整的的植株。由于培培養(yǎng)物是是脫離植植物母體體，在玻玻璃瓶中中進(jìn)行培培養(yǎng)，所所以也叫叫做離體體培養(yǎng)。其完整整過(guò)程是是： 脫分分化 再分化化 生生長(zhǎng) 根莖莖葉外植體愈愈傷組織織 生長(zhǎng)點(diǎn)點(diǎn) 或或 完完整植株株發(fā)生 胚狀體體在有些情情況下，再分化化也可不不經(jīng)愈傷傷組織階階段，而而直接發(fā)發(fā)生于脫脫分化的的細(xì)胞1。植物組織織培養(yǎng)脫毒快快繁是人工在在無(wú)菌條條件下利利用植物物體的一一部分，在

5、人工工控制的的營(yíng)養(yǎng)和和環(huán)境條條件下繁繁殖植物物，脫除除病毒得得到無(wú)毒毒苗株，繼而在在大田快快速繁殖殖的技術(shù)術(shù)。脫毒毒及離體體快繁，這是目目前植物物組織培培養(yǎng)應(yīng)用用最多、最廣泛泛和是有有效的一一個(gè)方面面。主要要是進(jìn)行行莖尖培培養(yǎng)脫除除病毒。對(duì)于脫脫毒苗、新育成成、新引引進(jìn)、稀稀缺良種種、優(yōu)良良單株、瀕危植植物和基基因工程程植株等等可通過(guò)過(guò)離體快快速繁殖殖，同時(shí)時(shí)可不受受地區(qū)和和氣候的的影響，比傳統(tǒng)統(tǒng)的繁殖殖方法快快數(shù)萬(wàn)倍倍。植物物組織培培養(yǎng)已發(fā)發(fā)展成為為一門富富有生命命力的學(xué)學(xué)科。追究植物物組織培培養(yǎng)脫毒毒快繁技技術(shù)的發(fā)發(fā)展簡(jiǎn)史史，在111世紀(jì)紀(jì)就出現(xiàn)現(xiàn)的熱處處理脫毒毒法，最最早解決決一些作作物

6、的病病毒病害害問(wèn)題1。本世紀(jì)紀(jì)50年代代發(fā)展的的植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)技術(shù)為為脫毒提提供了一一條有效效途徑?，F(xiàn)在植植物的脫脫毒技術(shù)術(shù)有多種種，其中中應(yīng)用最最廣泛的的有三種種：熱處處理法、莖尖培培養(yǎng)脫毒毒法、抗抗病毒藥藥劑法，將不同同的方法法相結(jié)合合起來(lái)應(yīng)應(yīng)用效果果更好。它們的的脫毒原原理各不不相同。2 脫毒毒技術(shù)及及其原理理2.1 熱處理理法2.1.1 概概述熱處理法法是利用用病毒和和寄主植植物對(duì)高高溫的忍忍耐性的的差異，使植物物的生長(zhǎng)長(zhǎng)速度超超過(guò)病毒毒的擴(kuò)散散速度，得到一一小部分分不含病病毒的植植物分生生組織，然后進(jìn)進(jìn)行無(wú)毒毒個(gè)體培培育。熱處理法法中，最最主要的的影響因因素是溫溫度和時(shí)時(shí)間。熱熱處

7、理可可通過(guò)熱熱水浸泡泡或濕熱熱空氣進(jìn)進(jìn)行。熱熱水浸泡泡對(duì)休眠眠芽效果果較好，濕熱空空氣對(duì)活活躍生長(zhǎng)長(zhǎng)的莖尖尖效果較較好，既既能消除除病毒又又能使寄寄主植物物有較高高的存活活機(jī)會(huì)。熱空氣氣處理比比較容易易進(jìn)行，把旺盛盛生長(zhǎng)的的植物移移入到11個(gè)熱療療室中，在355400下處理理一段時(shí)時(shí)間即可可，處理理時(shí)間的的長(zhǎng)短，可由幾幾分鐘到到數(shù)月不不等44。熱熱處理的的方法有有恒溫處處理和變變溫處理理，處理理的材料料可以是是植株，也可以以是接穗穗。2.1.2原理理熱處理脫脫毒是根根據(jù)病毒毒與寄生生細(xì)胞對(duì)對(duì)高溫的的忍耐程程度不同同，選擇擇適當(dāng)?shù)牡臏囟群秃吞幚頃r(shí)時(shí)間，植植物組織織中的很很多病毒毒被部分分地或完完

8、全地鈍鈍化而可可控制其其的活動(dòng)動(dòng)，但很很少傷害害甚至不不傷害寄寄主組織織，從而而讓植物物細(xì)胞加加快生長(zhǎng)長(zhǎng)，使生生長(zhǎng)點(diǎn)附附近不帶帶病毒，從而達(dá)達(dá)到脫毒毒的目的的。2.1.3簡(jiǎn)史史用熱處理理脫除馬馬鈴薯卷卷葉病毒毒（PLLRV）是世界界上脫除除已知病病毒最早早的例子子。早在在18889年，印度尼尼西亞爪爪哇人就就把繁殖殖用的甘甘蔗切斷斷放在550左右的的熱水中中浸泡330miin來(lái)防防止枯萎萎病（現(xiàn)現(xiàn)已知是是病毒病?。┑陌l(fā)發(fā)生?，F(xiàn)現(xiàn)在世界界許多國(guó)國(guó)家在種種植前仍仍使用這這種方法法處理甘甘蔗。但但是后來(lái)來(lái)人們發(fā)發(fā)現(xiàn)熱水水對(duì)植物物的傷害害大，BBakee (19972)研究表表明在熱熱水處理理中，由由

9、于植物物組織經(jīng)經(jīng)過(guò)淋洗洗，在水水中長(zhǎng)期期浸泡常常常會(huì)窒窒息死亡亡，并且且這種處處理也會(huì)會(huì)打破或或延長(zhǎng)植植物的休休眠期。所以現(xiàn)現(xiàn)在更常常用的方方法是將將病毒感感染的植植物用335388熱空氣氣處理224周周或者更更長(zhǎng)時(shí)間間進(jìn)行脫脫毒44。此此法尤其其適合處處理生理理干旱的的材料和和處于休休眠狀態(tài)態(tài)的果樹樹。熱處理脫脫毒法已已應(yīng)用多多年，被被世界多多個(gè)國(guó)家家利用。該項(xiàng)技技術(shù)要求求的設(shè)備備條件比比較簡(jiǎn)單單，脫毒毒操作也也比較容容易。主主要缺點(diǎn)點(diǎn)是脫毒毒時(shí)間長(zhǎng)長(zhǎng)，脫毒毒不完全全，例如如TMVV這類桿桿狀病毒毒就不能能用這種種方法脫脫除，因因而該方方法有一一定的局局限性。2.2 莖尖培培養(yǎng)脫毒毒法2.2

10、.1概述述莖尖培養(yǎng)養(yǎng)脫毒就就是采取取莖尖分分生組織織離體培培養(yǎng)的方方法獲取取無(wú)病毒毒試管苗苗，其方方法是在在解剖鏡鏡下，用用鋒利的的解剖刀刀進(jìn)行迅迅速準(zhǔn)確確地莖尖尖剝離，因?yàn)榍o莖尖分生生組織基基本不帶帶病毒，利用植植物莖尖尖分生組組織進(jìn)行行離體培培養(yǎng)，再再結(jié)合病病毒檢測(cè)測(cè)，就可可以獲得得無(wú)病毒毒的植株株。莖尖培養(yǎng)養(yǎng)中最主主要的影影響因素素就是切切取莖尖尖的大小小，一般般要求莖莖尖長(zhǎng)度度小于11mm。技術(shù)上上通常切切取莖尖尖越小，脫毒效效果越好好，但是是莖尖培培養(yǎng)成活活率變低低。曹為為玉等研研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)葡萄莖莖尖長(zhǎng)度度與存活活率成正正相關(guān)，與脫毒毒率成反反相關(guān)。當(dāng)切取取莖尖長(zhǎng)長(zhǎng)度為00.20.33

11、mm時(shí)時(shí)，存活活率為221%388%，脫脫毒率為為91.4%977%；當(dāng)當(dāng)切取00.5mmm以上上時(shí)，存存活率為為75%833%，脫脫毒率僅僅為700.6%766.5%8。莖尖培養(yǎng)養(yǎng)脫毒法法脫毒率率高，脫脫毒速度度快，能能在較短短的時(shí)間間內(nèi)得到到較多的的原種繁繁殖材料料，但這這種方法法存在的的缺點(diǎn)是是植物的的存活率率低。為為了克服服這一缺缺點(diǎn)，現(xiàn)現(xiàn)在經(jīng)常常是將莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)與熱處處理相結(jié)結(jié)合來(lái)使使用。莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)與熱處處理相結(jié)結(jié)合之所所以能夠夠提高脫脫毒效果果，是由由于熱處處理可使使植物生生長(zhǎng)本身身所具有有的頂端端免疫區(qū)區(qū)得以擴(kuò)擴(kuò)大，有有利于切切取較大大的莖尖尖（在11mm左左右），從而能能夠提

12、高高培養(yǎng)或或嫁接的的成活率率。如大大櫻桃置置于455的恒溫溫培養(yǎng)室室內(nèi)，培培養(yǎng)355天，再再切取00.20.44mm的的莖尖培培養(yǎng)，平平均脫毒毒率為998%。2.2.2原理理 莖尖培培養(yǎng)脫毒毒的原理理是植物物體內(nèi)病病毒靠維維管束系系統(tǒng)移動(dòng)動(dòng)，分生生組織中中沒(méi)有維維管束存存在，病病毒只靠靠胞間連連絲移動(dòng)動(dòng)，速度度很慢，難以追追上生長(zhǎng)長(zhǎng)活躍的的分生組組織，所所以旺盛盛生長(zhǎng)的的根尖、莖尖一一般都無(wú)無(wú)病毒或或很少有有病毒分分布。2.2.3簡(jiǎn)史史Whitte于19443年首首先發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在感染染煙草花花葉病毒毒的煙草草生長(zhǎng)點(diǎn)點(diǎn)附近病病毒的濃濃度很低低，甚至至沒(méi)有病病毒。這這一發(fā)現(xiàn)現(xiàn)為莖尖尖培養(yǎng)脫脫除病毒毒提

13、供了了理論依依據(jù)。懷懷特（WWhitte ,19334）在在體外培培養(yǎng)感染染了TMMV病毒毒的馬鈴鈴薯根，并用枯枯斑寄主主法測(cè)定定了根不不同部位位的病毒毒含量，發(fā)現(xiàn)根根尖部位位的病毒毒含量比比其他部部位少，甚至不不存在病病毒。MMoreel等19552年首首先從感感染了花花葉病毒毒和斑萎萎病毒的的大麗花花植株上上切取莖莖尖，通通過(guò)組織織培養(yǎng)獲獲得了無(wú)無(wú)病毒的的大麗花花，證明明了前人人假設(shè)的的正確性性1。此后后，人們們采用莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)技術(shù)相相繼獲得得了多種種植物的的無(wú)病毒毒植株?，F(xiàn)在莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)脫毒法法已經(jīng)成成為植物物無(wú)毒苗苗生產(chǎn)中中應(yīng)用最最廣泛的的一種方方法。19988年，桂桂林市大大地生物物

14、技術(shù)研研究所與與廣西山山河經(jīng)濟(jì)濟(jì)發(fā)展公公司聯(lián)合合開展羅羅漢果脫脫毒苗的的培育生生產(chǎn)技術(shù)術(shù)科技攻攻關(guān)，在在選出的的健康植植株中選選取營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)體,經(jīng)經(jīng)過(guò)莖尖尖培養(yǎng)與與其它脫脫毒方法法相結(jié)合合脫毒后后進(jìn)行組組織培養(yǎng)養(yǎng)，從而而獲得不不帶病的的健康苗苗。經(jīng)農(nóng)農(nóng)業(yè)種植植區(qū)試點(diǎn)點(diǎn)種植表表明，這這些經(jīng)莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)脫毒快快繁得到到的羅漢漢果脫毒毒苗植株株健壯無(wú)無(wú)病，長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)旺，結(jié)果早早，數(shù)量量多，品品質(zhì)高，與傳統(tǒng)統(tǒng)壓蔓技技術(shù)種植植的普通通苗相比比，種后后第一年年結(jié)果的的植株達(dá)達(dá)50%70%，增加近近一倍；平均每每株掛果果約300個(gè)，增增加了兩兩倍，一一級(jí)果增增加了115%，有效成成分羅漢漢果甜甙甙的收取取率則提提高

15、了55%。廣西農(nóng)科科院生物物所杭玲玲等在羅漢果果莖尖脫脫毒快繁繁技術(shù)一文中中試驗(yàn)，選擇羅羅漢果青青皮果品品種，采用種種子播種種的實(shí)生生苗,經(jīng)經(jīng)接花葉葉病毒而而致病的的植株，運(yùn)用莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)與熱處處理相結(jié)結(jié)合的方方法對(duì)供供試材料料進(jìn)行除除病毒，經(jīng)用生生物學(xué)指指示植物物鑒定,脫毒率率達(dá)1000%。據(jù)研究，植物體體內(nèi)某一一部分組組織器官官不帶病病毒的原原因是：分生組組織的細(xì)細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)速度快快，病毒毒在植物物體內(nèi)繁繁殖的速速度相對(duì)對(duì)較慢，而且病病毒的傳傳播是靠靠篩管組組織進(jìn)行行轉(zhuǎn)移或或通過(guò)細(xì)細(xì)胞間連連絲傳遞遞給其他他細(xì)胞，因此病病毒的傳傳遞擴(kuò)散散也受到到一定限限制，這這樣便造造成植物物體的部部分組織織

16、細(xì)胞沒(méi)沒(méi)有病毒毒。根據(jù)據(jù)這個(gè)原原理，可可以利用用莖尖培培養(yǎng)來(lái)培培育無(wú)病病毒苗木木。2.3 抗病毒毒藥劑法法2.3.1概述述抗病毒藥藥劑法，這是一一種新的的脫毒方方法，運(yùn)運(yùn)用一些些抗病藥藥劑的作作用影響響病毒RRNA的的復(fù)制形形成，干干擾病毒毒的正常常生長(zhǎng)，從而達(dá)達(dá)到除去去病毒的的目的。常用的的抗病毒毒化學(xué)藥藥物有三三氮唑核核苷（病病毒唑），5-二氫氫尿嘧啶啶（DHHT）和和雙乙酰酰-二氫氫-5-氮尿尿嘧啶（DA-DHTT）。這這些藥物物常常通通過(guò)直接接注射到到帶病毒毒的植株株上，或或者加到到植株生生長(zhǎng)的培培養(yǎng)基上上。這種種方法一一般要與與莖尖培培養(yǎng)相結(jié)結(jié)合應(yīng)用用。經(jīng)過(guò)過(guò)抗病毒毒藥劑處處理的嫩嫩

17、莖，切切取莖尖尖，再進(jìn)進(jìn)行組織織培養(yǎng)，就會(huì)提提高脫毒毒率和成成活率。采用病毒毒抑制劑劑與莖尖尖培養(yǎng)相相結(jié)合的的脫毒方方法，可可以較容容易的脫脫除多種種病毒，而且這這種方法法對(duì)取材材要求不不嚴(yán)，接接種莖尖尖可大于于1mmm，易于于分化出出苗，提提高存活活率。2.3.2原理理抗病毒藥藥劑法的的作用原原理是抗抗病毒藥藥劑在三三磷酸狀狀態(tài)下會(huì)會(huì)阻止病病毒RNNA帽子子結(jié)構(gòu)形形成而達(dá)達(dá)到除去去病毒的的效果。3.3.3簡(jiǎn)史史羅曉芳等等于19996年年曾在培培養(yǎng)基中中加入病病毒唑，脫除了了兩種蘋蘋果潛隱隱病毒1。除了以上上三種脫脫毒方法法以外，花藥培培養(yǎng)法、莖尖嫁嫁接脫毒毒、愈傷傷組織培培養(yǎng)法、胚珠培培養(yǎng)法

18、也也可用于于植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)快繁脫脫毒。3 脫毒毒效果的的檢測(cè)方方法經(jīng)過(guò)脫毒毒處理的的植株是是否還存存在病毒毒，必須須經(jīng)過(guò)病病毒學(xué)檢檢測(cè)才能能確定。可靠的的病毒檢檢測(cè)方法法與建立立有效的的脫毒方方法同等等重要。傳統(tǒng)上上一直沿沿用的檢檢測(cè)方法法是目測(cè)測(cè)法，但但是這種種方法無(wú)無(wú)法剔除除潛隱性性病毒。后來(lái)出出現(xiàn)的指指示植物物法，擴(kuò)擴(kuò)大了檢檢測(cè)范圍圍。近年年來(lái)隨著著生物科科學(xué)的迅迅猛發(fā)展展，免疫疫學(xué)方法法，分子子生物學(xué)學(xué)方法等等許多先先進(jìn)的理理化技術(shù)術(shù)的應(yīng)用用，促進(jìn)進(jìn)了病毒毒檢測(cè)技技術(shù)的改改進(jìn)與發(fā)發(fā)展。下下面簡(jiǎn)要要介紹幾幾種檢測(cè)測(cè)脫毒苗苗的方法法。3.1植植株直接接測(cè)定法法直接觀察察植株莖莖葉有無(wú)無(wú)某

19、種病病毒引起起的可見見癥狀，是最簡(jiǎn)簡(jiǎn)單的測(cè)測(cè)定方法法。不過(guò)過(guò)，由于于某些寄寄主植物物感染病病毒后需需要較長(zhǎng)長(zhǎng)的時(shí)間間才出現(xiàn)現(xiàn)癥狀，有的并并不能使使寄主植植物出現(xiàn)現(xiàn)可見的的癥狀，因而無(wú)無(wú)法快速速檢驗(yàn)。3.2指指示植物物法此法最早早是美國(guó)國(guó)的病毒毒學(xué)家HHolmmes l9229年發(fā)發(fā)現(xiàn)的1。利用病病毒在其其他植物物上出現(xiàn)現(xiàn)癥狀的的特征，作為鑒鑒別種類類的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)。當(dāng)原原始寄主主的癥狀狀不明顯顯時(shí)，就就可用指指示植物物法，這這是因?yàn)闉橹甘局仓参锉仍技闹髦鞲菀滓妆憩F(xiàn)癥癥狀。具具體做法法是將病病葉研磨磨，把汁汁液接種種到寄主主植物上上，對(duì)于于木本植植物，是是將原始始寄主嫁嫁接到指指示植物物上。指指

20、示植物物法簡(jiǎn)便便易行，成本低低，但它它靈敏性性差，所所需時(shí)間間長(zhǎng)，難難以區(qū)分分病毒種種類。3.3血血清學(xué)方方法 抗血清清鑒定法法要進(jìn)行行抗原的的制備(包括病病毒的繁繁殖，病病葉研磨磨和粗汁汁液澄清清等)，抗血清清的采收收、分離離等。血血清可分分裝到小小玻璃瓶瓶中，貯貯存在1525的冰凍凍條件下下。測(cè)定定時(shí)，把把稀釋的的抗血清清與未知知的病毒毒植物在在小試管管內(nèi)混合合，這一一反應(yīng)導(dǎo)導(dǎo)致形成成可見的的沉淀，然后根根據(jù)沉淀淀反應(yīng)來(lái)來(lái)鑒定病病毒。此此法靈敏敏度高，獲得檢檢測(cè)結(jié)果果迅速，是目前前檢測(cè)病病毒的一一種最好好方法。此外，PPCR微微量板雜雜交法5、蛋白質(zhì)質(zhì)電泳法法、嫁接接檢測(cè)法法、 電電子顯微

21、微鏡檢定定法、病病毒癥狀狀學(xué)診斷斷法等也也可以用用來(lái)檢測(cè)測(cè)植物病病毒。4 馬鈴鈴薯組織織培養(yǎng)脫脫毒快繁繁技術(shù)鑒于當(dāng)前前農(nóng)業(yè)經(jīng)經(jīng)濟(jì)作物物生產(chǎn)上上苗木（主要是是無(wú)性繁繁殖作物物）存在在著嚴(yán)重重病毒累累積、品品種退化化、產(chǎn)量量和品質(zhì)質(zhì)大幅度度的下降降等問(wèn)題題，探索索一種脫脫毒效果果好、繁繁殖系數(shù)數(shù)高、簡(jiǎn)簡(jiǎn)易且經(jīng)經(jīng)濟(jì)的繁繁育良種種及健苗苗技術(shù)，是當(dāng)前前農(nóng)業(yè)經(jīng)經(jīng)濟(jì)作物物種苗木木生產(chǎn)中中急需研研究和探探討的課課題。下下面通過(guò)過(guò)以馬鈴鈴薯為例例，進(jìn)行行熱處理理加莖尖尖培養(yǎng)結(jié)結(jié)合病毒毒檢測(cè)法法獲得脫脫毒苗的的方法，簡(jiǎn)述植植物組織織培養(yǎng)脫脫毒快繁繁技術(shù)的的應(yīng)用。4.1 研究簡(jiǎn)簡(jiǎn)史馬鈴薯在在種植過(guò)過(guò)程中易易感染病

22、病毒，當(dāng)當(dāng)條件適適合時(shí)，就會(huì)在在植株體體內(nèi)增殖殖，轉(zhuǎn)運(yùn)運(yùn)和積累累于所結(jié)結(jié)薯塊中中，并且且世代傳傳遞，逐逐年加重重4。病毒毒的增殖殖與植物物正常代代謝極為為密切，目前尚尚沒(méi)有發(fā)發(fā)現(xiàn)既能能殺死病病毒又不不損傷植植物的藥藥劑，病病毒危害害一度成成為馬鈴鈴薯的不不治之癥癥。19953年年Nirrriss將孔雀雀石綠（Mallachhitee grreenn）加入入培養(yǎng)基基中抑制制病毒繁繁殖，并并通過(guò)莖莖尖組織織培養(yǎng)，獲得青青山（GGreeen mmounntaiin）品品種無(wú)PPVX（馬鈴薯薯X病毒）的馬鈴鈴薯植株株。此后后，通過(guò)過(guò)莖尖組組織培養(yǎng)養(yǎng)獲得無(wú)無(wú)病毒植植株的技技術(shù)迅速速發(fā)展，為解決決馬鈴薯薯

23、病毒危危害提供供了有效效途徑，為生產(chǎn)產(chǎn)提供優(yōu)優(yōu)良種薯薯。目前前，國(guó)際際上用莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)產(chǎn)生的的馬鈴薯薯品種已已達(dá)1550個(gè)左左右11?？茖W(xué)研究究結(jié)果證證明，侵侵染馬鈴鈴薯的病病毒有220多種種。這些些病毒一一旦侵入入馬鈴薯薯植株和和塊莖，就會(huì)引引起馬鈴鈴薯退化化，出現(xiàn)現(xiàn)各種各各樣的病病態(tài)，造造成不同同程度的的減產(chǎn)。研究的的結(jié)果還還證明，病毒在在植物組組織中分分布是不不均勻的的，并且且受一定定環(huán)境條條件影響響，在靠靠近馬鈴鈴薯莖的的頂端病病毒濃度度很低或或不含病病毒。根根據(jù)這一一特點(diǎn)，通過(guò)莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)可以獲獲得馬鈴鈴薯無(wú)病病毒苗3。另外，馬鈴薯薯病毒，有的對(duì)對(duì)溫度比比較敏感感，有的的不敏感感，但

24、對(duì)對(duì)植株或或發(fā)芽的的塊莖進(jìn)進(jìn)行高溫溫處理后后再作莖莖尖培養(yǎng)養(yǎng)，一般般脫毒率率都比較較高。因因此，在在莖尖培培養(yǎng)前，對(duì)植株株和發(fā)芽芽塊莖進(jìn)進(jìn)行30035，288天的高高溫預(yù)處處理，能能收到良良好的效效果。4.2 馬鈴薯薯莖尖培培養(yǎng)脫毒毒方法利用莖尖尖組織培培養(yǎng)結(jié)合合病毒檢檢測(cè)，對(duì)對(duì)馬鈴薯薯進(jìn)行脫脫毒，進(jìn)進(jìn)而生產(chǎn)產(chǎn)脫毒種種薯用于于生產(chǎn)，可有效效地防止止種薯退退化，大大幅度提提高馬鈴鈴薯產(chǎn)量量3。其主主要脫毒毒方法如如下：4.2.1 取取材和消消毒將欲脫毒毒地品種種塊莖催催芽，芽芽長(zhǎng)45cmm時(shí)，剪剪芽并剝剝?nèi)ネ馊~葉，自來(lái)來(lái)水下沖沖洗400minn，于無(wú)無(wú)菌室內(nèi)內(nèi)用漂白白粉溶液液消毒后后，無(wú)菌菌水沖

25、洗洗233次。4.2.3 剝剝離莖尖尖和接種種在無(wú)菌室室內(nèi)，于于40倍地地解剖鏡鏡下，剝剝?nèi)?1個(gè)葉原原基地莖莖尖，接接種于MMS莖尖尖培養(yǎng)基基地試管管中。試試管中的的MS莖尖尖培養(yǎng)基基包括大大量元素素、微量量元素、有機(jī)成成分和生生長(zhǎng)素、細(xì)胞分分裂素、蔗糖和和瓊脂，pH值值為5.8，經(jīng)經(jīng)過(guò)高壓壓蒸汽滅滅菌后使使用，每每試管接接種1個(gè)莖尖尖。4.2.4培養(yǎng)養(yǎng)基和培培養(yǎng)條件件莖尖培養(yǎng)養(yǎng)的關(guān)鍵鍵是獎(jiǎng)脫脫毒后的的莖尖透透導(dǎo)生成成帶有完完整根、莖、的的植株，因此選選擇適合合的培養(yǎng)養(yǎng)基十分分重要。對(duì)于馬馬鈴薯的的莖尖培培養(yǎng)來(lái)說(shuō)說(shuō)，需要要較多的的NO33和NH44+營(yíng)養(yǎng)，MS和Milllerr基本培培養(yǎng)基

26、都都是較好好的培養(yǎng)養(yǎng)基，而而且附加加少量（01.moll/l0.55moll/l）的生長(zhǎng)長(zhǎng)素或細(xì)細(xì)胞分裂裂素或二二者都加加，培養(yǎng)養(yǎng)的效果果更好。接種的的莖尖培培養(yǎng)于225、1550030000LXX光照條條件下培培養(yǎng)室內(nèi)內(nèi)，3個(gè)月則則長(zhǎng)成334片片葉的小小植株在在無(wú)菌條條件下，進(jìn)行切切段擴(kuò)繁繁一次，取部分分苗進(jìn)行行病毒檢檢測(cè)66。4.2.5 病病毒檢測(cè)測(cè) 病毒檢測(cè)測(cè)是莖尖尖脫毒不不可缺少少的步驟驟。常用用鑒別寄寄主即指指示植物物或血清清學(xué)方法法進(jìn)行檢檢測(cè)，及及時(shí)淘汰汰血清學(xué)學(xué)陽(yáng)性反反應(yīng)或在在指示植植物上有有癥狀的的莖尖苗苗，無(wú)任任何反應(yīng)應(yīng)的莖尖尖苗即脫脫毒苗用用作大田田快速繁繁殖。4.2.6

27、結(jié)結(jié)果通過(guò)利用用莖尖組組織培養(yǎng)養(yǎng)結(jié)合病病毒檢測(cè)測(cè)法獲得得馬鈴薯薯脫毒苗苗，經(jīng)病病毒檢測(cè)測(cè)，除去去了馬鈴鈴薯中的的病毒病病，脫毒毒率可達(dá)達(dá)1000%。5植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)脫毒快快繁技術(shù)術(shù)應(yīng)用前前景的簡(jiǎn)簡(jiǎn)述植物組織織培養(yǎng)技技術(shù)在作作物上主主要用于于育種和和良種繁繁殖，其其次用于于無(wú)性繁繁殖作物物的脫毒毒和快繁繁以及種種質(zhì)的保保存等，可見植植物組織織培養(yǎng)脫脫毒快繁繁技術(shù)對(duì)對(duì)于農(nóng)作作物苗木木的生產(chǎn)產(chǎn)具有極極其重要要的地位位1。一些些農(nóng)作物物或是花花卉植物物等因長(zhǎng)長(zhǎng)期的栽培和種植，植物體體內(nèi)被侵侵染攜帶帶病毒、種性退退化現(xiàn)在在能利用用組織培培養(yǎng)及快快繁脫毒毒方法開開發(fā)出的的植物脫脫毒新品品種有馬馬鈴薯、甘

28、薯、生姜、大蒜、草莓、羅漢果果、棕櫚櫚、劍麻麻、香蕉蕉、甘蔗蔗以及花卉卉植物等等幾百種種再生植植株。目目前這種種技術(shù)已已得到了了廣泛應(yīng)應(yīng)用，前前景及范范圍非常常廣闊。脫毒株苗苗的快繁繁技術(shù)是是，經(jīng)過(guò)過(guò)莖尖培培養(yǎng)和檢檢測(cè)取得得的脫毒毒苗，首首先按不不同品種種保存在在管瓶中中。在需需要時(shí)對(duì)對(duì)脫毒苗苗進(jìn)行切切段繁殖殖，繁殖殖試管苗苗一般都都用MSS培養(yǎng)基基，在1100mml的三三角瓶接接種46節(jié)段段。每節(jié)節(jié)含一個(gè)個(gè)葉片。在無(wú)菌菌條件下下進(jìn)行培培養(yǎng)。培培養(yǎng)的節(jié)節(jié)段經(jīng)過(guò)過(guò)355天即可可生根，幼芽也也從葉腋腋發(fā)出，10天左左右可形形成23片葉葉的幼苗苗。200天左右右即長(zhǎng)成成566片葉的的小植株株。一個(gè)個(gè)

29、三角瓶瓶有46株脫脫毒苗。這些小小植株又又可按上上述方法法進(jìn)行切切段繁殖殖，從而而擴(kuò)大無(wú)無(wú)病毒苗苗株的數(shù)數(shù)量77。6結(jié)論由微生物物所引起起的植物物組織培培養(yǎng)污染染一直是是當(dāng)前制制約植物物組培發(fā)發(fā)展的主主要障礙礙，特別別在接種種和培養(yǎng)養(yǎng)過(guò)程中中，污染率率常常高高達(dá)800% 以上上。如何解解決這個(gè)個(gè)問(wèn)題已已經(jīng)引起起很多人人的重視視.國(guó)內(nèi)內(nèi)許多研研究人員員開展了了這方面面的一些些研究，但還欠欠缺更深深入的研研究探討討。這是是有待去去探討開開發(fā)的一一個(gè)課題題。本文結(jié)合合了筆者者在桂林萊萊茵生物物科技股股份有限限公司的的實(shí)習(xí)實(shí)實(shí)踐，綜綜合了自自己通過(guò)過(guò)做實(shí)驗(yàn)驗(yàn)和工作作實(shí)踐中中獲得的的知識(shí)與與想法，對(duì)國(guó)內(nèi)內(nèi)外植物物組織培培養(yǎng)的研研究概況況作