可溶性型鴨肝炎病毒3d蛋白在制備病毒性疫苗的免疫增強劑中應(yīng)用

1、可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨性肝炎的免疫增強劑中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物化學領(lǐng)域，具體涉及可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨性肝炎的免疫增強劑中的應(yīng)用。背景技術(shù)鴨性肝炎（DVH），是由鴨肝炎（DHV）引起的雛鴨傳染病，以肝臟性炎癥為特征，表現(xiàn)為急性、高度接觸性和致死性，在新疫區(qū)的率達 90%以上。臨床特征主要表現(xiàn)為角弓反張（神經(jīng)癥狀）、肝臟腫大并見大小不一斑。鴨肝炎屬于小 RNA 病毒科（Picornaviridae）禽肝炎屬（Avihepato有三個型，分別為 DHAV-1、），本DHAV-2 和 DHAV-3，無免疫交叉反應(yīng)或免疫交叉反應(yīng)弱。在我國，主要流行 1 型鴨炎。性肝

2、目前對 DHV 的控制主要依靠接種。雖然這些在控制鴨性肝炎方面起到了極大的作用，但也還存在諸多有待于改進和提高的方面，因此有必要開拓研究及防控的新領(lǐng)域。其中免疫增強劑的研究即是重要方向之一。所謂免疫增強劑是一類通過非特異性途徑提高機體對抗原或微生物特異性反應(yīng)的物質(zhì)。自 1925 年法國免疫學家兼獸醫(yī) Gaston Ramon 發(fā)現(xiàn)在中加入某些與之無關(guān)的物質(zhì)可以特異地增強機體對白喉和破傷風毒素的抵抗反應(yīng)以來, 在醫(yī)學和獸醫(yī)學領(lǐng)域中，許多國家都不同程度地開展了這方面的研究。尤其是在工程技術(shù)飛速發(fā)展,工程不斷開發(fā)以及生活水平日益提高的今天，一方面工程需要加入佐劑提高其保護率；另一方面公眾健康意識日益

3、增強，免疫增強劑在醫(yī)療、方面的作用也越來越受到重視，因而免疫增強劑再次成為當代免疫學研究的熱點。免疫增強劑可單獨或與抗原同時使用，能夠增強機體免疫應(yīng)答的物質(zhì)，可通過不同的作用方式增強機體的特異性和非特異性免疫應(yīng)答。目前，免疫增強劑的種類繁多，主要有 5 類：微生物來源的藥物（如卡介苗等）、生物因子類藥物（如胸腺素、IFN- 等）、人工類藥物（如左旋咪唑）、微量元素類（如硒、鋅等）、天然類藥物（如黃芪多糖等）。世界衛(wèi)生組織（WTO） 對免疫增強劑有五項標準：（1）化學成分明確；（2）易于降解；（3） 刺1激作用適中；（4）無及致突變作用；（5）無毒性及不良反應(yīng)。目前專門針對鴨的免疫增強劑，特別是

4、針對 I 型鴨肝炎的免疫增強劑較少。發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨3D 蛋性肝炎的免疫增強劑中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供可溶性 I 型鴨肝炎預(yù)防 I 型鴨性肝炎免疫制劑中的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：1、可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨性肝炎的免疫增強劑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述免疫增強劑為細胞免疫增強劑或體液免疫增強劑。2、可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋預(yù)防 I 型鴨性肝炎免疫制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明中可溶性 3D 蛋白由如下方備：包括如下步驟：將 SEQ ID NO.3 所示序列的第91376 位核苷酸連接于 pET-3

5、2(a)+載體的多克隆酶切位點處，然后以大腸桿菌 Rosetta、BL21或 BL21(DE3)PLYS 為宿主菌，在抗性的 LB 培養(yǎng)基中活化后，在 IPTG 終濃度為 0.21.0mmol/L、溫度為 2039 條件下誘導(dǎo)表達 412 小時。其中宿主菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3)PLYS；誘導(dǎo)表達的最佳條件為 IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L、溫度為 25條件下誘導(dǎo)表達 6 小時；活化的具體步驟為：將表達菌株接種于抗性的 LB 培養(yǎng)基中，在 37、120 r/min 條件下過夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液與培養(yǎng)至 OD600 為 0.6 即可?？剐缘?LB 培養(yǎng)基按體積比為 1：100

6、擴大表達后還包括純化步驟，具體如下：收集菌液，在 12000 r/min 條件下離心 10 min 后收集菌體，收集的菌體用 20 mmol/L、為 8.0 的 Tris-HCl 懸浮，然后在冰浴下超聲，將破碎后的菌體在 4、12000r/min 條件下離心 10min，收集上清，上清用 Ni2+-NTA 瓊脂糖凝純化，透析，用 0.45 m 的濾膜超濾得純化的可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白。冰浴下超聲最佳條件為在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec/次，每次之間間隔 30sec。本發(fā)明的有益效果在于：可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋I 型鴨性肝炎免疫增強劑中的應(yīng)用，將可溶性 I 型鴨肝炎3D

7、蛋白單獨免疫或與 I 型鴨性肝炎共免疫鴨后能夠增加 CD8+ T 淋巴細胞數(shù)量，并且提高 IL-2、IL-4 和 IFN- 等細胞因子的含量，表明能夠增強免疫鴨的細胞免疫和體液免疫力，同時經(jīng)攻毒保護試驗和解剖分析還可以得出免疫可溶性 I 型鴨肝炎3D 蛋白后還能降低免疫鴨攻毒后的病變和致死率，為免疫預(yù)防 I型鴨肝炎奠定了基礎(chǔ)。2附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：圖 1 為 I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3DPCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果（M：DL 2000Marker，1：3DPCR 擴增產(chǎn)物）。圖 2 為I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3D載體構(gòu)建過

8、程中PCR 鑒定和酶切鑒定結(jié)果（A：pJET-1.2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒 PCR 鑒定，M：DL2000 Marker，1：PCR 產(chǎn)物；B： pJET-1.2+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒酶切鑒定，M：DL15000 Marker，1：Kpn/Xho雙酶切條帶， 2：Xho單酶切條帶；C：pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的 PCR 鑒定，M：DL2000 Marker，1：PCR 產(chǎn)物；D：pET32a+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒的酶切鑒定，1：Kpn/Xho雙酶切結(jié)果，2：Xho單酶切條帶）。圖 3 為可溶性 3D 蛋白表達條件的優(yōu)化（M 為低分子量蛋白質(zhì)標準品；A：表

9、達菌的篩選，1 為 pET-32(a)+空載體表達產(chǎn)物，2-4 分別為 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Rosetta、BL21 和 BL21(DE3)PLYS 三種不同表達宿主菌的表達產(chǎn)物；B：誘導(dǎo)表達時間的優(yōu)化，1-5 依次為誘導(dǎo) 12 h、10 h、8 h、6 h 和 4 h 的 BL21(DE3)PLYS 宿主菌表達產(chǎn)物；C：誘導(dǎo)表達溫度的優(yōu)化，1-6 分別為 39、37、35、30、25和 20的 BL21(DE3)PLYS宿主菌表達產(chǎn)物；D：IPTG 濃度優(yōu)化，1-5 分別為 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol

10、/L 和 1.0 mmol/L 的 IPTG 誘導(dǎo)的表達產(chǎn)物。圖 4 為可溶性 3D 蛋白 Western-blot 檢測及純化蛋白電泳（A 為 3D 蛋白的免疫印跡檢測結(jié)果，M 為蛋白質(zhì) Marker，1 為 3D 蛋白印跡。B 為 SDS檢測純化的 3D 蛋白，M 為低分子量蛋白質(zhì) Marker，1 為純化的 3D 蛋白）。圖 5 為攻毒的鴨及肝臟（A：攻毒鴨顯著的角弓反張； B：攻毒鴨肝臟特征性）。具體實施方式下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J. 薩姆等著）中所述的條件，或按照制造廠商所

11、建議的條件。實施例 1、克隆 I 型鴨肝炎株 DHAV-H 的 3DI 型鴨肝炎株 H（DHAV-H）（GenB：JQ301467）、E. coli DH5 菌種和 pET-32(a)+3載體均由禽病防治保存并提供。各種分子生物學試劑購于生物試劑公司。根據(jù) DHAV-H 的引物如下：組序列（GenB：JQ301467）設(shè)計擴增 3D的引物，具體P1：5-ggggtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3（SEQ ID NO.1），下劃線表示 Kpn酶切位點；P2：5-acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3（SEQ ID NO.2），下劃線表示 Xh

12、o酶切位點；然后將設(shè)計的引物由寶生物工程（大連）。取保存的 DHAV-H液以滅菌 PBS 作 5 倍稀釋，添加 1/100 體積的雙抗（青霉素、鏈霉素的終濃度分別為 100IU/mL 和 100g/mL）后于 37 溫育 1 h，然后接種 9 日齡發(fā)育良好、無母源抗體的鴨胚，棄去 24 h 內(nèi)胚，收集 2472 h胚的尿囊液及胚體，按照 Trizol 試劑盒將提取的提取RNA。cDNA，然后以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，反轉(zhuǎn)錄RNA 反轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴增體系如表 1 所示。表 1反轉(zhuǎn)錄和 PCR 反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄程序為：30 10 min，42 15 min，95 5 min，4 5

13、 min，循環(huán)一次；PCR程序為：94預(yù)變性 5 min；94變性 40 sec，56退火 40 sec，72后延伸 30 sec，30 個循環(huán)，最后 72后延生 10 min。將 PCR 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖 1 所示。結(jié)果顯示，擴增獲得長度約 1386bp 的片段（不包括內(nèi)切酶位點和保護性堿基為 1368bp），其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3 所示，與預(yù)期片段大小相同，因此按照天根生化科技()的膠回收試劑盒回收目的條帶，回收獲得的片段命名為 DHAV-H-3D。實施例 2、構(gòu)建表達 I 型鴨肝炎株 H 3D 蛋白的表達載體將回收的 DHAV-H-3D 與 pJET1

14、.2 載體連接，連接反應(yīng)參照 pJET1.2 克隆試劑盒4RTPCR5*PrimescriptTM Buffer2 LPrimescript RTase Mix0.5 L下游引物P21 LRNA2 LRNAase Free 水4.5 L小計10 L2*Prime Star Mix12.5 L上游引物P1（10pmol/L）1 L下游引物P2（10pmol/L）1 LcDNA1 L滅菌蒸餾水9.5 L小計25 L進行，反應(yīng)體系如表 2 所示。表 2、連接 DHAV-H-3D 與 pJET1.2 載體項目體積2Reaction Buffer DHAV-H-3D 回收產(chǎn)物 pJET1.2 載體水（n

15、uclease free） T4 DNA-ligase小計10 L1 L1 L7 L1 L20 L按表 2 體系混合后進行瞬時離心，然后在 20條件下連接 15 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5抗性的 LB 固體及液體培養(yǎng)基篩選，并將篩選菌落用 SEQ ID NO.1感受態(tài)細胞，并用和 SEQ ID NO.2 所示序列為引物進行 PCR 檢測，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2 中 A 所示。結(jié)果顯示，篩選獲得了陽性克隆。為了進一步檢測陽性克隆，將陽性克隆的菌株提取質(zhì)粒，然后經(jīng) Kpn和 Xho雙酶切及 Xho單酶切鑒定，酶切體系如表 3 所示。表 3、Kpn及 Xho酶切鑒定反應(yīng)體系單酶切體

16、系雙酶切體系10H buffer質(zhì)粒2.5 L 10 L11.5 L/ 1 L25 L10H buffer質(zhì)粒2.5 L 10 L10.5 L1 L1 L25 L滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水KpnXho小計KpnXho小計按表 3 體系混合后瞬時離心，然后于 37條件水浴 3h，反應(yīng)結(jié)束將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖 2 中 B。結(jié)果顯示，DHAV-H-3D 片段正確連入 pJET1.2 載體中，并命名為 pJET-1.2+/DHAV-H-3D。將 pJET-1.2+/DHAV-H-3D 送 Invitrogen 公司篩選未突變的序列用于構(gòu)建表達載體。，取正確的 pJET-1.2+/DHA

17、V-H-3D 和pET-32(a)+載體分別用 Kpn和 Xho進行雙酶切，回收 3D及載體骨架，然后按表 4 所示體系進行連接。表 4、3D及載體骨架連接體系項目體積55.5 L 2 L7.5 L15 L目的pET32a+回收液2Ligation mix小計按表 4 體系混合后瞬時離心，然后于 16條件下過夜連接，得 pET-32(a)+/DHAV-H-3D質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5 宿主菌，以抗性 LB 固體及液體培養(yǎng)基篩選，然后進行 PCR鑒定，結(jié)果如圖 2 中 C 所示。然后將 PCR 鑒定為陽性的菌株用于提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒用Kpn和 Xho進行雙酶切及 Xho進行單酶切，酶切產(chǎn)物進行

18、瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2 中 D 所示。由圖 2 中 C 和 D 可知，3D及載體骨架正確連接。實施例 3、I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白的表達表達宿主菌大腸桿菌（ Escherichia coli ） Rosetta 、大腸桿菌 BL21 和大腸桿菌BL21(DE3)PLYS 菌種均由禽病防治保存；含 I 型鴨肝炎株 H 3D蛋白的表達載體 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 由實施例 2 中構(gòu)建；各種分子生物學試劑購于生物試劑公司。將實施例 2 獲得的 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 BL21 、 Rosetta 和BL21(DE3)PLYS 表達菌

19、，轉(zhuǎn)化菌于過夜培養(yǎng)，次日將過夜培養(yǎng)物與新鮮抗性的 LB 液體培養(yǎng)基中 37、120 r/min 條件下抗性的 LB 液體培養(yǎng)基按體積比為 1：100 擴大培養(yǎng)約 3 小時，菌液 OD600 達 0.6 時加入 IPTG 至終濃度為 0.2 mmol/L，并在 37下誘導(dǎo)12 h，然后收集菌液，將菌液在 12000 r/min 條件下、離心 10 min，菌體用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）按 1:10（V/V）懸浮。同時以 pET-32(a)+載體轉(zhuǎn)化相應(yīng)表達菌作為對照。為了篩選表達出可溶性 3D 蛋白的表達菌，然后將上述制得的懸浮菌液在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec

20、/次，每次之間間隔 30sec，然后將破碎后的菌液在 4、12000r/min條件下離心 10min，棄沉淀（為不溶性包涵體表達蛋白），收集上清（為可溶性表達蛋白）。吸取 80L 上清，加入 20L 含-巰基乙醇的 5SDS 上樣buffer，煮沸 10min 后在 12000r/min條件下常溫離心 5min，然后進行 SDS電泳檢查，結(jié)果如圖 3 中 A 所示。結(jié)果顯示，通過將重組質(zhì)粒 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 轉(zhuǎn)化到三種表達菌后，在約 68 kD 處出現(xiàn)了目的條帶，而對照不含有此條帶，并且轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)PLYS 菌株的蛋白表達量最大、BL21的表達量次之，所以根

21、據(jù)表達量篩選出最佳表達菌為 BL21(DE3)PLYS。I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白表達條件的優(yōu)化：（1）IPTG 濃度的優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS6菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 5抗性的 LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至終濃度分別為 0.2 mmol/L、 0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L 和 1.0 mmol/L，然后在 37條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 12 h，然后用 SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達量，結(jié)果如圖 3 中

22、 B 所示。結(jié)果顯示，IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L條件下可溶性 3D 蛋白的表達量最高，即 IPTG 終濃度為 0.8 mmol/L 為最適濃度。（2）誘導(dǎo)表達溫度優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 6抗性的 LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，然后分別于溫度為 20、 25、30、35、37和 39條件下誘導(dǎo) 12 h，然后用 SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達量，結(jié)果如圖 3 中 C 所示。結(jié)果

23、顯示，溫度在 25條件下可溶性 3D 蛋白的表達量最高，即誘導(dǎo)溫度為 25為最適表達溫度。（3）誘導(dǎo)表達時間優(yōu)化：將含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按體積比為 1:100 接種于 5抗性的 LB 液體培養(yǎng)基試管中，并于 37振蕩培養(yǎng)至 OD600=0.6 左右，加入 IPTG 至終濃度為 0.8 mmol/L，然后于溫度為 25條件下誘導(dǎo) 4 h、6 h、8 h、10 h 和 12 h，然后用 SDS檢測可溶性 3D 蛋白的表達量，結(jié)果如圖 3 中 D 所示。結(jié)果顯示，溫度在誘導(dǎo)表達 6h 后可溶性 3D 蛋白的表達量以達到最高，

24、即誘導(dǎo)表達時間為 6h。經(jīng)過上述優(yōu)化，可以看出含有 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 重組質(zhì)粒的 BL21(DE3)PLYS菌最優(yōu)表達條件為 0.8 mmol/L IPTG、25誘導(dǎo) 6 h。后續(xù)按照此條件對 3D 蛋白進行大量表達。I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白 Western-blot 檢測，具體步驟如下：按最優(yōu)表達條件表達可溶性 3D 蛋白，然后進行 SDS，隨后將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上，80 V 轉(zhuǎn)印 90 min，轉(zhuǎn)印完畢后將 PVDF 膜取出，以 1% BSA 于 37 搖動孵育 1 h，然后以1：100 稀釋的抗 DHAV 的 IgG 在 37搖動孵育

25、 1 h 后取出，以 TBS 洗滌 3 次，每次 2 min，隨后以 1：3000 稀釋的 HRP 標記的二抗 IgG 于 37搖動孵育 1 h，以 TBS 洗滌后按照 DAB顯色，待目的條帶清晰可見時以蒸餾水沖洗終止顯色，結(jié)果如圖 4 中 A顯色試劑盒所示，最后將 PVDF 膜干燥避光保存。I 型鴨肝炎株 H 可溶性 3D 蛋白的純化：將含重組質(zhì)粒 pET-32(a)+/DHAV-H-3D 的BL21(DE3)PLYS 在最適條件下表達，然后收集菌體，用 20 mmol/L Tris-HCl（8.0）懸浮后在冰浴條件下超聲破碎 6 次，30sec/次，每次之間間隔 30sec，然后將破碎后的

26、菌液在 4、712000r/min 條件下離心 10min，收集上清（為可溶性表達蛋白）；然后將收集的上清在 Bio-rad公司提供的 Ni2+-NTA 瓊脂糖凝純化（純化液及純化方法按試劑盒進行），將收集的純化蛋白液進行透析后用 0.45m 的濾膜超濾，最后置于 4、-20、-70或凍干保存。將純化后的可溶性 3D 蛋白進行 SDS電泳，結(jié)果如圖 4 中 B 所示。結(jié)果顯示表達的 3D 蛋白經(jīng) Ni2+-NTA 親和純化后，得到了純度、濃度均較高的蛋白，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定蛋白濃度為 1.5 mg/mL。實施例 4、可溶性 3D 蛋白對 I 型鴨肝炎將鴨分為 3D 蛋白組（P 組）、3D 蛋

27、白+免疫鴨的細胞免疫增加作用組（P+V 組）、組（V 組）及對照組（C組），然后按照表 5 的免疫劑量和途徑進行免疫和注射。表 5、動物分組及免疫組別動物數(shù)量免疫時間免疫途徑及劑量3D 蛋白組（P）101 日齡皮下，0.1 mg 蛋白3D 蛋白+鴨肝炎組（P+V）101 日齡皮下，0.05 mg 蛋白+1 羽份弱毒劑量鴨肝炎組（V）101 日齡肌肉注射,1 羽份對照組（C）101 日齡皮下，生理鹽水免疫后 7 天采血，測定 CD8+ T 細胞亞群和免疫細胞因子，檢測方法按照試劑盒進行，結(jié)果如表 6 所示。表6、CD8+ T 細胞亞群及細胞因子檢測結(jié)果檢 測對象組別PP+VVCCD8+ IL-2

28、 IL-4IFN-r0.2810.0300.2990.0280.2790.0100.2070.0320.2880.0290.3110.0280.2420.0210.2010.0180.2780.0270.2550.0230.2220.0190.1980.0250.2520.0340.2410.0930.200.1090.1570.032結(jié)果顯示，免疫后 7 天各實驗組的細胞因子水平均有所上升。由于細胞因子是由多種細胞所的小分子多肽，具有調(diào)節(jié)細胞生長分化、免疫功能，參與炎癥發(fā)生和愈合等作用。根據(jù)免疫應(yīng)答類型可將細胞因子分為Th1 型和Th2 型。Thl型有 IL-2、IFN-、腫瘤壞死因子（TN

29、F）和淋巴毒素（LT），主要由細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)過程產(chǎn)生。Th2 細胞因子由 B 細胞的激活過程產(chǎn)生，包括 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-l3。IL-2、IL-4 和 IFN- 均是重要的免疫指標。在免疫應(yīng)答過程中，IL-2 是細胞免疫的初始8因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生 干擾素，IFN- 又稱免疫干擾素，是 T 細胞免疫的一個重要指標。IL-2 刺激 Thp 細胞向 Th0 細胞分化，Th0 細胞IL-2、IL-4、IL-5 和 IFN-，通常又以 IL-4 代表體液免疫水平，IFN- 代表細胞免疫水平，IL-4/IFN- 的比值可以反應(yīng)Th2/Th1 細胞的平衡狀態(tài)。IL-2、

30、IFN- 還是參與機體抗續(xù)存在和增殖，IFN- 能直接抑制免疫機制的重要細胞因子。IL-2 能維持免疫細胞的持。CD8+ T 淋巴細胞數(shù)量也是體現(xiàn)反應(yīng)免疫水平的指標，CD4+和 CD8+兩種細胞的含量也能反應(yīng)抗原遞呈的先后順序，反應(yīng)免疫激發(fā)的機制。故本實施例對 CD8+ T 淋巴細胞數(shù)量，IL-2、IL-4 和 IFN- 等細胞因子進蛋白對雛鴨免疫增強作用的基本數(shù)據(jù)。定，以獲取 3D上述結(jié)果可以看出，CD8+的水平呈現(xiàn)出與細胞因子相似的變化趨勢，表明在免疫后，機體的細胞免疫得到了激發(fā)。這幾個因子的水平升高與 ELISA 抗體水平升高是相符的。P 組IFN- 的水平較其余三組高，表明3D 蛋白能

31、刺激機體產(chǎn)生較強的細胞免疫。對比P+V 組和V組，從IL-2、IL-4 的水平推測整體的免疫水平上看，3D 蛋白能增強的免疫能力，而IL-4上升的幅度不大，暗示 3D 刺激機體產(chǎn)生細胞免疫強于體液免疫。綜上，激雛鴨增強細胞免疫及體液免疫，而且細胞免疫強于體液免疫。的 3D 蛋白能刺實施例 5、可溶性 3D 蛋白對 I 型鴨肝炎免疫鴨的體液免疫增加作用將動物分為 3D 蛋白組（P 組）、3D 蛋白+組（P+V 組）、組（V 組）及對照組（C 組），按照表 7 的免疫劑量和途徑進行免疫和注射。表 7、動物分組及免疫組別動物數(shù)量免疫時間免疫途徑及劑量3D 蛋白組（P）101 日齡皮下，0.1 mg 蛋白3D 蛋白+鴨肝炎組（P+V）101 日齡皮下，0.05 mg 蛋白+1 羽份弱毒劑量鴨肝炎組（V