色譜分析法研究生課件

1、色譜分析法研究生色譜分析法研究生 毛細(xì)管氣相色譜法使用的色譜柱是空心的毛細(xì)管柱，叫開管柱：固定液涂漬或固定化在柱管內(nèi)壁上，而載氣和其中的樣品從中心的通道上通過。柱材料主要是熔融石英（FSOT）。一、高分辨氣相色譜法2022/9/92 毛細(xì)管氣相色譜法使用的色譜柱是空心的（一）色譜柱1毛細(xì)管柱的類型： 柱類型 柱內(nèi)徑 柱長 液膜厚度普通開管柱 0.20.53mm 560m 0.11.0m 壁涂開管柱 多孔層開管柱 擔(dān)體涂漬開管柱 微內(nèi)徑開管柱 100m大內(nèi)徑開管柱 0.32mm 1m或5m2022/9/93（一）色譜柱1毛細(xì)管柱的類型： 柱類型2毛細(xì)管柱的選擇常用的固定液有：SE-31、OV-1

2、、SE-54、SE-52、OV-1701、Carbowax 20M。柱的選擇：根據(jù)樣品組分的沸點(diǎn)，一般地，相差2或2以上的組分，采用非極性毛細(xì)管柱分離；若沸點(diǎn)相差在2以內(nèi)的組分，則需在極性較大的毛細(xì)管柱上分離。 2022/9/942毛細(xì)管柱的選擇常用的固定液有：SE-31、OV-1、S3毛細(xì)管柱的性能評價(jià)評價(jià)指標(biāo)：分離效率、表面惰性、熱穩(wěn)定性。評價(jià)方法：在一定的色譜條件下，分離各種測試物質(zhì)，獲得的特征性數(shù)據(jù)和峰對稱性，以此來評價(jià)柱效和表面活性。在測定了柱效和表面活性之后，用流失速率試驗(yàn)來評價(jià)熱穩(wěn)定性。2022/9/953毛細(xì)管柱的性能評價(jià)評價(jià)指標(biāo)：分離效率、表面惰性、熱穩(wěn)定（二）進(jìn)樣方式 分流

3、進(jìn)樣：使用方便，對分流比、進(jìn)樣溫度 樣品和載氣的情況、進(jìn)樣體積和 濃度、進(jìn)樣重復(fù)性需要注意。 不適于痕量分析和寬沸程樣。 適合大多數(shù)類型的樣品，樣品濃 濃高、各組分的濃度相近2022/9/96（二）進(jìn)樣方式 分流進(jìn)樣：使用方便，對分流比、進(jìn)樣溫度溶液直接進(jìn)樣 進(jìn)樣口溫度應(yīng)高于柱溫3050；采用微量注射器、微量進(jìn)樣閥或有分流裝置的氣化室進(jìn)樣，進(jìn)樣量一般不超過數(shù)微升，色譜柱越細(xì)，進(jìn)樣量應(yīng)越少，毛細(xì)管氣相色譜法中，一般應(yīng)分流以免過載。頂空進(jìn)樣 適用于固體和液體供試品中揮發(fā)性組分的分離和測定。供試液在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發(fā)性組分在非氣態(tài)和氣態(tài)達(dá)到平衡后，由進(jìn)樣器自動吸取一定體積的頂空氣注

4、入色譜柱中。2022/9/97溶液直接進(jìn)樣 進(jìn)樣口溫度應(yīng)高于柱溫3050；采用微量注射不分流進(jìn)樣：須利用溶劑效應(yīng)或冷阱，操作較難 特別適用于痕量分析和寬沸程樣品柱頭進(jìn)樣：必須使用外徑為0. 17 0.23mm的 細(xì)針，柱內(nèi)徑必須大于0.32 mm , 不能通過隔墊進(jìn)樣，緩慢進(jìn)樣 對熱不穩(wěn)定、稀的和寬沸程樣品較 理想；能給出定量結(jié)果 非揮發(fā)物在柱的中積累導(dǎo)致柱變性 和柱效損失 2022/9/98不分流進(jìn)樣：須利用溶劑效應(yīng)或冷阱，操作較難 直接進(jìn)樣：樣品無須事先濃縮，進(jìn)樣器溫度可較 低，載氣消耗量小，分析所需樣量小 適用于濃度范圍要比不分流進(jìn)樣寬一個(gè) 數(shù)量級以上的樣品，有利于對熱不穩(wěn)定 的樣品；當(dāng)

5、樣品中含有揮發(fā)性低的組分 時(shí)，難于定量分析2022/9/99 直接進(jìn)樣：樣品無須事先濃縮，進(jìn)樣器溫度可較2022/9/3 （三）應(yīng)用示例-人尿中勞拉西泮的檢測1.測定意義：勞拉西泮(簡稱LRZ)上用為催眠、鎮(zhèn)靜和抗癲癇藥物 ,常被犯罪分子作為麻醉藥物用于麻醉搶劫等麻醉后犯罪。為了確證這類案件的性質(zhì) ,經(jīng)常需要對受害人的血、尿等體液中麻醉藥物或其代謝物進(jìn)行檢測。人體攝入該藥后其血液中藥物濃度較低 ,且犯罪分子所用藥量一般不使受害人死亡,而且此類案件一般報(bào)案較遲，因此血中藥物濃度較低 ,對其檢測較為困難。該藥主要以葡萄糖醛酸苷的形式由尿液排泄。 2022/9/9102022/9/312 2.色譜條

6、件：HP-5毛細(xì)管柱(300.32mm ,膜厚0.1)。氮磷檢測器,不分流進(jìn)樣(閥關(guān)閉時(shí)間0.75min),進(jìn)樣口溫度:280,柱溫:200(1min)20/min280 (15min),載氣為高純氮(2.2ml/min),尾吹氣為高純氮(10ml/min)。2022/9/911 2.色譜條件：HP-5毛細(xì)管柱(300.32mm3.樣品預(yù)處理-酶解及萃取 取檢尿1ml,加10mg/L的羥乙基氟西泮(HEF)標(biāo)準(zhǔn)工作液10l,再加pH4.8的乙酸鹽緩沖液 50l及-葡萄糖醛酸苷酶溶液0.1l,置于55水浴中水解4冷至室溫后加 pH10.8的碳酸鹽緩沖液0.5ml及乙醚5ml,渦旋2min,離心,

7、分取上層有機(jī)相4ml置于經(jīng)硅烷化處理的帶尾管的雞心瓶中,加甲醇0.4ml,于40水浴中揮發(fā)至約0.1ml,進(jìn)樣1l進(jìn)行GC分析2022/9/9123.樣品預(yù)處理-酶解及萃取 取檢尿1ml,加1 4.方法學(xué)評價(jià)（1)選擇性: 空白尿1ml及空白尿1ml加LRZ和HEF標(biāo)準(zhǔn)液,經(jīng)酶解、萃取后進(jìn)樣分析所得色譜圖表明尿中雜質(zhì)不干擾檢測.（2)線性試驗(yàn): 用空白尿配制不同濃度的LRZ標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行酶解、萃取、進(jìn)樣分析,將LRZ與HEF色譜峰面積的比值與LRZ在尿液中的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,得到工作曲線方程 :Y=3.110-3X 3.010 -3 , =0.998。LRZ在尿中的濃度為50500g/L范圍內(nèi)

8、呈良好的線性.2022/9/913 4.方法學(xué)評價(jià)（1)選擇性: 空白尿1ml及空白尿1（3)萃取液的選擇及萃取率:作者進(jìn)行了多種溶劑萃取 LRZ的研究 ,由經(jīng)萃取與未經(jīng)萃取所得色譜峰面積 比計(jì)算LRZ的萃取率 ,得(meanSD)為(83.43.1)%。（4）檢出限:以3倍信噪比計(jì)算檢出限 ,得本法的檢出 限為5g/L。（5)回收率:由工作曲線計(jì)算LRZ的質(zhì)量濃度及其回收 率 ,得(meanSD)為(103.35.1)%。2022/9/914（3)萃取液的選擇及萃取率:作者進(jìn)行了多種溶劑萃取2022/5.尿液檢測:志愿者口服LRZ 2后,于32小時(shí)內(nèi)收集其排泄的尿液進(jìn)行檢測 ,LRZ于9h達(dá)

9、尿中最高濃度為444/L,檢測結(jié)果表明 ,本方法適合于麻醉后犯罪案件中的檢測要求。返 回2022/9/9155.尿液檢測:志愿者口服LRZ 2后,于32小時(shí)內(nèi)收集建立和發(fā)展快速而靈敏的分離和測定對映體藥物方法的重要性和必要性 對某些手性藥物進(jìn)行對映體的純度檢查； 生物體液中藥物對映體的分離分析研究可探索血藥濃度與臨床療效的關(guān)系； 評價(jià)單個(gè)對映體的效價(jià)、毒性、不良反應(yīng)以及藥動學(xué)性質(zhì)； 必要時(shí)，可進(jìn)行手性藥物對映體的制備分離。二、手性藥物的高效液相色譜法2022/9/916建立和發(fā)展快速而靈敏的分離和測定對映體藥物方法的重要性和必要（一）手性藥物拆分機(jī)理 為了使對映體轉(zhuǎn)化為化學(xué)和物理性質(zhì)不同的非對

10、映體，就要提供一種手性源，使待拆分的對映異構(gòu)體（樣品）、手性作用物（如固定相）和手性源之間形成一個(gè)非對映異構(gòu)分子的絡(luò)合物。在對映體拆分理論中頗為流行的是“三點(diǎn)手性識別模式”。2022/9/917（一）手性藥物拆分機(jī)理 為了使對映體轉(zhuǎn)化為化2022/9/9182022/9/320（二）手性HPLC拆分法的類型直接法：柱前手性衍生化法間接法：手性流動相拆分法、手性固定相拆分法1柱前手性衍生化法：對映體混合物以手性試劑作柱前衍生化，形成非對映體，然后以常規(guī)（偶見手性）固定相分離。對手性衍生化試劑的要求：高光學(xué)純度。常用的手性衍生化試劑：羧酸衍生物類、胺類、異硫氰酸酯類、異氰酸酯類、萘衍生物類、光學(xué)活

11、性氨基酸類、固相衍生化試劑。2022/9/919（二）手性HPLC拆分法的類型直接法：柱前手性衍生化法間2手性流動相拆分法（手性洗脫法或手性流動相添加劑法）：將手性試劑加入流動相中，手性添加劑與樣品形成手性絡(luò)合物。常用的手性添加劑：配基交換型手性添加劑、環(huán)糊精類添加劑、手性離子對絡(luò)合劑2022/9/9202手性流動相拆分法（手性洗脫法或手性流動相添加劑法）：將3手性固定相拆分法：將手性選擇器（如手性流動相添加劑）固著于多種基質(zhì)上而制成手性固定相。迄今為止，尚沒有一種通用型的手性柱，需要根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)來選擇合適的手性柱。常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白質(zhì)類手性固定相、環(huán)糊精

12、類手性固定相。2022/9/9213手性固定相拆分法：將手性選擇器（如手性流動相添加劑）固著（三）應(yīng)用1對某些手性藥物進(jìn)行對映體的純度檢查；2生物體液中藥物對映體的分離分析研究可探 索血藥濃度與臨床療效的關(guān)系；3在研制手性藥物過程中，可分別評價(jià)單個(gè)對 映體的效價(jià)、毒性、不良反應(yīng)、藥動學(xué)性質(zhì)；4必要時(shí)，可進(jìn)行手性藥物對映體的制備分離 （或拆分）。2022/9/922（三）應(yīng)用1對某些手性藥物進(jìn)行對映體的純度檢查；2生 示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的檢查（柱前手性衍生化法）手性衍生化試劑：乙酰葡萄糖異硫氰酸酯色譜條件：色譜柱 NOVA-Pack C18（150mm3.9mm） 流動相 甲醇-0.01

13、mol/L磷酸二氫鉀 （pH2.8）（5149） 該法所用的手性衍生化試劑可以與一級胺、二級胺在溫和的條件下迅速反應(yīng)，所生成的非對映體衍生物可以在普通色譜系統(tǒng)中進(jìn)行分離分析。2022/9/923 示例一、左旋吡喹酮中吡喹胺的檢查（柱前手性衍生化法）示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流動相拆分法）色譜條件：色譜柱 Zorbax ODS（250mm4.6mm），流動相 含有0.15%L-苯丙氨酸及0.11%硫酸銅（CuSO45H2O）水溶液（以0.05mol/L硫酸調(diào)pH至3.0）-甲醇（91）（流動相中L-苯丙氨酸及硫酸銅濃度分別為0.008mol/L和0.004mol/L）。 流動相中L-苯丙氨

14、酸為配基交換型手性添加劑，硫酸銅為二價(jià)金屬螯離子，L-苯丙氨酸與銅離子螯合，分布于流動相中，遇到色氨酸對映體，共同形成配位絡(luò)合物對，然后在反相柱上拆分。2022/9/924示例二、DL-色氨酸的拆分（手性流動相拆分法）色譜條件：示例三、克侖特羅對映體的拆分（手性固定相拆分法）色譜條件：色譜柱 Chirex 3005手性色譜柱 （R）-1-萘基甘氨酸和3，5-二硝基 苯甲酸以共價(jià)鍵結(jié)合流動相 正己烷-二氯乙烷-甲醇該法的拆分機(jī)理為“三點(diǎn)手性識別模式”。返 回2022/9/925示例三、克侖特羅對映體的拆分（手性固定相拆分法）色譜條件 三、毛細(xì)管電泳分析法 （一）簡介 1高效 2高速 3微量 4低

15、消耗 （二）主要分離模式 1毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE ） 在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場作用下，以不同速度向其所帶電荷相反方向遷移，產(chǎn)生泳流。 2022/9/926 三、毛細(xì)管電泳分析法2022/9/3282膠束電動毛細(xì)管色譜（micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC）或MEKC） 在緩沖液中加入離子型表面活性劑，形成膠束。被分離物質(zhì)在水和膠束兩相分配，各溶質(zhì)在因分配系數(shù)存在差別而被分離。3. 毛細(xì)管凝膠電泳（capollary gel electrophoresis,

16、 CGE）毛細(xì)管中裝入單體和引發(fā)劑引發(fā)聚合反應(yīng)生成凝膠作支持物進(jìn)行的電泳。2022/9/9272膠束電動毛細(xì)管色譜（micellar electroki4. 毛細(xì)管等速電泳（capillary isotachor-phoresis, CITP）采用前導(dǎo)電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)，在毛細(xì)管中充入前導(dǎo)電解質(zhì)后，進(jìn)樣，電極槽中換用尾隨電解質(zhì)進(jìn)行電泳分析，帶不同電荷的組分遷移至各個(gè)狹窄的區(qū)帶，然后依次通過檢測器。5. 毛細(xì)管電色譜（capillary electrochromatography, CEC）將細(xì)粒徑固定相填充到毛細(xì)管中或在毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆固定相以電滲流驅(qū)動操作緩沖液進(jìn)行分離。2022/9/9284

17、. 毛細(xì)管等速電泳（capillary isotachor6. 毛細(xì)管等電聚焦電泳（capillary isoelectric focusing, CIEF）將毛細(xì)管內(nèi)壁涂覆聚合物減少電滲流，再將供試品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣，兩個(gè)電極槽中分別加入酸液和堿液，施加壓力后毛細(xì)管中操作電解質(zhì)溶液逐步形成pH梯度，各溶質(zhì)在毛細(xì)管中遷移至各自的等電點(diǎn)時(shí)變?yōu)橹行孕纬删劢沟膮^(qū)帶，而后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值得方法使溶質(zhì)通過檢測器。2022/9/9296. 毛細(xì)管等電聚焦電泳（capillary isoelec第二節(jié) 藥物現(xiàn)代光譜法及其應(yīng)用一、近紅外分光光度法（一）方法特點(diǎn) 1可獲得一系列的物理

18、性質(zhì)的信息 2樣品無需預(yù)處理 3分析速度快 3毛細(xì)管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis，CGE ） 4毛細(xì)管等電聚焦（capillary isoelectric focusing，CIEF）（三）HPCE 在藥物分析中的應(yīng)用2022/9/930第二節(jié) 藥物現(xiàn)代光譜法及其應(yīng)用 3毛細(xì) 4靈敏度高 5運(yùn)用范圍廣 6便于在線分析和控制（二）常見的NIR吸收波長及其結(jié)構(gòu)歸屬（三）應(yīng)用 1鑒別 2純度檢查 3含量測定二、核磁共振光譜分析法（一）簡述（二）定量分析方法2022/9/931 4靈敏度高2022/9/333 1方法特點(diǎn) 2測定方法（三）應(yīng)用示列 1鹽酸普魯卡因

19、的結(jié)構(gòu)堅(jiān)鑒定 2植物中藥及其偽品的區(qū)別 3亞硝酸戊酯（amyl nitrite）及其吸入劑（amyl nitriteinhalant）的含量測定（USP24） 三、x 射線粉末衍射法（一）x 射線簡介（二）布拉格方程（三）x 射線衍射儀的工作原理（四）應(yīng)用2022/9/932 1方法特點(diǎn)2022/9/334第三節(jié) 色譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用一、氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用技術(shù)（一）簡介（二）GC-FTIR 系統(tǒng)組成與光譜檢索（三）應(yīng)用示列二、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（一）簡述（二）色譜柱（三）接口2022/9/933第三節(jié) 色譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用2022/9/335（四）定量分析方法 1總離子流色譜法 2質(zhì)量

20、碎片圖質(zhì)譜法（五）應(yīng)用示列 1固相萃取結(jié)合GC-MS 系統(tǒng)分離生 物體液中常見毒物藥物 2GC-MS測定冰片的川芎嗪血藥濃度三、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（一）概述2022/9/934（四）定量分析方法2022/9/336（二）接口裝置 1粒子束（partical beam ）接口 2熱噴霧（TSP ）接口 3大氣壓離子化（API）接口 4動態(tài)快原子轟擊法（FAB ）（三）應(yīng)用示列 1區(qū)安奈德中特殊雜質(zhì)的檢查 2血樣和尿樣中秋水仙堿的 LC-ISP-MS 定性定量分析2022/9/935（二）接口裝置2022/9/337四、液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)（一）方法特點(diǎn)（二）基本操作模式 1連續(xù)流動（on-flow ）操作模式 2停流（stop flow）操作模式 3峰存貯藏操作模式（三）應(yīng)用示列2022/9/936四、液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)2022/9/338三、核磁共振光譜分析法 核磁共振光譜廣泛用于化合物的結(jié)構(gòu)分析，而其在化合物的定