分子發(fā)光精品課件

1、分子發(fā)光1第1頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一2. 熒光分析法的應(yīng)用1. 工作曲線法熒光猝滅工作曲線法FxFCsCx直接熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線法FCsFxCx一. 定量分析方法2. 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法（比較法）cx待測(cè)試液濃度cs標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度Ifx待測(cè)試液熒光強(qiáng)度Ifx標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光強(qiáng)度If0空白試劑熒光強(qiáng)度依據(jù)：IF=kc2第2頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一熒光分析的靈敏度比紫外-可見分光光度法高103104.二. 熒光分析法的靈敏度熒光分析法可通過提高入射光強(qiáng)度或增大檢測(cè)器的放大倍數(shù)提高靈敏度。3第3頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一紫外

2、-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光(磷光)分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器4第4頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一在光照下會(huì)發(fā)生熒光的無機(jī)化合物很少，主要利用與有機(jī)試劑形成的熒光配合物。如Al3+可與8-羥基喹啉配合。三. 熒光分析的應(yīng)用1. 無機(jī)化合物的分析直接熒光測(cè)定法常測(cè)定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd與某些稀土元素；測(cè)定的靈敏度有些可以達(dá)到10-10;某些元素雖然不與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會(huì)與發(fā)熒光的配合物爭(zhēng)奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光猝滅，由熒光猝滅的強(qiáng)度

3、計(jì)算該元素的含量。較常測(cè)定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W熒光猝滅測(cè)定法5第5頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一2. 有機(jī)化合物的分析（1）脂肪族有機(jī)化合物 分子結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本身能發(fā)生熒光的很少，一般需要與某些試劑反應(yīng)后才能進(jìn)行熒光分析，如丙三醇與苯胺在濃硫酸介質(zhì)中反應(yīng)生成發(fā)射藍(lán)色熒光的喹啉，據(jù)此可以測(cè)定0.12gmL的丙三醇。 （2）芳香族化合物 具有共軛的不飽和體系，多能發(fā)生熒光，可直接用熒光法測(cè)定。6第6頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一一、概述 磷光分析法是以分子磷光光譜來鑒別有機(jī)化合物和進(jìn)行定量分析的一種方法。 磷

4、光分析法在藥物分析,臨床分析等領(lǐng)域的應(yīng)用日益發(fā)展。磷光的特點(diǎn)： 磷光波長(zhǎng)比熒光的大(能量T1S1)； 磷光壽命比熒光的長(zhǎng)(磷光為禁阻躍遷產(chǎn)生，速率常數(shù)小)； 磷光壽命和強(qiáng)度對(duì)重原子和氧敏感。2.5 磷光分析法7第7頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一二、 基本原理(一) 磷光的產(chǎn)生和磷光強(qiáng)度1.磷光是處于激發(fā)三重態(tài)的分子躍遷返回基態(tài)時(shí)所產(chǎn)生的輻射。2.磷光強(qiáng)度: IP=2.3PI0bc在一定的條件下，p、Ip 、k、b 均為常數(shù)，因此上式可寫成： Ip=KcIP磷光強(qiáng)度P磷光效率I 激發(fā)光的強(qiáng)度磷光物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù) b 試樣池的光程 c 磷光物質(zhì)的濃度8第8頁，共26頁，

5、2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一(二) 溫度對(duì)磷光強(qiáng)度的影響1. 隨著溫度降低，分子熱運(yùn)動(dòng)速率減慢，磷光增強(qiáng)。2. 低溫磷光(液氮) 由于磷光壽命長(zhǎng)，T1的非輻射躍遷(內(nèi)轉(zhuǎn)換)幾率增加，碰撞失活(振動(dòng)弛豫)的幾率、光化學(xué)反應(yīng)幾率都增加，從而降低磷光強(qiáng)度。因此有必要在低溫下測(cè)量磷光。同時(shí)要求溶劑： 易提純且在分析波長(zhǎng)區(qū)無強(qiáng)吸收和發(fā)射； 低溫下形成具有足夠粘度的透明的剛性玻璃體。常用的溶劑： EPA乙醇+異戊烷+二乙醚(2+2+5) IEPACH3I+EPA(1+10)。9第9頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一(三)重原子效應(yīng) 使用含有重原子的溶劑(碘乙烷、溴乙烷)

6、或在磷光物質(zhì)中引入重原子取代基，都可以提高物質(zhì)的磷光強(qiáng)度，這種效應(yīng)稱為重原子效應(yīng)。前者稱為外部重原子效應(yīng)，后者稱為內(nèi)部重原子效應(yīng)。機(jī)理:重原子的高核電荷使磷光分子的電子能級(jí)交錯(cuò)，容易引起或增強(qiáng)磷光分子的自旋軌道偶合作用，從而使S1T1的系間竄躍概率增大，有利于增大磷光效率。10第10頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一(四) 室溫磷光 低溫磷光需低溫實(shí)驗(yàn)裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發(fā)展了室溫磷光。 1)固體基質(zhì)：在室溫下以固體基質(zhì)(如纖維素等)吸附磷光體，可增加分子剛性、減少三重態(tài)猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷光量子效率。 2)膠束增穩(wěn)：利用表面活性劑在臨界濃度形成

7、具多相性的膠束，改變磷光體的微環(huán)境、增加定向約束力，從而減小內(nèi)轉(zhuǎn)換和碰撞等去活化的幾率，提高三重態(tài)的穩(wěn)定性。 利用膠束增穩(wěn)、重原子效應(yīng)和溶液除氧是該法的三要素。11第11頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一3) 敏化磷光：其過程可以簡(jiǎn)單表示為：此法中，被測(cè)物質(zhì)不發(fā)射磷光，而是引發(fā)受體發(fā)光。12第12頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一三、磷光分析儀器 在熒光儀樣品池上增加磷光配件：低溫杜瓦瓶和斬光片。如右圖所示。 杜瓦瓶：提供低溫； 斬光片：切斷激發(fā)光。 斬光片的作用是利用其分子受激所產(chǎn)生的熒光與磷光的壽命不同獲取磷光輻射。轉(zhuǎn)筒式轉(zhuǎn)盤式磷光分析儀器示意圖

8、13第13頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一1. 光學(xué)系統(tǒng)與熒光分光光度計(jì)的區(qū)別光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器切光器（斬波器）熒 光：10-8 sec磷 光：110-4 sec2. 樣品池與熒光分光光度計(jì)的區(qū)別通常情況下，樣品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶?jī)?nèi)，來測(cè)定低溫磷光。14第14頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一2.6 化學(xué)發(fā)光分析法一、概述 某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時(shí)，由于吸收了反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，便發(fā)出一定波長(zhǎng)的光。這種吸收化學(xué)能使分子發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)光。 利用

9、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)而建立起來的分析方法稱為化學(xué)發(fā)光分析法。 化學(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，稱為生物發(fā)光。15第15頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一二、化學(xué)發(fā)光分析的基本原理 （一）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基本要求 化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)所發(fā)射的光。 任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包括化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個(gè)步驟，必須滿足如下條件：(1)化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠的化學(xué)能，并被發(fā)光物質(zhì)吸收形成電子激發(fā)態(tài)。許多氧化還原反應(yīng)具備此要求。(2)吸收了化學(xué)能處于激發(fā)態(tài)的分子，應(yīng)能釋放出光子或能將能量轉(zhuǎn)移給其他分子，該分子能以光的形式釋放能量。16第16頁，共26頁，2022年，5

10、月20日，9點(diǎn)53分，星期一（二）化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：時(shí)刻t 的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt 分析物參加反應(yīng)的速率；17第17頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一（三）化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù) 在化學(xué)發(fā)光分析中，被分析物相對(duì)于發(fā)光試劑小得多，對(duì)于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)： dc/dt =Kc； K 為反應(yīng)速率常數(shù)。定量依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測(cè)物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測(cè)物濃度成線性：18第18頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一（四）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型1. 直接化

11、學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接發(fā)光是被測(cè)物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。A + B C* + DC* C + h式中A或B是被測(cè)物，通過反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ，當(dāng)C* 躍遷回基態(tài)時(shí)，輻射光子。19第19頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一間接發(fā)光是被測(cè)物A或B，通過化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C* ， C* 不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。A + B C* + DC*+F F* + EF* F + h式中C*為能量給予體，而F為能量接受體。20第20頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，

12、星期一2. 氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光按反應(yīng)體系的狀態(tài)分類，如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行稱為氣相化學(xué)發(fā)光；在液相或固相中進(jìn)行稱為液相或固相化學(xué)發(fā)光；在兩個(gè)不同相中進(jìn)行則稱為異相化學(xué)發(fā)光。(1)氣相化學(xué)發(fā)光主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測(cè)空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。臭氧與乙烯的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)； 一氧化氮與臭氧的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 (2)液相化學(xué)發(fā)光用于此類化學(xué)發(fā)光分析的發(fā)光物質(zhì)有魯米諾、光澤堿、洛粉堿等。例如，利用發(fā)光物質(zhì)魯米諾，可測(cè)定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金屬離子。21第21頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期

13、一三、裝置與技術(shù) 裝置流程：發(fā)光反應(yīng)室光檢測(cè)器信號(hào)放大器顯示與記錄 發(fā)光反應(yīng)可采用靜態(tài)或流動(dòng)注射的方式進(jìn)行： 靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應(yīng)器中混合， 測(cè)最大光強(qiáng)度或總發(fā)光量；試樣量小，重復(fù)性差； 流動(dòng)注射方式：用蠕動(dòng)泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時(shí)通過測(cè)量室，連續(xù)發(fā)光，測(cè)定光強(qiáng)度；試樣量大；22第22頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一四、化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用1.廣泛應(yīng)用于大氣中O3、NO、NO2、H2O、SO2、CO等組分的檢測(cè)。2.魯米諾H2O2體系:可測(cè)痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等3. 間接測(cè)定某些生物試樣23第23頁，共26頁，2022年，5月20日，9點(diǎn)53分，星期一五、特點(diǎn)1. 靈敏度極高 例：熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學(xué)發(fā)光分析，可測(cè)定210-17Mol/L的ATP，即可檢測(cè)出一個(gè)細(xì)菌中的A