脂質(zhì)體流感疫苗制備及體液免疫應(yīng)答

1、脂質(zhì)體流感疫苗制備及體液免疫應(yīng)答【摘要】目的：制備脂質(zhì)體流感疫苗并對其體液免疫效果和保護(hù)效率進(jìn)展研究。方法：采用薄膜法與冷凍枯燥法相結(jié)合的方法制得多層脂質(zhì)體；用制得的脂質(zhì)體流感疫苗和普通疫苗分別免疫小鼠，用血凝抑制實(shí)驗(yàn)hi和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa對免后213周的小鼠血清的抗體程度進(jìn)展檢測，hi檢測其特異性抗體，elisa檢測igg抗體程度并對小鼠的保護(hù)效率進(jìn)展檢測。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)中，脂質(zhì)體流感疫苗在2g/use組和4g/use兩個(gè)劑量組中，不同免疫時(shí)間內(nèi)其hi值可分別較非脂質(zhì)體疫苗組高出23和4倍，產(chǎn)生抗體的程度經(jīng)elisa實(shí)驗(yàn)得出較非脂質(zhì)體疫苗組高出1倍左右，故可激發(fā)更高的體液免疫；保護(hù)效力

2、為4/6。結(jié)論：脂質(zhì)體流感疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生更高的體液免疫和更高的保護(hù)效力?！娟P(guān)鍵詞】流感疫苗脂質(zhì)體體液免疫血凝抑制試驗(yàn)llegeflifesiene,hanghununiversityfsieneandtehnlgy,hanghun130022,hina;llegeflifesiene,jilinuniversity,hanghun130021,hina;hanghuninstitutefbilgialprduts,hanghun130062,hinakeyrdsinfluenzavaine；lipse；huraliunizatin；hitest1材料與方法1.1流感病毒和抗原a/alif

3、rnia/7/2022(h3n2)毒株及抗原由長春生物制品研究所疫苗六室提供。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡干凈級雌性balb/小鼠，體重1820g，由長春生物制品研究所動(dòng)物室提供。1.4脂質(zhì)體流感疫苗的制備采用薄膜法與冷凍枯燥法相結(jié)合的方法制得多層脂質(zhì)體，步驟如下：氫化大豆卵磷脂p德固賽公司，德國和膽固醇siga，美混合溶于氯仿，40真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜5。加水，劇烈震蕩，水浴超聲約1小時(shí)致淡云霧狀，按比例與流感裂解疫苗混合，凍干。1.5脂質(zhì)體流感疫苗的性質(zhì)研究1.5.1脂質(zhì)體的形態(tài)學(xué)觀察分別用高倍顯微鏡100物鏡及電鏡對制得的脂質(zhì)體進(jìn)展形態(tài)學(xué)觀察。1.5.2脂質(zhì)體的粒徑分析室溫下用zetasizer3

4、000hs激光衍射粒度分析儀對制得的脂質(zhì)體粒徑進(jìn)展分析，測定其粒徑分布和平均粒徑。1.5.3脂質(zhì)體包封率的測定采用lry法，測定上清中的蛋白質(zhì)含量。1.6脂質(zhì)體流感疫苗的體液免疫效果評價(jià)1.6.1balb/小鼠的免疫小鼠分為5組，每組5只，用2g抗原/只和4g抗原/只的劑量分別對其進(jìn)展免疫，設(shè)脂質(zhì)體流感疫苗組，流感抗原組并設(shè)對照組。1.7脂質(zhì)體流感疫苗的保護(hù)效果評價(jià)8由于流感病毒感染幾乎不會造成動(dòng)物個(gè)體的死亡，其疫苗的保護(hù)效率只能通過疫苗對感染小鼠的肺部的保護(hù)率來表達(dá)。用0.02l流感病毒雞胚尿囊液10-8.0eid50對免后12周的小鼠進(jìn)展鼻腔攻擊。6天后，處死小鼠，無菌取肺，觀察其病灶的多

5、少，沒有肺部病灶的小鼠認(rèn)為受到保護(hù)，用dk細(xì)胞檢測小鼠肺部的流感病毒滴度肺部病毒滴度定義為可以引起pe的肺內(nèi)容物的最大稀釋倍數(shù)。2結(jié)果2.1脂質(zhì)體流感疫苗的性質(zhì)2.1.1形態(tài)觀察為了驗(yàn)證制得的脂質(zhì)體的根本形態(tài)和其直徑的大致范圍，由高倍顯微鏡及透射電鏡觀察可見，該方法制備的脂質(zhì)體呈圓形或橢圓形，粒徑分布較均勻，直徑大約在微米級，證明了制得的脂質(zhì)體的完好性，其粒徑符合粒徑測定要求，見圖1和圖2。2.1.2粒徑測定結(jié)果為了更準(zhǔn)確的測得脂質(zhì)體粒徑，室溫下用zetasizer3000hs激光衍射粒度分析儀對制得的脂質(zhì)體的粒徑進(jìn)展分析，測定其粒徑分布和平均粒徑?？梢?0%以上的脂質(zhì)體粒徑在3.8635.3

6、5之間，這個(gè)粒徑范圍說明了制得的脂質(zhì)體可大大增強(qiáng)其結(jié)合抗原的抗原性，見圖3。圖1脂質(zhì)體流感疫苗的電鏡照片略fig.1theeletrnirgraphsfinfluenzasplitviruslipse圖2脂質(zhì)體流感疫苗的100顯微鏡照片略fig.2the100irgraphfinfluenzasplitviruslipse圖3用alvernzetasizer3000hs激光粒度分析儀粒徑測定結(jié)果略fig.3thediaeterdistributinflipsesdeterinedbyalvernzetasizer3000hs2.1.3包封率測定為了測定脂質(zhì)體對流感抗原的包封率，采用lry法分別

7、測定脂質(zhì)體懸液的總蛋白量為155.75g及其除去脂質(zhì)體后上清液中蛋白量為13.35g，按公式計(jì)算得脂質(zhì)體包封率為91.1%，說明了制得的脂質(zhì)體對流感疫苗具有較高的包封效率。2.2脂質(zhì)體流感疫苗的免疫效果表1免后213周的小鼠hi結(jié)果略表2免后213周小鼠elisa結(jié)果略表3脂質(zhì)體流感疫苗對免后12周小鼠的保護(hù)效力tab.3prtetinagainsta/alifrnia/7/2022(h3n2)virusinfetininpreiunizedbalb/ie2.2.1hi測定特異性抗體結(jié)果為了檢測脂質(zhì)體流感疫苗的特異性免疫效果，采用hi測定免后一段時(shí)間的小鼠血清，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用spss11.5軟

8、件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析：nnlipsal、lipsal和對照組兩兩相比，組間有顯著性差異p0.01。2g/use組和4g/use兩個(gè)劑量組比照可以得出，4g/use組的脂質(zhì)體疫苗組的hi指數(shù)進(jìn)步的更多，為非脂質(zhì)體疫苗組的4倍左右，可見高劑量組免疫效果優(yōu)于低劑量組。隨著免疫時(shí)間的延長，hi指數(shù)逐漸升高，在46周到達(dá)峰值，兩個(gè)劑量組都顯示非脂質(zhì)體疫苗組hi值升高緩慢，峰值較低。而脂質(zhì)體疫苗組hi值迅速升高，峰值較高，見表1，該結(jié)果證明了脂質(zhì)體流感疫苗可產(chǎn)生較同等劑量的非脂質(zhì)體疫苗高得多的特異性抗體。2.2.2elisa測定igg結(jié)果為了進(jìn)一步檢測脂質(zhì)體流感疫苗刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生igg抗體程度，采用elisa

9、法對免后一定時(shí)間的小鼠血清進(jìn)展測定。該elisa試驗(yàn)所測的樣品均為10倍稀釋后的血清樣品。測定的結(jié)果應(yīng)用spss11.5軟件統(tǒng)計(jì)分析：nnlipsal、lipsal和對照組兩兩相比，組間有顯著性差異p0.01。2g/use組和4g/use兩個(gè)劑量組比照可以得出，4g/use組的脂質(zhì)體疫苗組的igg程度進(jìn)步的更多，為非脂質(zhì)體疫苗組的2倍左右，可見高劑量組免疫效果優(yōu)于低劑量組。隨著免疫時(shí)間的延長，igg程度逐漸升高，在46周到達(dá)峰值，兩個(gè)劑量組都顯示，非脂質(zhì)體疫苗組igg程度升高緩慢，峰值較低。而脂質(zhì)體疫苗組igg值迅速升高，峰值較高。試驗(yàn)結(jié)果證明，脂質(zhì)體流感疫苗組可刺激機(jī)體產(chǎn)生較非脂質(zhì)體流感疫苗

10、為高的igg抗體，見表2。2.3保護(hù)性試驗(yàn)為了獲得脂質(zhì)體流感疫苗對機(jī)體抵抗流感病毒更直接和可信的數(shù)據(jù)，進(jìn)展了保護(hù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，脂質(zhì)體流感疫苗組保護(hù)率最高，肺內(nèi)容物流感病毒滴度最低。說明了脂質(zhì)體流感疫苗對機(jī)體的保護(hù)效果要高于非脂質(zhì)體流感疫苗，見表3。3討論機(jī)體對外界細(xì)菌和病毒的抵抗主要存在兩個(gè)免疫途徑：一是體液免疫，二為細(xì)胞免疫。體液免疫主要是由b細(xì)胞介導(dǎo)的，免疫后導(dǎo)致機(jī)體合成抗ha、na等主要糖蛋白的抗體，血清抗體主要為3種免疫球蛋白：igg、ig和iga，與其他病毒感染一樣，最初應(yīng)答為ig，然后才是限制病毒再感染的iga和igg。體液免疫應(yīng)答最終效應(yīng)是將侵入機(jī)體的非己細(xì)胞或分子加以去除，

11、即排異效應(yīng)。但抗體本身只具有識別作用，并不具有殺傷或排異作用，因此體液免疫的最終效應(yīng)必須借助機(jī)體的其它免疫細(xì)胞或分子的協(xié)同作用才能到達(dá)排異的效果。主要有：抗體分子的中和作用；抗體分子的調(diào)理作用；補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用；抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。本試驗(yàn)采用脂質(zhì)體做佐劑包封流感疫苗，通過血凝抑制實(shí)驗(yàn)hi和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa對免后幾周的小鼠血清的抗體程度進(jìn)展檢測，hi檢測其特異性抗體，elisa檢測總抗體程度。在免后12周用活毒a3h3n2eid50=10-8.0對小鼠進(jìn)展攻擊，1周后檢測小鼠肺部病變，測得疫苗對小鼠機(jī)體的保護(hù)效率。hi及elisa實(shí)驗(yàn)說明，脂質(zhì)體流感疫苗較單純抗原具有明

12、顯的優(yōu)勢，一樣劑量下，脂質(zhì)體流感疫苗可激發(fā)更多的抗體；免疫后小鼠血清中的抗體頂峰期持續(xù)時(shí)間較長。疫苗的保護(hù)效率無佐劑疫苗為2/6，相應(yīng)脂質(zhì)體流感疫苗為4/6。實(shí)驗(yàn)過程中，我們認(rèn)為有幾個(gè)值得注意的方面：注射途徑的問題：注射途徑一般有肌肉注射、腹腔注射、皮內(nèi)注射、皮下注射和靜脈注射。我們分別采用以上途徑對小鼠進(jìn)展免疫，4周后采血測其hi，從而得出在本實(shí)驗(yàn)條件下各注射途徑產(chǎn)生的免疫效果由強(qiáng)到弱依次為：靜脈腹腔肌肉皮下皮內(nèi)。鑒于靜脈注射難度較大，故我們采用了免疫效果較強(qiáng)的腹腔免疫途徑。脂質(zhì)體粒徑大小的問題：脂質(zhì)體粒徑對脂質(zhì)體疫苗的免疫效果影響很大，理論上說，粒徑越大免疫效果越強(qiáng)，故作為佐劑一般制備lv型脂質(zhì)體。但粒徑過大給后段的除菌造成很大的困難。故脂質(zhì)體粒徑適中是脂質(zhì)體制備過程中的一個(gè)難題。我們發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)水化過程中的超聲時(shí)間是影響脂質(zhì)