DB13-T2456-2017番茄苗期抗黃化曲葉病-毒基因快速檢測(cè)技術(shù)規(guī)程-

1、ICS 67.080.01B 31DB13河北省地方標(biāo)準(zhǔn)DB13/T 24562017番茄苗期抗黃化曲葉病毒基因快速檢測(cè)技術(shù)規(guī)程2017 - 03 - 29 發(fā)布2017 - 06 - 01 實(shí)施河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā) 布DB13/ T 24562017I前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由河北省農(nóng)林科學(xué)院提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳志明、李亞棟、耿保進(jìn)、高慧敏、田玉、孫英燾、孫世衛(wèi)、寇慧蘋、馮賀敬。DB13/ T 24562017DB13/T 24562017表1給出了抗TYLCV的抗病基因擴(kuò)增引物。 PAGE 5 P

2、AGE 6番茄苗期抗黃化曲葉病毒基因快速檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了番茄苗期抗黃化曲葉病毒基因的檢測(cè)前準(zhǔn)備和檢測(cè)技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于番茄苗期抗黃化曲葉病毒基因Ty-1、Ty-2、Ty-3/3a的分子快速檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。2.1番茄黃化曲葉病毒?。═omato yellow leaf curl virus disease）為病毒性病害，病原為番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV or TY）， 病原特征及發(fā)病癥狀見附錄C。2.2番茄抗黃化曲葉病毒基因2.2.1番茄抗黃化曲葉病毒基因Ty-1定位在番茄第6號(hào)染色體上(基因

3、號(hào))。2.2.2番茄抗黃化曲葉病毒基因Ty-2定位在番茄第11號(hào)染色體上。2.2.3番茄抗黃化曲葉病毒基因Ty-3/3a定位在番茄第6號(hào)染色體上。檢測(cè)前準(zhǔn)備檢測(cè)儀器組織研磨儀、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、高壓滅菌鍋、移液器、稱量天平、冰箱(4 、-20 、-80 )、電泳儀、紫外凝膠成像儀、PCR儀等。檢測(cè)試劑DNA提取液(CTAB)、氯仿/異戊醇(24/1)、乙醇、異丙醇、蒸餾水、雙蒸餾水（ddH2O）、TE緩沖液(Ph=8.0)、50 x TAE緩沖液、Goldview、DM2000、瓊脂糖、Taq 酶等。檢測(cè)引物表 1Ty-1、Ty-2 和 Ty-3/3a 檢測(cè)引物基因染色體引物序列(5-3)擴(kuò)

4、增產(chǎn)物(bp)標(biāo)記類型Ty-16Ty1 正向TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTC984（抗）1434（感）SNPTy1 反向AATGGTGACAGAATCAAGATCCACTy1-3AAACGCTCTTCTTCCCCTCGTy1-4AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCATy-211Ty2 正向AAAATGTTCGTCTCTTTTAATCATAC194（抗）494（感）SCARTy2 反向AGTGTACATCCTTGCCATTGACTTy-3/3a6Ty3 正向GGTAGTGGAAATGATGCTGCTCTy3 450（抗）320（感）SCARTy3 反向GCTCTGCCTATT

5、GTCCCATATATAACCTy3a630（抗）DNA 提取液配制配制以下DNA提取液：100 mmol/L Tris (pH=8.0)；50 mmol/L EDTA；500 mmol/L NaCl；2 %CTAB（W/V）；0.8 %皂土（W/V）。檢測(cè)技術(shù)樣品采集和保存采集定植前番茄苗至少3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取35株，進(jìn)行編號(hào)、保存。短期保存溫度4 ，長(zhǎng)期保存溫度-20 或-80 。DNA 提取DNA提取按下列步驟進(jìn)行：在 2 mL 離心管加入 0.2 g 左右樣本、一粒磨樣珠，用磨樣機(jī)研磨成勻漿；加入 600 l 65 預(yù)熱的 DNA 提取液，65 保溫 30 min 以上；加入

6、600 l 氯仿/異戊醇（24/1），上下顛倒混勻數(shù)次，室溫靜置 5 min；6000 rpm 以上室溫離心 10 min，吸取上清液 400 L 至 1.5 ml 離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置 5 min；10000 rpm 以上離心 10 min，棄上清液；加入 1 ml 70 %乙醇洗滌，用手指輕彈使沉淀漂浮于乙醇中；6000 rpm 以上離心 5 min，棄上清液，將離心管倒扣在濾紙上，風(fēng)干 DNA；加入 50 L TE 緩沖液；i)完全溶解后，取 4 L DNA 進(jìn)行 1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，剩下的置于-20 或-80 冰箱中保存。Ty-1、Ty-2 和 T

7、y-3/3a 檢測(cè)PCR 檢測(cè)反應(yīng)體系PCR反應(yīng)液體積為20 L，組分配制應(yīng)符合表2的規(guī)定。表 2PCR 反應(yīng)體系反應(yīng)組分原濃度終濃度反應(yīng)體積 LDNA30 ng/ L50 ng/ L1.5 ng/ L2.5 ng/ L110buffer10buffer1buffer2dNTP2.5 mmol/L0.15 mmol/L1.6Taq 酶5 U/ L0.2U/ L0.2正向引物10 mol/L0.5 mol/L1反向引物10 mol/L0.5 mol/L1ddH2O13.2Ty-1、Ty-2 和 Ty-3/3a PCR 反應(yīng)程序按下列程序進(jìn)行操作：94 預(yù)變性5 min；b) 94 變性50 s，

8、58 退火30 s，72 延伸1 min30 s，共5個(gè)循環(huán)；c) 94 變性50 s，56 退火30 s，72 延伸1 min 30 s，共30個(gè)循環(huán)；d) 72 延伸10 min，4 保存。電泳檢測(cè)采用1.5 %（w/v）瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。用紫外凝膠成像儀記錄電泳結(jié)果。檢測(cè)結(jié)論與檢測(cè)報(bào)告檢測(cè)結(jié)論判定依據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果顯示為電泳圖譜。電泳圖譜見附錄 A。填寫檢測(cè)報(bào)告，檢測(cè)報(bào)告式樣見附錄 B。DB13/T 24562017DB13/ T 24562017附錄 A（規(guī)范性附錄） 電泳圖譜注：Ty-1 純合體顯示 984 bp 條帶，感病純合體顯示 1343 bp 條帶，而雜合體顯示

9、 984 bp 和 1343 bp 條帶。圖 A.1 Ty-1 抗病基因檢測(cè)電泳圖譜注：Ty-2 純合體顯示 194 bp 條帶，感病純合體顯示 494 bp 條帶，而雜合體顯示 194 bp 和 494 bp 條帶。圖 A.2 Ty-2 抗病基因檢測(cè)電泳圖譜注：Ty-3 a 純合體顯示 630 bp 條帶，Ty-3 純合體顯示 450 bp 條帶，感病純合體顯示 320 bp 條帶，而 Ty-3 /Ty3a 的雜合體分別顯示 630/450 bp 和 320 bp 條帶。圖 A.3 Ty3/Ty3a 抗病基因電泳圖譜附錄 B（規(guī)范性附錄） 檢測(cè)報(bào)告式樣表 B.1檢測(cè)報(bào)告式樣番茄苗期抗黃化曲葉

10、病毒基因快速檢測(cè)報(bào)告共頁(yè)，第頁(yè)（附圖頁(yè)）樣品名稱：樣品編號(hào)：樣品數(shù)量：樣品性狀：檢驗(yàn)項(xiàng)目：檢驗(yàn)依據(jù)：主要儀器設(shè)備：檢驗(yàn)條件：檢驗(yàn)時(shí)間：送檢單位：送樣時(shí)間：聯(lián)系地址：聯(lián)系電話：檢驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果： 1、 受檢樣品性狀2、 檢驗(yàn)方法 3、 結(jié)果 4、 結(jié)論承檢單位：地址：郵政編碼：聯(lián)系人： 聯(lián)系電話：主檢人：技術(shù)負(fù)責(zé)人：檢驗(yàn)日期： 年 月日附錄 C（資料性附錄）番茄黃化曲葉病病原特征及發(fā)病表現(xiàn)中國(guó)番茄黃化曲葉病毒 (Tomato yellow leaf curl virus ， TYLCV) ， 屬于雙生病毒科（Geminiviridae），菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）病毒，因該屬病毒在自然條件下只能由煙粉虱（Bemisia tabaci）以持久方式傳播，又被稱為粉虱傳雙生病毒，是一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物DNA 病毒植株矮