高通量藥物篩選

1、高通量藥物篩選第1頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 高通量篩選最初是伴隨組合化學(xué)而產(chǎn)生的一種藥物篩選方式。 1990年末，組合化學(xué)的出現(xiàn)改變了人類(lèi)獲取新化合物的方式，人們可以通過(guò)較少的步驟、在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)合成大量化合物，在這樣的背景下高通量篩選的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。 高通量篩選技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量候選化合物完成篩選，經(jīng)過(guò)近十年的發(fā)展，已經(jīng)成為比較成熟的技術(shù)，不僅僅應(yīng)用于對(duì)組合化學(xué)庫(kù)的化合物篩選，還更多地應(yīng)用于對(duì)現(xiàn)有化合物庫(kù)的篩選。 目前世界各大藥物生產(chǎn)商都建立有自己的化合物庫(kù)和高通量篩選機(jī)構(gòu)，對(duì)有潛力形成藥物的化合物進(jìn)行篦梳式的篩選。第2頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日

2、，1點(diǎn)9分，星期五 我國(guó)藥物高通量篩選起步較晚，且不規(guī)范，僅有十多年的研究歷史。 1996年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)國(guó)內(nèi)第一臺(tái)Bionek2000型實(shí)驗(yàn)自動(dòng)化工作站； 1998年又引進(jìn)全國(guó)第一臺(tái)Topcount微量閃爍計(jì)數(shù)器，使放射配基實(shí)驗(yàn)、放射免疫實(shí)驗(yàn)等技術(shù)微量化、自動(dòng)化。 上海藥物研究所、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院分別成立了藥物篩選專(zhuān)門(mén)機(jī)構(gòu)，開(kāi)始從事大規(guī)模篩選工作。 西安交通大學(xué)藥學(xué)院賀浪沖教授首創(chuàng)的細(xì)胞膜色譜（CMC）為化合物的體外高通量篩選提供了高選擇性、高特異性、高效率的篩選手段。CMC已成功用于鈣離子拮抗劑受體配體結(jié)合反應(yīng)的研究，目前正在進(jìn)行心血管化學(xué)合成藥物的高通量篩選和中藥有效部位及有效成分

3、的尋找。今年將建立CMC自動(dòng)化篩選體系，促進(jìn)我國(guó)藥物高通量篩選技術(shù)的全面發(fā)展 。第3頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 一、 概念高通量篩選(High throughput screening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千萬(wàn)樣品檢測(cè)，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)支持整體運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系。第4頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五HTS是藥物快速、微量、靈敏、大規(guī)模篩選的新方法。采用分子、細(xì)胞水平的藥物篩選

4、模型，可從大量的樣品中鑒別出對(duì)確定的分子靶點(diǎn)有相互作用的微量活性化合物。每年能處理成千萬(wàn)個(gè)樣品，加速了先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)進(jìn)程。突破了傳統(tǒng)藥物篩選的模式，提高了新藥研發(fā)的效率。第5頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五高通量平行合成儀第6頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五液相芯片檢測(cè)儀第7頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五微孔過(guò)濾板第8頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五12通道藥物篩選儀第9頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五高通量平行合成儀第10頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五國(guó)家

5、新藥篩選中心第11頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五二高通量篩選的技術(shù)過(guò)程1、樣品庫(kù)2、初篩和復(fù)篩3、活性化合物4、深入篩選5、獲得少量先導(dǎo)化合物6、確證篩選藥物藥理學(xué)研究7、侯選藥物8、臨床前研究第12頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五1、HTS篩選的基本步驟第一步是選擇分子靶。選擇的依據(jù)是來(lái)源于國(guó)際醫(yī)學(xué)生物學(xué)的新成果。目前國(guó)際常用的分子靶有以下幾類(lèi)：A、細(xì)胞膜受體；B、離子通道蛋白；C、酶蛋白；D、細(xì)胞核受體；E、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。第二步是建立穩(wěn)定表達(dá)分子靶的生物體系。 靶是蛋白-克隆相對(duì)應(yīng)的蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)和提純； 靶是細(xì)胞受體-克隆出的基因轉(zhuǎn)化到載

6、體細(xì)胞中，建立穩(wěn)定的細(xì) 胞株。第13頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五第三步建立簡(jiǎn)便快速的大規(guī)模的生物檢測(cè)方法。 根據(jù)靶的不同分為兩類(lèi)： 1、以蛋白等分子為基礎(chǔ)； 2、以 細(xì)胞為基礎(chǔ) 酶蛋白-測(cè)定酶活性的變化； 細(xì)胞膜受體-測(cè)定配體-受體的結(jié)合； 細(xì)胞核受體-測(cè)定蛋白的表達(dá)。 在建立大規(guī)模生物檢測(cè)方法的同時(shí)，要用組合化合物的方法合成大量不同結(jié)構(gòu)的化合物庫(kù)相配套。第14頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五2、HTS藥物篩選靶點(diǎn)與檢測(cè)方法（1）、分子靶點(diǎn)篩選模型-細(xì)胞信號(hào)通路篩選系統(tǒng) 外界信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi)，或者直接穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，最終

7、影響某些基因的轉(zhuǎn)錄。在這個(gè)傳遞過(guò)程中，某些特殊的細(xì)胞或一些病理狀況下，可能是其中的一條或幾條通路起作用，藥物可以根據(jù)需要對(duì)這些通路進(jìn)行阻斷。 使用信號(hào)通路篩選系統(tǒng)，可直接對(duì)藥物作用的分子機(jī)制有所了解。第15頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五（2）、細(xì)胞膜表面受體篩選模型 a.G蛋白耦聯(lián)受體：受體與GTP結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白的耦聯(lián)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP，從而將外界信號(hào)跨膜傳遞到細(xì)胞內(nèi)。如趨化因子受體、-受體阻斷劑等。 b.催化受體：為單跨膜受體，分為胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。當(dāng)細(xì)胞因子與胞外區(qū)結(jié)合后，引起多個(gè)受體單體的聚合，每個(gè)聚合體的受體單體可以是同一類(lèi)型，也可以不同。如EPO、G

8、-CSF、GH受體2個(gè)同樣的單體；IL-1，GM-CSF，IL-6受體是2個(gè)不同的單體；TNF-是3個(gè)同樣的單體；IL-2是3個(gè)不同的受體。 c.離子通道耦聯(lián)受體 ：細(xì)胞表面一些神經(jīng)遞質(zhì)的受體，自身是一些離子通道，或者與離子通道相耦聯(lián)。當(dāng)與配體結(jié)合時(shí)，受體構(gòu)象改變，通道開(kāi)放，離子進(jìn)出細(xì)胞，引起電興奮。 第16頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五三. 高通量篩選技術(shù)體系的組成1. 化合物樣品庫(kù)化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個(gè)來(lái)源。 其中,人工合成又有常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。第17頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五2.自動(dòng)化的操作

9、系統(tǒng)自動(dòng)化操作系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)通過(guò)操作軟件控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。操作軟件采用實(shí)物圖像代表實(shí)驗(yàn)用具，簡(jiǎn)潔明了的圖示代表機(jī)器的動(dòng)作。 自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組分，根據(jù)需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的工作。第18頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五3.高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng) 檢測(cè)系統(tǒng)一般采用 液閃計(jì)數(shù)器、 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)計(jì)數(shù)器、 寬譜帶分光光度儀、 熒光光度儀等。第19頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五4.數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng) 數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)承擔(dān)4個(gè)方面的功能: 樣品庫(kù)的管理功能; 生物活性信息的管理功能; 對(duì)高通量藥物篩選的服務(wù)功能; 藥物設(shè)計(jì)與

10、藥物發(fā)現(xiàn)功能。 5、 高特異體外篩選模型第20頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五四. 高通量篩選模型常用的篩選模型都在分子水平和細(xì)胞水平，觀察的是藥物與分子靶點(diǎn)的相互作用， 能夠直接認(rèn)識(shí)藥物的基本作用機(jī)制。 第21頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五1.分子水平的藥物篩選模型: (1).受體篩選模型:指受體與放射性配體結(jié)合模型。以受體為作用靶的篩選方法,包括檢測(cè)功能反應(yīng)、第二信使生成和標(biāo)記配體與受體相互作用等不同類(lèi)型。 (2)酶篩選模型:觀察藥物對(duì)酶活性的影響。根據(jù)酶的特點(diǎn), 底物,產(chǎn)物都可以作為檢測(cè)指標(biāo),并由此確定反應(yīng)速度。典型的酶篩選包括（1) 適當(dāng)緩

11、沖液中孵化;(2)控制反應(yīng)速度,如:溫度,緩沖液的pH值和酶的濃度等;(3) 測(cè)量產(chǎn)物的增加和底物的減少。 (3)離子通道篩選模型: (1)貝類(lèi)動(dòng)物毒素的高通量篩選,其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)，用放射性配體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)考察受試樣品。(2)用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道3亞單位與1亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。第22頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五2.細(xì)胞水平藥物篩選模型觀察被篩樣品對(duì)細(xì)胞的作用。但不能反映藥物作用的具體途徑和靶標(biāo),僅反映藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程的綜合作用。包括: 內(nèi)皮細(xì)胞激活; 細(xì)胞凋亡; 抗腫瘤活性; 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

12、檢測(cè); 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路; 細(xì)菌蛋白分泌; 細(xì)菌生長(zhǎng)。第23頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五高通量篩選技術(shù)與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):反應(yīng)體積??；自動(dòng)化；靈敏快速檢測(cè)；高度特異性。但是，高通量篩選作為藥物篩選的方法,并不是一種萬(wàn)能的手段，特別是在中藥研究方面，其局限性也是十分明顯的。第24頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五五、高通量藥物篩選原理 1基本原理 高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系，它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)

13、數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。它的正常開(kāi)展需要有一個(gè)高容量的化合物庫(kù)、自動(dòng)化的操作系統(tǒng)、高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)、高效率的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及高特異性的藥物篩選模型。第25頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五（1） 化合物樣品庫(kù) 高通量篩選是一種利用已有的化合物進(jìn)行的體外隨機(jī)篩選。 因此通過(guò)高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物(leading compounds)的有效性取決于化合物樣品庫(kù)中化合物的數(shù)量及其質(zhì)量。 化合物樣品的數(shù)量是指不同樣品的數(shù)量。 化合物樣品的質(zhì)量由化合物結(jié)構(gòu)的多樣性決定的。 許多活性反應(yīng)基團(tuán)(reactive groups)使初篩的假陽(yáng)性大量增加，剔除這些化

14、合物可以提高化合物樣品庫(kù)的質(zhì)量。第26頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個(gè)來(lái)源。人工合成又可分為常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法。采用常規(guī)化學(xué)合成的純化合物一直是國(guó)外制藥企業(yè)建立化合物樣品庫(kù)的主要來(lái)源。它們通過(guò)長(zhǎng)年積累的化合物建立化合物樣品庫(kù)，通過(guò)購(gòu)買(mǎi)和化合物交流使化合物樣品庫(kù)的數(shù)量和質(zhì)量大幅度提高。第27頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五組合化學(xué)(combinatorial chemistry)的出現(xiàn)為大量增加化合物的數(shù)量提供另外一種來(lái)源。組合化學(xué)的基本原理是采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法，在特定的分子母核上加入

15、不同的基團(tuán)，在同樣條件下，產(chǎn)生大量的新化合物。這種方法在化合物的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化方面已經(jīng)表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。但是，由于該方法是基于母核結(jié)構(gòu)的改造，因此產(chǎn)生的大量化合物在結(jié)構(gòu)多樣性方面尚有不足。解決組合化學(xué)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性的問(wèn)題，已經(jīng)成為化學(xué)研究人員的研究課題。第28頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 從天然產(chǎn)物中分離出來(lái)的化合物，母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是長(zhǎng)期的自然選擇形成的，它們通過(guò)高通量篩選所表現(xiàn)出來(lái)的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。因此，增加具結(jié)構(gòu)多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)重要途徑?？鐕?guó)制藥企業(yè)為了增加高通量篩選的陽(yáng)性率，已經(jīng)或正在

16、尋求購(gòu)買(mǎi)我國(guó)的天然產(chǎn)物單體。第29頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五(2) 自動(dòng)操作系統(tǒng) 高通量藥物篩選每天要對(duì)數(shù)千化合物樣品進(jìn)行檢測(cè)，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯(cuò)。 自動(dòng)化操作系統(tǒng)采用微孔板作為反應(yīng)容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通過(guò)條形碼加以標(biāo)記。自動(dòng)化操作系統(tǒng)通過(guò)光電閱讀器對(duì)特定的微孔板上的特定位置進(jìn)行操作，并將操作結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存貯在計(jì)算機(jī)內(nèi)，使篩選結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)過(guò)程快速。第30頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 除了實(shí)驗(yàn)步驟的需要以外，自動(dòng)化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。目前主要有單孔、8孔、96孔、3

17、84孔等幾種方式。單孔一般用于對(duì)照樣品以及復(fù)篩中零散樣品的轉(zhuǎn)移。96孔、384孔在酶活性檢測(cè)以及需同時(shí)開(kāi)始、同時(shí)終止反應(yīng)的篩選模型中是必需的。 自動(dòng)化操作系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過(guò)程中用來(lái)放置樣品板、反應(yīng)板以及對(duì)它們進(jìn)行轉(zhuǎn)移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數(shù)量取決于堆棧的容量。第31頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五由此可見(jiàn)，高通量藥物篩選的自動(dòng)化操作系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)及其操作軟件、自動(dòng)化加樣設(shè)備、溫孵離心等設(shè)備、堆棧4個(gè)部分組成。不同的單位可根據(jù)篩選模型類(lèi)型、篩選規(guī)模選購(gòu)不同的部分整合成為一個(gè)完整的操作系統(tǒng)。第32頁(yè)，共85頁(yè)，202

18、2年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五(3 )檢測(cè)系統(tǒng) 快速、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)是高通量藥物篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一。在高通量藥物篩選中，檢測(cè)系統(tǒng)一般采用液閃計(jì)數(shù)器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)計(jì)數(shù)器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。檢測(cè)儀器靈敏度的不斷提高，即使對(duì)微量樣品的檢測(cè)，也可以得到很好的檢測(cè)效果。第33頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五A. 放射性檢測(cè)技術(shù)。 美國(guó)學(xué)者GanieSM在高通量藥物篩選研究中，應(yīng)用放射性測(cè)定法，特別是親和閃爍（SPA）檢測(cè)方法，使在96孔板上進(jìn)行的樣本量實(shí)驗(yàn)得到發(fā)展。該方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，促進(jìn)了高通量藥物篩選的實(shí)現(xiàn)，但存在環(huán)境污染問(wèn)題。第34頁(yè)，共85頁(yè)，2

19、022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 液閃計(jì)數(shù) 放射性同位素廣泛用于受體結(jié)合測(cè)定、細(xì)胞毒性、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、藥物代謝示蹤以及基因分析中。由于采用了雙光電倍增管及時(shí)間分辨偶合回路(time-resolved coincidence circuit)技術(shù)，有效地降低了背景信號(hào)的干擾，使測(cè)定靈敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析檢測(cè)中，背景信號(hào)可控制在10cpm左右。第35頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五親和閃爍分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一種新的液閃分析法。在高通量篩選測(cè)定細(xì)胞表面受體親合結(jié)合作用時(shí)，放射配體標(biāo)記濾過(guò)分析技術(shù)

20、由于需要進(jìn)行分離，現(xiàn)已被親合閃爍分析所取代。 親合閃爍分析技術(shù)通過(guò)親合結(jié)合，將放射性配基結(jié)合到具有受體的閃爍球上，從而產(chǎn)生光子，減少了放射配體標(biāo)記游離配基與結(jié)合配基的分離過(guò)程，使得放射配基分析可完全以自動(dòng)化的方式進(jìn)行，適于進(jìn)行高通量篩選。產(chǎn)生低能量放射粒子的同位素可被用來(lái)進(jìn)行放射性標(biāo)記，而這種低能量放射粒子在短距離內(nèi)可被重吸收，以確保只有結(jié)合到受體表面的配基才被檢測(cè)到。 SPA技術(shù)被廣泛的應(yīng)用到激酶、核酸處理、酶分析以及受體配體的相互作用分析中。第36頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 B. 光學(xué)測(cè)定技術(shù)。 近年來(lái)，美、英兩國(guó)研究人員在高通量篩選檢測(cè)中，建立了大量的非同位素

21、標(biāo)記測(cè)定法，如用分光光度檢測(cè)法篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑、組織纖溶酶原激活等，均獲得成功。第37頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 分光光度法 為了適應(yīng)高通量藥物篩選，許多公司都生產(chǎn)了具備計(jì)算機(jī)接口并能對(duì)多孔板進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的分光光度計(jì)。以Molecular Device公司的spectra 190為例，它采用8條光導(dǎo)纖維同時(shí)對(duì)8孔進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定波長(zhǎng)以2nm為間隔，可以在190nm一850nm間進(jìn)行選擇。對(duì)未知物質(zhì)，可在該范圍內(nèi)進(jìn)行掃描以確定其特征吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測(cè)數(shù)據(jù)以不同文件格式輸出，可用隨機(jī)軟件或通用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理。方便、快速、準(zhǔn)確、自

22、動(dòng)化程度高。 分光光度法高靈敏儀器同自動(dòng)化操作系統(tǒng)的連接，使得基于紫外、可見(jiàn)光譜的高通量藥物篩選模型成為主要模型種類(lèi)。第38頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五C. 化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 化學(xué)發(fā)光指生色物質(zhì)在酶促作用下，化學(xué)能以光子的形式釋放出來(lái)?；瘜W(xué)發(fā)光根據(jù)發(fā)光的形式和種類(lèi)分為輝光型和閃光型發(fā)光兩種。 輝光型化學(xué)發(fā)光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等為基礎(chǔ)的發(fā)光反應(yīng)。其發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)且穩(wěn)定。 閃光型發(fā)光以發(fā)光蛋白、ATP、熒光素酶等為底物的發(fā)光反應(yīng)，其發(fā)光時(shí)間較短。 由于時(shí)間分辨及偶合回路技術(shù)的使用，對(duì)于背景的去除更為有效，使得化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1p

23、g數(shù)量級(jí)。在單孔多點(diǎn)噴射技術(shù)中，光導(dǎo)纖維末端帶有一噴頭，用來(lái)加入底物。反應(yīng)性底物從100個(gè)小孔噴出，使反應(yīng)性底物加入孔中后即可均勻混合。發(fā)光反應(yīng)同時(shí)啟動(dòng)后，可立即進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于閃光性化學(xué)發(fā)光的測(cè)定更為有利。第39頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 D. 熒光檢測(cè)技術(shù)。 美國(guó)學(xué)者GiulianokA，采用FLIPR熒光檢測(cè)法，可在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)定熒光的強(qiáng)度和變化，可測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子流及測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH和細(xì)胞內(nèi)鈉離子流等。第40頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 激發(fā)熒光檢測(cè) 是新型激發(fā)熒光檢測(cè)儀。用連續(xù)的激發(fā)光譜取代固定光譜。因?yàn)槎鄶?shù)熒光基團(tuán)都有短暫的半衰期

24、，即使用較弱的激發(fā)光源也能獲得大量的光子流。這種特性以及多種可采用的熒光模式，使得熒光檢測(cè)技術(shù)成為高通量篩選必不可少的應(yīng)用手段。熒光技術(shù)在均相篩選分析中廣為應(yīng)用。其中，包括 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)， 熒光偏振(FP)， 時(shí)間分辨熒光(TRET) 熒光相關(guān)譜 (FCS)等技術(shù)。第41頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五E、多功能微板檢測(cè)系統(tǒng)。 由西安交通大學(xué)藥學(xué)院研制的1536孔板高通量多功能微板檢測(cè)系統(tǒng)，是目前國(guó)際上先進(jìn)的高通量檢測(cè)系統(tǒng)，它可使篩選量進(jìn)一步提高，現(xiàn)已在該院投入使用。第42頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五(4 )數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng) 高通量

25、藥物篩選的特點(diǎn)是對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的化合物樣品進(jìn)行多模型的篩選。與高通量藥物篩選相適應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)主要承擔(dān)4個(gè)方面的功能。第43頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五樣品庫(kù)的管理功能： 化合物樣品庫(kù)對(duì)進(jìn)行高通量藥物篩選的化合物樣品的各種理化性質(zhì)進(jìn)行存儲(chǔ)管理。對(duì)每一個(gè)新入庫(kù)的化合物進(jìn)行新穎性分析，排除結(jié)構(gòu)雷同的化合物，避免不必要的篩選。 由于反應(yīng)性基團(tuán)增加了假陽(yáng)性出現(xiàn)的機(jī)率，樣品庫(kù)對(duì)新入庫(kù)的化合物進(jìn)行反應(yīng)基團(tuán)檢測(cè)以去除這類(lèi)化合物。第44頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五生物活性信息的管理功能： 生物活性庫(kù)存貯每一化合物都要經(jīng)過(guò)不同模型檢測(cè)，并根據(jù)多個(gè)模型的檢測(cè)結(jié)果

26、對(duì)化合物的生物活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。第45頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五對(duì)高通量藥物篩選的服務(wù)功能： 高通量藥物篩選的工作量大，自動(dòng)化程度高，也涉及到許多繁瑣的工作。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)對(duì)與藥物篩選相關(guān)的業(yè)務(wù)往來(lái)通訊、檔案管理以及各種樣品標(biāo)簽的打印進(jìn)行管理，使高通量藥物篩選的各個(gè)環(huán)節(jié)程序化、標(biāo)準(zhǔn)化。第46頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五藥物設(shè)計(jì)與藥物發(fā)現(xiàn)功能： 高通量藥物篩選產(chǎn)生大量的化合物結(jié)構(gòu)信息，隨著篩選的進(jìn)行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)通過(guò)對(duì)同一模型不同的呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，找出其構(gòu)效關(guān)系，從而

27、為藥物設(shè)計(jì)提供參考。第47頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五(5) 篩選模型 指用于檢測(cè)藥物作用的實(shí)驗(yàn)方法。由于高通量篩選要求反應(yīng)總體積小，而且，反應(yīng)具有較高特異性和敏感性，因此對(duì)于篩選模型也要求較高，常用的篩選模型都在分子水平和細(xì)胞水平，觀察的是藥物與分子靶點(diǎn)的相互作用，能夠直接認(rèn)識(shí)藥物的基本作用機(jī)制。 目前這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細(xì)胞反應(yīng)方面。近年也出現(xiàn)了基因水平的藥物篩選模型，使藥物篩選模型的范圍更廣泛。第48頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五（一）分子水平的藥物高通量篩選模型 a.以酶為靶的高通量篩選 以酶為作用靶的高通量篩選方法

28、，絕大多數(shù)是直接檢測(cè)酶活性。具體方法根據(jù)酶的不同而不同，主要有放射性的方法和比色、熒光的方法。第49頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 基于放射性的方法多是將底物標(biāo)記，測(cè)定放射性產(chǎn)物的生成。 Taft等建立了(1,3)-葡聚糖合酶抑制劑(抗真菌)的高通量篩選方法。將含有酶的菌絲提取物、-淀粉酶和UDP葡萄糖加入96孔板的孔中，溫孵、反應(yīng)。終止反應(yīng)后，濾去未被合成進(jìn)入的底物。閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)濾器上保留的(1,3)-葡聚糖，指示酶活性大小。 第50頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五也有將酶標(biāo)記，測(cè)定被特異結(jié)合的酶的方法。 Vollmer等建立了一種以青霉素結(jié)合蛋

29、白(PBP)為靶的抗生素的高通量篩選方法。PBP既是糖基轉(zhuǎn)移酶又是肽轉(zhuǎn)移酶，該法是篩選其糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)上的可結(jié)合物。將莫諾霉素(moenomycin)結(jié)合于一種小球上，制成混懸液，加入96孔板，然后加入3標(biāo)記的PBP(細(xì)菌膜粗提物)和受試化合物，孵育、過(guò)濾去掉非結(jié)合的放射性，閃爍計(jì)數(shù)測(cè)得的放射性指示PBP與莫諾霉素結(jié)合的情況及受試化合物對(duì)其影響。第51頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 基于放射性而無(wú)需過(guò)濾分離的SPA也有應(yīng)用。 Brown等建立了內(nèi)源性肽酶的水解活性檢測(cè)方法，用以研究其抑制劑。用3標(biāo)記的肽底物，通過(guò)生物素(biotin)與抗生物素蛋白(avidi

30、n)包裹的SPA閃爍球相連。酶解使3隨肽的斷裂而離開(kāi)閃爍球。測(cè)定3放射性作用于閃爍球產(chǎn)生的閃爍信號(hào)的丟失量，即指示酶活性大小。第52頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 基于比色、熒光等的方法有一些報(bào)道。 Waslidge等建立了脂氧合酶抑制劑的篩選方法。酸性條件下，脂的過(guò)氧化物能把Fe2+氧化為Fe3+，然后氧化二甲酚橙(xylenol orange)，產(chǎn)物在可見(jiàn)光區(qū)620nm有強(qiáng)烈吸收。在96孔板上測(cè)定。 Zhang等建立了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(抗病毒藥物)的高通量篩選方法。該方法基于逆轉(zhuǎn)錄酶能很容易地將核苷酸類(lèi)似物(如生物素-dUTP)引入新生DNA鏈。在96或384孔

31、板上，將生物素化的引物/模板與抗生蛋白鏈菌素在板孔中混合孵育，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)60min后，加入親和素-別藻藍(lán)蛋白孵育，用HTRF分析儀讀取數(shù)據(jù)。該法也可用于多種其他的核酸聚合酶。第53頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五b.以受體為靶的高通量篩選 以受體為作用靶的高通量篩選法，包括檢測(cè)功能反應(yīng)、第二信使生成和標(biāo)記配體與受體相互作用等不同類(lèi)型。優(yōu)點(diǎn)是易于區(qū)分激動(dòng)劑和拮抗劑。 經(jīng)典的功能檢測(cè)方法通量低，而引入基于重組技術(shù)的報(bào)告基因檢測(cè)方法極大地提高了篩選通量，既高效且節(jié)省成本。檢測(cè)第二信使或下游機(jī)制如磷酸化，傳統(tǒng)方法也比較麻煩

32、，不適于高通量檢測(cè)，但將這些機(jī)制與報(bào)告基因相偶聯(lián)則能克服。第54頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 c.以離子通道為靶的高通量篩選 Negri等建立了貝類(lèi)動(dòng)物毒素的高通量篩選方法。其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)結(jié)合位點(diǎn)，用放射性配體(3H-STX)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)考察受試樣品。 Yong等用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道3亞單位與1亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。第55頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 d.以核酸為靶的高通量篩選 Hamasaki等建立了以16S rRNA編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和HIV-RRE RNA結(jié)構(gòu)為靶的

33、抑制劑的高通量篩選方法。尋找類(lèi)似氨基糖甙類(lèi)抗生素而親和力更高或作用于相同核酸的其他位點(diǎn)的新化合物，以及不易被代謝失活的新化合物。 方法基于當(dāng)含芘的氨基甙類(lèi)似物結(jié)合于RNA時(shí)，芘的熒光被淬滅的原理。在96孔板上，將芘碳酰巴龍霉素(PCP)，RNA配成溶液后加入有受試化合物的板孔中，用熒光讀板器考察熒光恢復(fù)的程度。第56頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五（二）細(xì)胞水平的藥物高通量篩選模型 1、選擇蛋白(selectins) 選擇蛋白是膜整合糖蛋白的一個(gè)家族，它能夠識(shí)別從另外一個(gè)細(xì)胞表面伸展出來(lái)的特異的糖基團(tuán)，并與之特異性結(jié)合，因此它也是細(xì)胞表面受體。選擇蛋白有一個(gè)小的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)

34、域，一個(gè)單次跨膜的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)大的細(xì)胞外片段，在這個(gè)片段上可分為幾個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括最外端的具有凝集素作用的結(jié)構(gòu)域。 第57頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 第58頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 已知有三種類(lèi)型的選擇蛋白 E-選擇蛋白，它在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)； P-選擇蛋白，在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)； L-選擇蛋白，在各種類(lèi)型的白細(xì)胞中表達(dá)。 這三種選擇蛋白都是識(shí)別小的出現(xiàn)在某些糖蛋白或糖脂的四糖基團(tuán)，選擇蛋白同糖配體的結(jié)合是Ca2+依賴(lài)性的。選擇蛋白主要介導(dǎo)循環(huán)中的白細(xì)胞在有炎癥和血塊的血管壁部位暫時(shí)性相互作用。與選擇蛋白起作用的靶細(xì)胞上的蛋白通常稱(chēng)為粘蛋白

35、(mucin)。 第59頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五2.ELISA2.1.ELISA的原理 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性， 酶標(biāo)記的抗原 或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用 洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上 。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本

36、中受檢物 質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很 高的敏感度。 第60頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五2.2ELISA的類(lèi)型 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即“免疫吸附劑 ”（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為“結(jié)合物”（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類(lèi)型： 第61頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五（1）間接法測(cè)抗體間接法

37、是檢測(cè)抗體常用的方法。原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。 常用于臨床血清中自身抗體的檢測(cè)，以及雜交瘤上清特異性抗體的篩選。第62頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五(2) 雙抗體夾心法測(cè)抗原是檢測(cè)抗原最常用的方法。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。用途：測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。雙抗體夾心法測(cè)抗原的方法：捕獲抗體包被封閉（3BSA）待測(cè)抗原洗滌（含0.1Tween的PBS)酶標(biāo)單抗或多抗洗滌顯色檢測(cè)第63頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20

38、日，1點(diǎn)9分，星期五(3)競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原1）抗體固相測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。 原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。 方法：抗體包被封閉同時(shí)加入待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原洗滌酶底物顯色 檢測(cè)2）抗原固相測(cè)抗原 原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原與一定量的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。標(biāo)本中抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的抗體愈少，最后的顯色也愈淺。 方法: a: 抗原包被96孔板； b:封閉; c: 待測(cè)抗原與抗體反應(yīng)一定時(shí)間； d: 加入96孔板 e: 洗

39、滌 f：加入酶標(biāo)二抗 g：洗滌 h：顯色和檢測(cè) 第64頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五第65頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五第66頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五第67頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五（二）細(xì)胞水平的藥物高通量篩選模型 a. 內(nèi)皮細(xì)胞激活 內(nèi)皮細(xì)胞激活是急慢性炎癥過(guò)程中重要環(huán)節(jié)。Rice等以選擇蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)作為標(biāo)志，建立了內(nèi)皮細(xì)胞激活抑制劑的高通量篩選方法。建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。IL-1刺激下，選擇蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)用ELISA方法定量。方法包括細(xì)胞固定、加液、加受試化

40、合物等操作，能保持細(xì)胞完整，不昂貴，可重復(fù)，篩選速度可達(dá)每星期1000種化合物。能夠較早地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)化合物的攝取及化合物的細(xì)胞毒性。第68頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 b. 細(xì)胞凋亡 Erusalimsky等建立。細(xì)胞預(yù)先用3 胸苷標(biāo)記，與凋亡誘導(dǎo)物孵育后，連續(xù)經(jīng)過(guò)兩種玻璃濾器。一個(gè)是中性的，捕獲完整的染色質(zhì)和高分子量。另一個(gè)裝有DEAE活性基團(tuán)，捕獲低分子量DNA碎片。通過(guò)對(duì)濾器上放射性的測(cè)量，可以對(duì)DNA的破碎情況定量。 第69頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五c. 抗腫瘤活性 Lu等建立 “生物活性指紋”篩選抗肺癌藥物的方法，考察受試分子(類(lèi)

41、維生素及類(lèi)維生素相關(guān)分子)對(duì)許多不同細(xì)胞系的效應(yīng)特點(diǎn)。檢測(cè)指標(biāo)包括： (1)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細(xì)胞，包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來(lái)源。細(xì)胞暴露于受試化合物5后，用標(biāo)準(zhǔn)比色法測(cè)定存活細(xì)胞百分率。20%生長(zhǎng)抑制率指示有活性。 (2)集落形成抑制檢測(cè)，用以區(qū)分細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用和細(xì)胞殺傷作用。6孔板上加NCI-H292肺癌細(xì)胞，暴露于受試物一定時(shí)間。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，植于無(wú)受試物的培養(yǎng)介質(zhì)共7d。用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色，考察集落形成情況。 (3)凋亡檢測(cè)，用ELISA方法測(cè)量細(xì)胞DNA破碎。 (4)轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測(cè)，用以考察受試化合物是否有類(lèi)維生素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制作用。方

42、法是將HeLa TK-細(xì)胞用73Col-CAT報(bào)告基因連同受體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，與受試物一起培養(yǎng)，用ELISA方法檢測(cè)CAT活性。第70頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 d. G2檢查點(diǎn)(G2 checkpoint) Roberge等建立了G2期檢查點(diǎn)抑制劑的高通量篩選方法。將MCF-7m p53細(xì)胞培養(yǎng)，種在96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上。照射使細(xì)胞進(jìn)入G2靜止期，加入受試化合物用ELISA方法檢測(cè)核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，從而得到從G2期釋放進(jìn)入期的細(xì)胞數(shù)量，即抑制G2檢查點(diǎn)程度。 細(xì)胞周期分為四個(gè)階段：即G1期(DNA合成前期)、s期(DNA合成期)、G

43、2期(DNA合成后期)和M期(有絲分裂期)。G0期細(xì)胞也稱(chēng)休眠細(xì)胞。 第71頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五e(cuò). 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 Su等建立了TGF3通路作用物的高通量篩選方法。構(gòu)建融合報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，選擇蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)能被TGF高誘導(dǎo)的克隆。將細(xì)胞植于96孔板，與受試化合物孵育后，稀釋并加入Steady-Glo底物測(cè)蟲(chóng)熒光素酶活力，與對(duì)照比較，計(jì)算相對(duì)酶活性增加值。第72頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 f. 細(xì)菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制細(xì)菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基于SecA-lacZ融合報(bào)告基因。Se

44、cA是一種自我調(diào)控翻譯的蛋白，當(dāng)細(xì)菌蛋白分泌被干擾時(shí)，該報(bào)告基因被誘導(dǎo)。 第73頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五g. 細(xì)菌生長(zhǎng) Chung等建立了抑制分枝桿菌生長(zhǎng)化合物的高通量篩選方法。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結(jié)核分枝桿菌，因其具有生長(zhǎng)迅速以及非感染性的特點(diǎn)。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞攝入放射性標(biāo)記的尿嘧啶，考察受試化合物對(duì)分枝桿菌活力的作用。 第74頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五2生藥活性成分的高通量篩選 樣品庫(kù)來(lái)源的化學(xué)多樣性是決定高通量篩選技術(shù)能否成功的關(guān)鍵因素之一。從天然產(chǎn)物分離出來(lái)的化合物，其母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是長(zhǎng)期的自然選擇形成的，它們通過(guò)高通量

45、篩選所表現(xiàn)出來(lái)的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。第75頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 我國(guó)擁有非常豐富的藥材資源。僅僅依靠傳統(tǒng)的藥理實(shí)驗(yàn)方法篩選，既耗時(shí)，勞動(dòng)強(qiáng)度又大，還需要使用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，顯然不能適應(yīng)大量樣品的同時(shí)篩選。使大量分離出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物資源的極大浪費(fèi)。將高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于生藥的活性成分研究，既是對(duì)高通量篩選技術(shù)的不斷完善，又是將這一技術(shù)應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化研究的有益嘗試。 如何對(duì)生藥的活性成分進(jìn)行高通量篩選呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致，區(qū)別主要在于篩選前需要從生藥中將化合物提取出來(lái)并進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x和化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)。相同的就不再贅述，這里主要談一下提取、分離和多樣性評(píng)價(jià)的問(wèn)題。第76頁(yè)，共85頁(yè)，2022年，5月20日，1點(diǎn)9分，星期五 (1 )提取 由于高通量篩選需要大量的樣品來(lái)源，常規(guī)的提取方法顯然不能滿(mǎn)足這一要求。尋找一個(gè)快速、高效、連續(xù)、自動(dòng)化的提取方法顯得迫在眉睫。 加速溶劑提取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新的提取技術(shù)，在準(zhǔn)備好樣品和對(duì)提取方法（或程序）進(jìn)行設(shè)定后，自動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)收集裝置就可以連續(xù)對(duì)最多24個(gè)不同樣品自動(dòng)完成樣品的提取和提取液的收集，簡(jiǎn)單方