藤酮對體外培養(yǎng)星型膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用

1、藤酮對體外造就星型膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用劉輝，張筱軍，吳強(qiáng)，董兆君【關(guān)鍵詞】魚藤酮；星型膠質(zhì)細(xì)胞；活力；增殖摘要：目的不雅察魚藤酮對體外造就星型膠質(zhì)細(xì)胞毒性作用的特點(diǎn)。要領(lǐng)體外造就大鼠中腦星型膠質(zhì)細(xì)胞，接納膠質(zhì)纖維酸性卵白(GFAP)免疫熒光法斷定。不雅察染毒星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，檢測細(xì)胞活力，通過生長曲線闡發(fā)魚藤酮對星型膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響以及RTPR檢測破綻毗連卵白(nnexin43,X43)RNA表達(dá)。效果05l/L魚藤酮染毒24h即可引起顯著的細(xì)胞形態(tài)改變；075，10，20l/L魚藤酮染毒時星型膠質(zhì)細(xì)胞活力顯著低落，乳酸脫氫酶開釋量明顯增長；05l/L以上魚藤酮可顯著按捺膠質(zhì)細(xì)胞增殖，X43RN

2、A表達(dá)低落。結(jié)論魚藤酮對體外造就星型膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生顯著的毒性損傷作用，但與神經(jīng)元比力，星型膠質(zhì)細(xì)胞對雷同劑量的魚藤酮染毒具有更強(qiáng)的耐受本領(lǐng)。關(guān)鍵詞：魚藤酮；星型膠質(zhì)細(xì)胞；活力；增殖TxieffetsfrtennenpriaryulturedastrgliainvitrAbstrat：bjetiveTstudythetxieffetsinduedbyrtennenpriaryulturedastrglia.ethdsRatastrgliaereulturedandidentifiedbyglialfibrillaryaidprtEin(GFAP).TTassayandrphlgialbserv

3、atinereusedtevaluatethetxiityfrtennenastrglia,ellprliferatinandtheexpressinfX43RNAeredetetedbygrthurveanalysisandRTPR.Resultsellrphlgyashangedafterbeingexpsedt05l/Lrtennefr24hurs;theviabilityfellulturesassignifiantlydereasedafterbeingtreatedith075,10and20l/Lrtenne;ellprliferatinasinhibitedandtheexpr

4、essinfX43RNAassuppressedbviuslyby05and10l/Lrtenne.nlusinDsedependenttxieffetsnpriaryulturedastrgliauldbeinduedbybeingexpsedtrtenne,butastrgliahavehighertleranetthesaedsefrtenneparedithneurns.Keyrds：rtenne;astrglia;viability;prliferatin魚藤酮(Rtenne)是典范的線粒體按捺類農(nóng)藥，普及應(yīng)用于農(nóng)業(yè)消費(fèi)中。研究證明，恒久打仗該類化合物可導(dǎo)致中樞多巴胺神經(jīng)元損傷，動物

5、產(chǎn)生雷同帕金森病的病癥，但其詳細(xì)作用機(jī)制尚不完全明晰1，2。星型膠質(zhì)細(xì)胞(Astrglia)是中樞神經(jīng)體系數(shù)目最多、漫衍最廣的膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)體系發(fā)育、突觸通報、神經(jīng)構(gòu)造修復(fù)與再生、神經(jīng)免疫以及多種神經(jīng)疾病的的病理機(jī)制等方面都起著非常緊張的作用。在病理條件下，成效改變的星型膠質(zhì)細(xì)胞大概是帕金森病等神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生、生長的始動因素或促進(jìn)因素3。本研究以原代造就星型膠質(zhì)細(xì)胞為試驗(yàn)工具，不雅察體外魚藤酮染毒對星型膠質(zhì)細(xì)的毒性效應(yīng)特點(diǎn)，以期為探究神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制提供根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)11重要試劑和儀器魚藤酮(美國Siga公司)；胎牛血清造就基(DE/F12)(美國Gib公司)；類尺度胎牛血清

6、(蘭州民海生物公司)；Tripure(美國Rhe公司)；乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物公司)；四甲基偶氮噻唑藍(lán)(TT)(美國Aers公司)。酶標(biāo)儀(美國BIRAD公司)；PR儀(德國Eppendrf公司)；熒光顯微鏡E600(日本尼康公司)。12星型膠質(zhì)細(xì)胞原代造就、純化和斷定生后3dSD新生大鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪病院動物所)；斷頭取中腦構(gòu)造，根據(jù)文獻(xiàn)4要領(lǐng)分散和純化星型膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)3次傳代后即可得純化的星型膠質(zhì)細(xì)胞。星型膠質(zhì)細(xì)胞斷定接納免疫熒光法檢測膠質(zhì)纖維酸性卵白(GFAP)表達(dá)。一抗為兔抗鼠GFAP(1100)抗體，二抗為異硫氰酸熒光素(FIT)標(biāo)識表記標(biāo)幟的羊抗兔IgG(150)，熒火

7、顯微鏡下，以490n波長的引發(fā)光不雅察，GFAP陽性細(xì)胞即為星型膠質(zhì)細(xì)胞。13染毒星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不雅察將制備的細(xì)胞懸液接種于24孔造就板中，用含有20%胎牛血清的造就液造就5d，待細(xì)胞根本長滿孔壁后，換成含00，01，05和10l/L魚藤酮的造就液。各設(shè)2個平行孔，造就24h后，不雅察魚藤酮對星型膠質(zhì)細(xì)胞的影響，攝像記載。14TT法檢測星型膠質(zhì)細(xì)胞活力將制備的細(xì)胞懸液接種于96孔造就板中，接種密度為50104/l。待細(xì)胞根本長滿孔壁后，換成含00，01，025，05，075，10和20l/L魚藤酮的造就液200l。每組設(shè)6個平行孔，造就24h后每孔參加20lTT繼承造就4h，然后各孔參加15

8、0l二甲基亞砜溶解紫色結(jié)晶，于酶標(biāo)儀上測定波長490n的吸光度(A)值，吸光度值的巨細(xì)反響膠質(zhì)細(xì)胞成活數(shù)目及活性。15乳酸脫氫酶(LDH)開釋量測定魚藤酮染毒濃度別離為00，01，025，05，075，10和20l/L，星型膠質(zhì)細(xì)胞LDH開釋量測定按試劑盒說明書操縱。16生長曲線闡發(fā)魚藤酮對細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞接種于24孔板中，別離參加含00，01，05和10l/L魚藤酮的造就液1l，接種密度為50104/l，每組設(shè)4個平行孔。起始日為當(dāng)天接種細(xì)胞，越日起，即開始檢測每孔中的細(xì)胞總數(shù)，用計數(shù)板計數(shù)，一連不雅察5d，取4個孔的均勻值繪制生長曲線。17RTPR檢測破綻毗連卵白X43RNA表達(dá)PR引物

9、參照文獻(xiàn)5方案，由上海英駿生物技能公司合成，設(shè)磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)陽性產(chǎn)物作為PR內(nèi)參照。X43和GAPDH擴(kuò)增片斷長度別離為291和542bp，引物序列如下：X43：5TAAGAATGGA3；5ATTTGGTTGTGTGGGGAA3，GAPDH：5GATGATGATATAT3；5TGTATATTGTTGT3。逆轉(zhuǎn)錄反響體系包羅4gRNA、lig(dT)15、RNA酶按捺劑、dNTPs、5RT緩沖液和鼠原白血病逆轉(zhuǎn)錄酶(LV)，反響體積為20l。接納X43和GAPDH同管擴(kuò)增的要領(lǐng)，PR循環(huán)參數(shù)為：95預(yù)變性5in后進(jìn)入循環(huán)，95變性30s，60復(fù)性30s，72延伸45s，循環(huán)30次，末了72分外延伸10in。每一個樣品接納3管平行擴(kuò)增，而且重復(fù)1次。18統(tǒng)計闡發(fā)接納SPSS100軟件舉行方差闡發(fā)和t查驗(yàn)。2效果21魚藤酮對星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響(圖13)正常星型膠質(zhì)細(xì)胞為扁平梭形或星形，有細(xì)長突起，胞漿富厚，胞核較大，地步明晰，有12個核仁，位于核中心；免疫熒光法染色表現(xiàn)造就的星型膠質(zhì)細(xì)胞陽性率達(dá)95%以上。01l/L魚藤酮染毒細(xì)胞形態(tài)未見顯著改變；05l/L魚藤酮染毒24h可引起顯著的細(xì)胞形態(tài)變革，細(xì)胞胞體折光加強(qiáng)，細(xì)胞間隙增大，有少量細(xì)胞圓縮腫脹或脫壁；隨著染毒劑量的增大，損傷程度顯著加重，胞漿內(nèi)出現(xiàn)中毒顆粒，細(xì)胞數(shù)目顯著淘汰。圖1正