蛋白酶活力的測定課件

1、蛋白酶活力的測定蛋白酶活力的測定概 述蛋白酶定義 水解蛋白質肽鏈酶類的總稱，適宜PH和溫度下水解蛋白為肽段和氨基酸。 蛋白酶分類 堿性蛋白酶、中性蛋白酶、 酸性蛋白酶（內(nèi)肽酶） 概 述蛋白酶定義蛋白酶分類作用位點已知抑制物氨基肽酶金屬蛋白酶帶有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、D或Q組成的肽鍵2，2，雙吡啶，11()-菲咯啉菠蘿蛋白酶巰基蛋白酶無特異性2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化羧肽酶A鋅金屬蛋白酶帶有自由氨基酸的L氨基酸羧基端；不能分解R、P或羥脯氨酸EDTA，EGTA羧肽酶B鋅金屬蛋白酶K，R羧基端EDTA，EGTA，堿性氨基酸羧肽酶Y絲氨酸羧肽酶氨基酸羧基端PM

2、SF組織蛋白酶C琉基蛋白酶氨基端雙肽，可通過K，R或P氨基端作為第二或第三個氨基酸封閉醋酸碘， 甲醛胰凝乳蛋白酶絲氨酸蛋白酶在F，T或Y之后抑肽酶，PMSF，TPCK，巨球蛋白膠原酶金屬蛋白酶在P-X-G-P肽鏈中X之后EDTA，EGTA，還原劑，但無血清存在dispase金屬蛋白酶無特異性EDTA，EGTA，Hg2+，重金屬內(nèi)肽酶Arg-C絲氨酸蛋白酶在R之后巨球蛋白，TLCK內(nèi)肽酶Asp-N金屬蛋白酶在D和半胱氨酸之前EDTA，菲咯啉內(nèi)肽酶Glu-C絲氨酸蛋白酶在E或D之后巨球蛋白，TLCK內(nèi)肽酶Lys-C絲氨酸蛋白酶在K之后TLCK，抑肽酶，抑蛋白酶醛肽腸激酶絲氨酸蛋白酶在D-D-D-D

3、-K-肽鏈中K之后Xa因子絲氨酸蛋白酶在R之后PMSF，APMSF，大豆胰蛋白酶抑制物無花果蛋白酶琉基蛋白酶無特異性TPCK，TLCK，-巨球蛋白激肽釋放酶絲氨酸蛋白酶在一些R之后抑肽酶，抑蛋白酶醛肽木瓜蛋白酶巰基蛋白酶長期孵育時具有廣泛特異性TPCK，TLCK，抑蛋白酶醛肽巨球蛋白，烷化劑胃蛋白酶酸蛋白酶廣泛特異性胃蛋白酶抑制素纖溶酶絲氨酸蛋白酶在K或R之后PMSF，TLCK，抑肽酶，巨球蛋白鏈霉蛋白酶混合型無特異性BM完整藥片蛋白酶K絲氨酸蛋白酶廣泛特異性PMSF，PefablocSc枯草桿菌蛋白酶絲氨酸蛋白酶無特異性PMSF，巨球蛋白，苯甲脒熱溶素鋅金屬蛋白酶在非極性殘基之前EDTA凝血

4、酶絲氨酸蛋白酶在K之后TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽抑肽酶，巨球蛋白，苯甲脒胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽抑肽酶，巨球蛋白蛋白酶分類作用位點已知抑制物氨基肽酶金屬蛋白酶帶有自由氨基的應用發(fā)酵：發(fā)酵酒精時，蛋白水解充分。皮革脫毛和軟化絲綢脫膠醫(yī)藥生產(chǎn)應用發(fā)酵：發(fā)酵酒精時，蛋白水解充分。要求掌握測定蛋白酶活力的原理理解制備標準曲線的目的和意義學習制備標準曲線的基本操作要求掌握測定蛋白酶活力的原理一、原 理酪蛋白 酪氨酸 鉬藍和鎢藍（藍色） 蛋白酶 Folin PH=10，40 OH-680nmOD酶活力單位：1mL液體或1g固體酶粉在一定溫度、PH下，每分鐘水解

5、酪蛋白產(chǎn)生1ug酪氨酸，為一個酶活力單位。福林試劑（Folin）：鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰）金黃色溶液一、原 理酪蛋白 酪氨酸二、儀器與試劑1、儀器電子天平、紫外分光光度計、電熱恒溫水浴鍋2、試劑（1）福林試劑 貯存液和使用液 （2）2%酪蛋白溶液 （3）pH7.2磷酸緩沖溶液 （4）100ug/mL標準酪氨酸溶液 （5）0.4mol/L碳酸鈉溶液 （6）0.4mol/L三氯乙酸溶液（7）c（1/2 Na2CO3）=0.8mol/L Na2CO3溶液（8）c（Hcl）=1mol/mL Hcl 溶液二、儀器與試劑1、儀器三、測定方法1、標準曲線的繪制 取6支10mL具塞比色管，編號，按下表將酪氨酸

6、溶液稀釋，配制酪氨酸系列標準溶液：10 8 6 4 2 0 0 20 40 60 80 1000246810123456蒸餾水( ml ) 稀釋后的酪氨酸標準溶液濃度（ug/ml）酪氨酸溶液（100g /mL） mL試管編號于上述各管中各吸取1mL于10mL比色管中，分別加入5mL0.4mol/mL碳酸鈉溶液、1mL Folin試劑使用液。搖勻，40毒水浴顯色20min后，680mn測定吸光度。以吸光度值和酪氨酸濃度繪制標準曲線。三、測定方法1、標準曲線的繪制10 001蒸餾水 以光密度OD為縱坐標，酪氨酸含量（g） 為橫坐標，繪制標準曲線。酪氨酸標準曲線y = 0.0011xR2 = 0.9

7、99900.10.20.30.40.50.60.70100200300400500600700酪氨酸含量ug光密度 以光密度OD為縱坐標，酪氨酸含量（g）酪氨酸標2、待測酶液的制備（稱取、溶解、稀釋） 稱取0.1g酶粉，用pH7.2磷酸緩沖溶液溶解并定容至100mL，吸取5mL，再用pH7.2磷酸緩沖溶液稀釋定容至250mL，即稀釋500倍待測。2、待測酶液的制備（稱取、溶解、稀釋） 稱取0.1g酶粉3、樣品測定第一步操作步驟加預熱酶液/ mL加預熱2%酪蛋白溶液/ mL保溫顯色/min加0.4mol/mL三氯乙酸溶液/mL保溫/min操作步驟加預熱酶液/ mL加0.4mol/mL三氯乙酸溶液

8、/ mL保溫顯色/min加預熱2%酪蛋白溶液/mL 樣品管號 1 2 3 空白管號 1 2 31.0102.00201.002.00101.003、樣品測定第一步操作步驟操作步驟 樣品管號 空第二步 操作步驟加對應的離心上清液/ mLc（1/2 Na2CO3）=0.8mol/L Na2CO3溶液/ mL加Folin試劑使用液/ mL保溫顯色/min吸光度值平均吸光度值 樣品管號 1 2 3 空白管號 1 2 31.05.001.00201.05.001.0020以空白為對照，680mn測定吸光度值，求平均值。第二步 操作步驟 樣品管號 空白管號1.01.0從標準曲線上找到酪氨酸的質量A，ug；

9、酪氨酸質量，ugODy = k x測得的OD值A=？從標準曲線上找到酪氨酸的質量A，ug；酪氨酸質量，ugODy四、計算樣品蛋白酶活力單位(以干基計)= 4 n A 10 1（1-w）式中A標準曲線上查的酪氨酸質量，ug；44mL反應液取出1mL測定；N酶液稀釋倍數(shù)；W樣品中水分，%。四、計算樣品蛋白酶活力單位(以干基計)= 注意 嚴格按順序加入試劑。 先加NaCO3，再加Follin試劑，后者只有 在堿性條件下才能被還原成蘭色物質。 說明：酪蛋白在低溫下有少量降解為酪氨酸， 此操作是與測定樣品的條件保持一致， 消除系統(tǒng)誤差。 注意：濾紙不能潤濕。注意 嚴格按順序加入試劑。 說明：酪蛋白在低溫下有少量降解校正： 用紫外分光光度計，以蒸餾水作對照，在680nm處測定光密度。用1-6號管的光密度值減去0號管的光密度值。校正：endend【實驗結果】【實驗結果】一、原理一、酶活力的定義 酶活力是指酶催化某些化學反應的能力二、酶活力和酶促反應速度的關系 酶活力的大小可以用在一定條件下它 所催化的某一化學反應