植物組織培養(yǎng)教材

1、第一章 植物組織培養(yǎng)的應用植物組織培養(yǎng)可應用于以下幾個方面：1挽救瀕于滅絕的植物；2快速繁殖稀有植物或有較大經(jīng)濟價值的植物；3、生產(chǎn)產(chǎn)脫毒苗苗；4、利用用組織培培養(yǎng)的材材料作為為植物生生物反應應器；多多種中草草藥資源源匱乏，產(chǎn)量不不足，甚甚至瀕于于滅絕。利用組組織和細細胞培養(yǎng)養(yǎng)的方法法在實驗驗室內(nèi)生生產(chǎn)；可可不再依依附于自自然環(huán)境境，不僅僅可以解解決現(xiàn)有有困難，而且可可以通過過篩選高高產(chǎn)有效效成分的的細胞系系，來提提高其藥藥用價值值。如用用培養(yǎng)的的人參懸懸浮細胞胞來生產(chǎn)產(chǎn)人參皂皂苷。利利用培養(yǎng)養(yǎng)的植物物細胞和和組織作作為生物物反應器器，也可可生產(chǎn)某某些蛋白白質(zhì)、氨氨基酸、抗生素素、疫苗苗等。5

2、、組織織培養(yǎng)結(jié)結(jié)合超低低溫可經(jīng)經(jīng)濟有效效地保存存植物種種質(zhì)資源源 6、組織織培養(yǎng)是是轉(zhuǎn)基因因技術(shù)不不可或缺缺的組成成部分；7、作物物育種（1）單單倍體育育種：采采用花藥藥培養(yǎng)可可縮短雜雜合體純純化所需需的時間間，節(jié)省省土地，假定兩兩個雜交交親本在在n個獨獨立遺傳傳的位點點上彼此此不同，通過花花藥培養(yǎng)養(yǎng)，在理理論上只只要有22n個FF1代花花粉植株株，就有有可能得得到一個個所需要要的基因因組合，而傳統(tǒng)統(tǒng)育種方方法，則則至少要要有4nn個F11植株才才能得到到一個所所需要的的基因組組合。（2）在在遠緣雜雜交中，通過離離體授粉粉或原生生質(zhì)體融融合有可可能克服服受精前前障礙，通過幼幼齡合子子胚培養(yǎng)養(yǎng)可

3、以克克服受精精后障礙礙，通過過體細胞胞融合還還有可能能制造出出細胞質(zhì)質(zhì)雜種。（3）通通過細胞胞培養(yǎng)，在細胞胞水平上上進行突突變體選選擇，可可在一定定程度上上使高等等植物的的育種程程序微生生物化，從而提提高選擇擇效率，節(jié)省時時間和土土地面積積。 （4）體體細胞無無性系變變異是除除有性雜雜交和理理化誘變變之外的的第三個個變異來來源。 8、用人人工種皮皮包被體體細胞胚胚制造人人工種子子，為稀稀有和珍珍貴物種種的繁殖殖提供了了一種高高效的手手段。9、用于于遺傳學學、分子子生物學學、細胞胞生物學學、胚胎胎學、基基因工程程、植物物發(fā)育等等的基礎(chǔ)礎(chǔ)研究。10、試試管花第二章 植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)的發(fā)展展簡史一、

4、 探探索階段段(200世紀初初至200世紀330年代代中)20世紀紀初，德德國植物物生理學學家Haaberrlanndt提提出了高高等植物物的器官官和組織織可不斷斷分割，直至分分到單個個細胞的的觀點，并設(shè)想想離體細細胞具有有再生完完整植株株的潛力力。Haaberrlanndt首首次進行行了離體體細胞培培養(yǎng)的實實驗，在在19002年發(fā)發(fā)表的“植物離離體細胞胞培養(yǎng)實實驗”報告中中，提出出了胚囊囊液在組組織培養(yǎng)養(yǎng)中的作作用和看看護培養(yǎng)養(yǎng)法等科科學的預預見。 19044年Haanniig在無無機鹽和和蔗糖溶溶液中培培養(yǎng)了蘿蘿卜和辣辣根菜的的胚，并并使這些些胚在離離體條件件下長到到成熟。Laibbach

5、h(19925，19229)把把由亞麻麻種間雜雜交形成成的不能能成活的的胚剖出出，在人人工培養(yǎng)養(yǎng)基上培培養(yǎng)至成成熟，從從而證明明了胚培培養(yǎng)在植植物遠緣緣雜交中中利用的的可能性性；19222年，美美國的RRobbbinss和德國國的Koottee分別報報道培養(yǎng)養(yǎng)離體根根尖獲得得某些成成功。19344年，WWhitte成功功離體培培養(yǎng)了番番茄的根根尖。二、 奠奠基階段段(200世紀330年代代中至550年代代末) 1、Whhitee（19934年年）在番番茄根培培養(yǎng)實驗驗中使用用的培養(yǎng)養(yǎng)基包含含無機鹽鹽、酵母母浸出液液和蔗糖糖。他后后來(119377)用33種B族族維生素素（吡哆哆醇、硫硫胺素和和

6、煙酸），取代代酵母浸浸出液獲獲得成功功。認識識了B族族維生素素對植物物生長的的重要意意義。2、Gaauthhereet(119344)在山山毛柳等等形成層層組織的的培養(yǎng)中中發(fā)現(xiàn)，雖然在在含有葡葡萄糖和和鹽酸半半胱氨酸酸的Knnop溶溶液中，這些組組織可以以不斷增增殖幾個個月，但但只有在在培養(yǎng)基基中加入入了B族族維生素素和IAAA以后后，形成成層組織織的生長長才能顯顯著增加加。19939年年Gauutheerett連續(xù)培培養(yǎng)胡蘿蘿卜根形形成層獲獲得首次次成功。同年，Whiite由由煙草種種間雜種種的瘤組組織，NNobeecouurt由由胡蘿卜卜，也建建立了類類似的連連續(xù)生長長的組織織培養(yǎng)物物。因

7、此此，Gaauthhereet、WWhitte和NNobeecouurt一一起被譽譽為植物物組織培培養(yǎng)的奠奠基人。3、Skkoogg(19944)以及SSkooog和崔崔澂等(19551)發(fā)發(fā)現(xiàn)，腺腺嘌呤或或腺苷不不但可以以促進愈愈傷組織織的生長長，而且且還能解解除培養(yǎng)養(yǎng)基中生生長素(IAAA)對芽芽形成的的抑制作作用，誘誘導芽的的形成，從而確確定了腺腺嘌呤與與生長素素的比例例是控制制芽和根根形成的的主要條條件之一一。4、19952年年，Moorell和Maartiin首次次證實，通過莖莖尖離體體培養(yǎng)，可以由由已受病病毒侵染染的大麗麗花中獲獲得無病病毒植株株。 5、19953-19554年，M

8、uiir進行行單細胞胞培養(yǎng)獲獲得初步步成功。把萬壽壽菊和煙煙草的愈愈傷組織織轉(zhuǎn)移到到液體培培養(yǎng)基中中，放在在搖床上上振蕩，形成了了由單細細胞和細細胞聚集集體組成成的細胞胞懸浮液液。Muuir等等還用機機械方法法由細胞胞懸浮液液和容易易散碎的的愈傷組組織中分分離得到到單細胞胞，把它它們置于于一張鋪鋪在愈傷傷組織上上面的濾濾紙上培培養(yǎng)，使使細胞發(fā)發(fā)生了分分裂。 6、19955年年，Miilleer等由由鯡魚精精子DNNA中分分離出一一種首次次為人所所知的細細胞分裂裂素，并并把它定定名為激激動素(kinnetiin)。7、19957年年，Skkoogg和Miilleer提出出了植物物激素控控制器官官

9、形成的的概念，指出在在煙草髓髓組織培培養(yǎng)中，根和莖莖的分化化是生長長素對細細胞分裂裂素比率率的函數(shù)數(shù)。8、19958年年，Sttewaard等等以胡蘿蘿卜為材材料，首首次通過過實驗證證實了HHabeerlaandtt關(guān)于細細胞全能能性的設(shè)設(shè)想，成成為了植植物組織織培養(yǎng)研研究歷史史中的一一個里程程碑。9、19958-19559年，Reiinerrt和SStewwardd分別報報道，在在胡蘿卜卜愈傷組組織培養(yǎng)養(yǎng)中形成成了體細細胞胚。 三、迅速速發(fā)展階階段(220世紀紀60年年代至現(xiàn)現(xiàn)在)1、基礎(chǔ)礎(chǔ)研究： 19965年年，Vaasill和Hiildeebraandtt用一種種化學成成分確定定的培養(yǎng)養(yǎng)

10、基，由由分隔培培養(yǎng)的煙煙草單細細胞獲得得了完整整的再生生植株，進一步步證實了了植物細細胞的全全能性 。2、原生生質(zhì)體培培養(yǎng)取得得重大突突破：19600年Coockiing等等用真菌菌纖維素素酶分離離植物原原生質(zhì)體體獲得成成功。19711年，TTakeebe等等首次獲獲得了煙煙草原生生質(zhì)體再再生植株株。19722年，CCarllsonn等通過過兩個煙煙草物種種之間原原生質(zhì)體體的融合合，獲得得了第一一個體細細胞雜種種。3、花藥藥培養(yǎng)取取得顯著著成績：19644年，GGuhaa和Maahesshwaari報報道，在在毛曼陀陀羅中通通過離體體花藥培培養(yǎng)由小小孢子直直接發(fā)育育成胚。 19677年，BBo

11、urrginn和Niitscch通過過花藥培培養(yǎng)獲得得了完整整的煙草草植株。4、微繁繁技術(shù)得得到廣泛泛應用19600年，MMoreel建立立了一個個離體無無性繁殖殖蘭花的的方法，繁殖系系數(shù)極高高。由于于這一方方法有巨巨大的實實用價值值，很快快被蘭花花生產(chǎn)者者所采用用，迅速速建立起起“蘭花工工業(yè)” 。第三章 植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)有關(guān)的的基本概概念一、植物物細胞全全能性(tottipootenncy)細胞全能能性:指指一個活活的植物物細胞，只要有有完整的的膜系統(tǒng)統(tǒng)和細胞胞核，它它就會有有一整套套發(fā)育成成一個完完整植株株的遺傳傳基礎(chǔ)，在一個個適當?shù)牡臈l件下下可以通通過分裂裂、分化化再生成成一個完完整植株

12、株。從理論上上講，只只要是一一個活的的細胞，都有再再生出一一個完整整植株的的潛力，但實際際情況并并非如此此簡單。就目前前所知，細胞的的再生潛潛力與其其分化程程度呈負負相關(guān)，就是說說細胞分分化程度度越高其其再生能能力越低低，所以以應盡量量選取幼幼嫩的植植物組織織作為培培養(yǎng)的實實驗材料料。 二、細胞胞分化、脫分化化與再分分化細胞分化化分生生性細胞胞在形態(tài)態(tài)結(jié)構(gòu)和和功能上上發(fā)生永永久性(不可逆逆轉(zhuǎn)性)適度變變化的過過程。脫分化由失失去分裂裂能力的的細胞回回復到分分生性狀狀態(tài)并進進行分裂裂，形成成無分化化的細胞胞團（即即愈傷組組織）的的過程。再分化由無無分化的的愈傷組組織細胞胞再轉(zhuǎn)變變成為具具有一定定

13、結(jié)構(gòu)，執(zhí)行一一定生理理功能的的細胞團團和組織織，構(gòu)成成一個完完整的植植物體或或植物器器官的過過程。三、器官官發(fā)生器官發(fā)生生由愈愈傷組織織的部分分細胞先先分化產(chǎn)產(chǎn)生芽(或根)，再在在另一種種培養(yǎng)基基上產(chǎn)生生根(或或芽)，形成一一個完整整植株。第四章 植物物組織培培養(yǎng)所需需的基本本設(shè)備與與條件一個理想想的植物物組織培培養(yǎng)室應應包括：1、化化學藥品品室；22、培養(yǎng)養(yǎng)基配制制室；33、滅菌菌室；44、接種種室；55、培養(yǎng)養(yǎng)室；66、培養(yǎng)養(yǎng)物的檢檢測和觀觀察記錄錄室。一、化學學藥品室室應配置幾幾個藥品品櫥、實實驗臺、萬分之之一和百百分之一一的電子子天平。室內(nèi)還還應放一一臺大容容量的冰冰箱，用用來分門門別

14、類地地保存激激素、抗抗生素和和各種需需低溫保保存的物物品。組織培養(yǎng)養(yǎng)所需主主要藥品品的存放放要求如如下： 1、可室室溫存放放的藥品品：無機機物、蔗蔗糖、 鹽酸、氫氧化化鈉，995酒酒精，瓊瓊脂。2、宜于于零上低低溫存放放的化學學藥品: 有有機物、激素3、應當當在一220下保存存的藥品品： 液液體抗生生素等。二、培養(yǎng)養(yǎng)基配制制室需要大于于40mm2的一一個房間間或更大大些，為為了方便便起見可可將房間間分為兩兩個區(qū):一是玻璃璃器皿的的清洗、消毒、干燥區(qū)區(qū)：二是培養(yǎng)養(yǎng)基配制制區(qū)：應應有大型型實驗臺臺若干個個，還應應配備常常溫冰箱箱一臺，電爐(10000W，20000W)，微波波爐，放放置移液液管、微

15、微量移液液器的架架子，酸酸度計等等。三、滅 菌 室滅菌室面面積可小小一些，其內(nèi)除除放滅菌菌鍋外，最好還還有臨時時存放培培養(yǎng)基、培養(yǎng)器器皿的架架子，也也應有自自來水裝裝置。滅滅菌室可可根據(jù)滅滅菌鍋的的多少，工作量量大小來來確定面面積，要要求房間間能有較較好的通通風散熱熱條件，且要配配備專門門的電源源線路，因為電電熱滅菌菌鍋的耗耗電量很很大。四、接 種 室接種室是是對培養(yǎng)養(yǎng)的植物物材料進進行無菌菌操作的的地方，應有超超凈工作作臺、放放置培養(yǎng)養(yǎng)容器的的架子等等。整個個房間最最好設(shè)有有緩沖間間和雙層層門窗，以防灰灰塵和微微生物。房間內(nèi)內(nèi)最好裝裝有紫外外燈或經(jīng)經(jīng)常噴灑灑殺菌劑劑，以抑抑制過多多微生物物生

16、長。工作人人員在進進入接種種室之前前在緩沖沖間內(nèi)更更換衣服服、鞋帽帽、穿好好工作服服，戴上上口罩、防塵帽帽，換上上拖鞋才才能進入入接種區(qū)區(qū)，進入入接種區(qū)區(qū)之后隨隨手把活活動門關(guān)關(guān)上。五、培養(yǎng)養(yǎng)室培養(yǎng)室最最重要的的是要恒恒溫、恒恒濕，無無塵且空空氣流通通。溫度度應維持持在(2253)，相對對濕度應應在500660%。培養(yǎng)室室內(nèi)有規(guī)規(guī)律地安安放培養(yǎng)養(yǎng)架或搖搖床。培養(yǎng)室內(nèi)內(nèi)所有光光照和黑黑暗應由由定時器器自動控控制。整整個培養(yǎng)養(yǎng)室內(nèi)還還應裝有有一個或或多個紫紫外燈，以便能能定時對對整個房房間進行行殺菌處處理，特特別是在在夏天潮潮濕、霉霉雨季節(jié)節(jié)，最好好每天在在晚上用用紫外燈燈殺菌330 mmin以以

17、上。培培養(yǎng)室內(nèi)內(nèi)的地面面、墻壁壁、培養(yǎng)養(yǎng)架及所所有器物物的表面面都應經(jīng)經(jīng)常清洗洗、擦拭拭以防過過多灰塵塵和微生生物滋生生。六、培養(yǎng)養(yǎng)物的檢檢測與觀觀察記錄錄室對培養(yǎng)物物進行及及時的檢檢測和觀觀察記錄錄是研究究植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)的重成成部分之之一，如如不及時時觀察記記錄或?qū)ε囵B(yǎng)物物的形態(tài)態(tài)、結(jié)構(gòu)構(gòu)、生理理變化以以及培養(yǎng)養(yǎng)基變化化等進行行及時檢檢測，就就不可能能獲得準準確有效效一手資資料，也也就不能能及時地地發(fā)現(xiàn)和和找出問問題，提提出解決決問題的的方法和和改進培培養(yǎng)的方方案。檢檢測與觀觀察記錄錄室最好好單獨設(shè)設(shè)立一個個房里面面擺放實實體解剖剖鏡、普普通光學學顯微鏡鏡、顯微微照相和和記錄設(shè)設(shè)備 。第

18、五章 植植物組織織培養(yǎng)常常用培養(yǎng)養(yǎng)基成分分及培養(yǎng)養(yǎng)基配制制目前所使使用的培培養(yǎng)基有有10余余種之多多，大部部分都是是在前人人研究的的基礎(chǔ)上上經(jīng)過分分析綜合合和改進進而成的的。例如如，Whhitee培養(yǎng)基基是Usspennskii和Usspennskaaia(19225)的的藻類培培養(yǎng)基演演化的結(jié)結(jié)果，被被廣泛用用于根的的培養(yǎng)；Gauutheerett培養(yǎng)基基是建立立在Knnop營營養(yǎng)液(18665)基基礎(chǔ)上的的。以后后的培養(yǎng)養(yǎng)基大部部分是在在Whiite和和Gauutheerett培養(yǎng)基基的基礎(chǔ)礎(chǔ)上改進進而成。一、培養(yǎng)養(yǎng)基的成成分（一）、無機營營養(yǎng)成分分(包括括大量元元素，微微量元素素和鐵鹽鹽

19、)1、大量量元素：一般指指在培養(yǎng)養(yǎng)基中的的濃度大大于O.5mmmolL的元元素。氮：常以以硝態(tài)氮氮(N003)或或氨態(tài)氮氮(NHH4)，或兩者者相互配配合的形形式存在在。缺氮氮時愈傷傷組織會會出現(xiàn)花花色素苷苷的顏色色，愈傷傷組織內(nèi)內(nèi)部不能能形成導導管。 磷：常以以NaHH2P004H2OO、KHH2P004或(NH44)H22P044的形式式提供。鉀：常以以KCll、KNN03或或KH22P044形式。鈣：常以以CaCCl22H22O、CCa(NN03)2。鎂：常以以MgSS047H22O的形形式，既既提供了了鎂也提提供了硫硫。缺硫時培培養(yǎng)的植植物組織織會明顯顯的退綠綠；缺磷磷或鉀時時細胞會會

20、過度生生長，愈愈傷組織織表現(xiàn)出出極其蓬蓬松狀態(tài)態(tài)。2微量量元素：指小于于O.55mmoolLL的元素素。 主要包括括鐵(FFe)、錳(MMn)、銅(CCu)、鋅(ZZn)、氯(CC1)、硼(BB)和鉬鉬(Moo)等。 鐵作為一一種微量量元素，對植物物也是必必需的，但由于于Fe的的特殊性性質(zhì)，即即很不穩(wěn)穩(wěn)定、易易沉淀，需要在在酸性條條件下才才能比較較穩(wěn)定，故在培培養(yǎng)基配配制時常常常把FFe鹽單單獨配制制，且常常以螯合合物的形形式，把把FeSS04和和它的螯螯合劑乙乙二胺四四乙酸鈉鈉(Naa2EDDTA)先分別別配成溶溶液，再再相互混混合使形形成螯合合鐵，以以防止沉沉淀和幫幫助被植植物吸收收。（二

21、）、有機營營養(yǎng)成分分維生素: 除除維生素素B1、維生素素B6、煙酸之之外，在在部分培培養(yǎng)基中中還添加加維生素素C(抗抗壞血酸酸)、維維生素HH(生物物素)等等。甘氨酸(氨基乙乙酸)和和肌醇(環(huán)己六六醇):肌醇主主要以磷磷酸肌醇醇和磷脂脂酰肌醇醇的形式式參與由由Ca介介導的信信號轉(zhuǎn)導導。另外外，在某某些植物物或某些些組織的的培養(yǎng)中中還加有有水解乳乳蛋白、水解酪酪蛋白、椰子汁汁、玉米米胚乳、麥芽浸浸出物、西紅柿柿汁和酵酵母浸出出物等。（三）、碳水化化合物用作碳源源的碳水水化合物物通常為為蔗糖或或葡萄糖糖，用量量通常為為24%，高者可可達5，亦可可用市售售的白糖糖所代替替。 幾乎所有有的培養(yǎng)養(yǎng)物在蔗

22、蔗糖作為為碳源時時生長都都比較好好，只有有少數(shù)植植物或組組織在葡葡萄糖或或果糖作作為碳源源的培養(yǎng)養(yǎng)基上生生長更合合適。也也有用麥麥芽糖、半乳糖糖、甘露露糖、山山梨醇和和乳糖作作為碳源源的。（四）、植物生生長調(diào)節(jié)節(jié)物質(zhì)在植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)中使用用的生長長調(diào)節(jié)物物質(zhì)主要要有生長長素類和和細胞分分裂素類類兩大類類，少數(shù)數(shù)培養(yǎng)基基中還添添加赤霉霉素GAA3等。1生長長素：主主要被用用于誘導導刺激細細胞分裂裂和根的的分化。常用的生生長素有有：NAAA(萘萘乙酸)，IAAA(吲吲哚乙酸酸)，IIBA(吲哚丁丁酸)，NOAA(萘氧氧乙酸)，2，4一DD(2，4一二二氯苯氧氧乙酸)，2，4，55一T(2，44，

23、5一一三氯苯苯氧乙酸酸)。對愈傷組組織增殖殖最有效效的是22，4一一D，特特別是對對單子葉葉植物。但2，4-DD是一種種極有效效的器官官發(fā)生抑抑制劑，不能用用于啟動動根和芽芽分化的的培養(yǎng)基基中。 2細胞胞分裂素素使用細胞胞分裂素素的主要要目的是是刺激細細胞分裂裂，誘導導芽的分分化、葉葉片擴大大和莖長長高，抑抑制根的的生長。 常用的天天然CTTK主要要有：玉玉米素,玉米素素核苷，二氫玉玉米素 。常用的人人工合成成CTKK主要有有: 激激動素(KT)、6-芐基腺腺嘌呤(6-BBA)、2ipp(異戊戊烯氨基基嘌呤)、和TTDZ(thiidiaazurron，噻二唑唑苯基脲脲)等 。3赤霉霉素 ：主要

24、是是GA33。用時時需過濾濾滅菌；促進試試管苗伸伸長。 （五）、瓊脂或或其他支支持物除液體懸懸浮培養(yǎng)養(yǎng)外，所所有的培培養(yǎng)物都都應生長長在固體體或半固固體的培培養(yǎng)基上上,以防防止培養(yǎng)養(yǎng)物沉人人液體培培養(yǎng)基，因缺氧氧而死亡亡。瓊脂脂是一種種極為理理想的支支持物。它是由由海藻得得來的多多糖類物物質(zhì)，但但并不是是培養(yǎng)基基中的必必需成分分，只是是作為一一種凝固固劑使培培養(yǎng)基變變成固體體或半固固體狀態(tài)態(tài)。（六）、其他添添加物 ：酵母母提取物物，椰乳乳，香蕉蕉粉，橘橘子汁，活性炭炭，滲透透調(diào)節(jié)劑劑、水解解酪蛋白白、水解解乳蛋白白等。1活性性炭：能能從培養(yǎng)養(yǎng)基中吸吸附許多多有機物物和無機機物分子子，可清清除培

25、養(yǎng)養(yǎng)中植物物組織在在代謝過過程中產(chǎn)產(chǎn)生的、對培養(yǎng)養(yǎng)物有不不良或毒毒副作用用的物質(zhì)質(zhì)，也可可以調(diào)節(jié)節(jié)激素的的供應。活性炭還還有刺激激胚胎發(fā)發(fā)生(如如煙草花花藥培養(yǎng)養(yǎng))或組組織生長長和形態(tài)態(tài)發(fā)生的的作用。2滲透透調(diào)節(jié)劑劑：常選選用一些些代謝微微弱的糖糖來充當當，如甘甘露(糖糖)醇、山梨醇醇和聚乙乙二醇等等，這些些糖基本本上不被被培養(yǎng)的的植物組組織所吸吸收，而而只存留留在培養(yǎng)養(yǎng)基中，起到調(diào)調(diào)節(jié)滲透透的作用用。3抗生生素：培培養(yǎng)的植植物組織織內(nèi)部攜攜帶有病病原物，表面消消毒不解解決問題題時，可可在配置置培養(yǎng)基基時添加加抗生素素，如加加20003000U的的慶大霉霉素可使使細菌污污染受到到很好的的控制。

26、 二、培養(yǎng)養(yǎng)基的選選擇1選擇擇合適的的培養(yǎng)基基 基本培養(yǎng)養(yǎng)基： MS培培養(yǎng)基適適合于大大多數(shù)雙雙子葉植植物，BB5和NN6培養(yǎng)養(yǎng)基適合合于許多多單子葉葉植物， Whhitee培養(yǎng)基基適于根根的培養(yǎng)養(yǎng) 激素濃度度和相對對比例的的確定先參考已已有的報報道，看看是否有有用相同同植物、相同組組織或相相近者做做過成功功或失敗敗的試驗驗，如果果有則直直接作為為參考；如果沒沒有，則則在建立立激素配配比中，將每一一種擬使使用的激激素選擇擇355個水平平，再按按隨機組組合的方方式建立立起如下下的實驗驗方案。三、培養(yǎng)養(yǎng)基的配配制（一）、配制母母液（二）、配制培培養(yǎng)基 (三)、配制制培養(yǎng)基基時應注注意的有有關(guān)問題題

27、1、高溫溫滅菌的的基本過過程檢查滅菌菌鍋內(nèi)有有無足夠夠量的水水，最好好用蒸餾餾水或去去離子水水，因為為自來水水含有較較多的礦礦物質(zhì)，容易使使鍋內(nèi)形形成水垢垢，影響響鍋的使使用壽命命。將需需要滅菌菌的器皿皿、培養(yǎng)養(yǎng)基等放放入鍋內(nèi)內(nèi)，不要要裝得太太滿，以以不超過過鍋的容容量34為宜宜。2、高溫溫下培養(yǎng)養(yǎng)基成分分的降解解經(jīng)高溫滅滅菌后赤赤霉素GGA3的的活性僅僅及不經(jīng)經(jīng)高溫滅滅菌的新新鮮溶液液的100。NNAA、2，44一D、激動素素和玉米米素在高高溫下是是比較穩(wěn)穩(wěn)定的。蔗糖經(jīng)高高溫后部部分被降降解成DD-葡萄萄糖和DD-果糖糖，果糖糖又可被被部分水水解，產(chǎn)產(chǎn)生抑制制培養(yǎng)的的植物組組織生長長的物質(zhì)質(zhì)

28、。高溫可使使碳水化化合物和和氨基酸酸發(fā)生反反應。維生素具具有不同同程度的的熱穩(wěn)定定性，但但如果培培養(yǎng)基的的pH值值高于55.5，則維生生素B11會被迅迅速降解解。 第六章 無菌菌操作技技術(shù)與設(shè)設(shè)備一、干熱熱滅菌干熱滅菌菌就是在在1800的烘箱箱內(nèi)對器器皿進行行殺菌處處理，是是一種徹徹底殺死死微生物物的方法法。適合合于干熱熱滅菌的的器皿和和物品有有：玻璃器器皿，如如三角瓶瓶、燒杯杯、量筒筒等；金屬物物品，如如鑷子、解剖刀刀、剪刀刀等；可以高高溫滅菌菌的塑料料制品。二、濕熱熱滅菌濕熱滅菌菌就是人人們平時時所說的的蒸汽滅滅菌。滅滅菌的溫溫度為1121，壓力力為1003.44 kPPa，滅滅菌時間間除

29、液體體外要求求在1221下維持持15 minn以上。液體滅滅菌時間間可依據(jù)據(jù)體積而而定，體體積越大大，需要要時間越越長，如如2.55L需220miin，110L需需28mmin，25LL需311minn。 濕熱滅菌菌時應注注意以下下問題：1、不能能隨意延延長滅菌菌時間，因為延延長時間間會使一一些化合合物過多多分解，特別是是蔗糖會會分解為為單糖，使培養(yǎng)養(yǎng)基pHH降低，瓊脂不不能很好好的凝固固；2、如果果滅菌鍋鍋沒有吹吹干程序序，從鍋鍋內(nèi)取出出的紙制制品、紗紗布等最最好立即即轉(zhuǎn)到660的溫箱箱中吹干干；3、由于于錫箔紙紙不透氣氣，推薦薦使用牛牛皮紙或或報紙等等包裝物物品，以以利于水水分快速速蒸發(fā)；

30、4、滅菌菌鍋所裝裝蒸餾水水或去離離子水應應經(jīng)常更更換，以以防止微微生物污污染和水水中雜質(zhì)質(zhì)過多，給滅菌菌鍋和要要滅菌的的物品帶帶來不利利影響；三、微過過濾滅菌菌是使需要要滅菌的的液體通通過一個個微孔濾濾膜，以以除去液液體中的的微生物物、微顆顆粒等，過濾的的范圍是是0.0025lOm。這這種方法法對于高高溫滅菌菌容易引引起分解解的物質(zhì)質(zhì)最為適適宜，如如容易分分解的維維生素、激素、植物組組織提取取物、抗抗生素等等。微過濾滅滅菌的關(guān)關(guān)鍵部分分是微孔孔濾膜，如要徹徹底清除除細菌、酵母等等微生物物，最好好使用00.222m的濾濾膜。如如要獲得得原生質(zhì)質(zhì)體，則則可使用用O.445m的濾濾膜。 四、化學學藥

31、物滅滅菌1、鑷子子、解剖剖刀等器器具的滅滅菌：將準備使使用的鑷鑷子、解解剖刀等等浸入775%酒酒精中，器具的的大半部部分都被被酒精浸浸泡。使使用時取取出鑷子子或解剖剖刀，放放在酒精精燈上加加熱至酒酒精完全全除去為為止，用用完后再再放回775%酒酒精中。2、外植植體的滅滅菌：將植物材材料先用用自來水水加洗潔潔精少許許浸泡110miin以上上，浸泡泡期間要要輕輕攪攪動幾次次，以便便使植物物材料與與溶液充充分接觸觸，然后后用自來來水沖洗洗10 minn左右。在超凈工工作臺上上，將材材料在770酒酒精中進進行表面面預消毒毒30秒秒，倒掉掉酒精，再用OO.1升汞(HgCCl2)進行消消毒8分分鐘左右右，

32、或用用1次次氯酸鈉鈉(NaaOCll)或次次氯酸鈣鈣Ca(OCll)2消消毒200 miin左右右，具體體時間要要根據(jù)材材料而定定。然后后用無菌菌水沖洗洗344次，每每次2 minn左右。次氯酸酸鹽在ppH6.O左右右時活性性較高，高于88.0時時幾乎無無活性；通常往往消毒液液中添加加幾滴吐吐溫200或吐溫溫80等等表面活活性劑，以提高高滅菌效效果。 五、抗生生素滅菌菌首先必須須弄清楚楚要殺死死的是真真菌、細細菌還是是病毒，是哪類類真菌、哪類細細菌或病病毒；其其次應知知道使用用的抗生生素是否否對培養(yǎng)養(yǎng)的植物物組織有有不良影影響；最最后要確確定抗生生素的使使用濃度度、使用用時期和和處理時時間的長

33、長短?？股氐牡氖褂弥恢荒苁怯糜米黝A防防微生物物污染的的方法，而不能能用于殺殺死微生生物，因因此在使使用時最最好加在在培養(yǎng)基基當中，而不宜宜作為一一種殺菌菌劑單獨獨使用。因為農(nóng)桿桿菌介導導法已成成為植物物基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移的一一個主要要方法，在轉(zhuǎn)基基因過程程中的除除菌和抑抑菌都離離不開抗抗生素，所以使使用抗生生素已逐逐漸成為為植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)中的滅滅菌技術(shù)術(shù)之一。六、無菌菌操作中中其他應應注意的的問題注意防止止紫外線線的危害害 植物組組織培養(yǎng)養(yǎng)室和超超凈工作作臺上的的紫外燈燈開放時時間不可可太長，最好在在30mmin之之內(nèi)。超超凈工作作臺上的的紫外燈燈關(guān)閉以以后不要要立即走走近工作作臺，最最好讓無無菌

34、風吹吹233 miin后再再開始操操作。 第七章 離體體快速繁繁殖方法法微繁在無菌菌條件下下進行植植物的無無性繁殖殖。19960年年，Moorell提出了了一個離離體無性性繁殖蘭蘭花的方方法，繁繁殖系數(shù)數(shù)極高。使微繁繁技術(shù)真真正實用用化。一、無菌菌培養(yǎng)物物的建立立1、外植植體的選選擇：莖莖段、莖莖尖、葉葉片、嫩嫩芽、鱗鱗莖的鱗鱗片、花花器官等等。 注意：（1）、在生長長季節(jié)開開始時由由活躍生生長的枝枝條上切切取的外外植體，通常能能產(chǎn)生最最好的效效果。（2）、對于需需要低溫溫、高溫溫或特殊殊的光周周期才能能打破休休眠的鱗鱗莖、球球莖、塊塊莖和其其他器官官，應當當在取芽芽之前進進行必要要的處理理。

35、2、消毒毒二、莖芽芽的增殖殖（一）莖莖芽增殖殖的類型型1、器官官型(oorgaan ttypee) 以芽增殖殖芽的方方法，其其遺傳性性狀穩(wěn)定定，成為為目前快快速繁殖殖中采用用的主要要方法。2、器官官發(fā)生型型(orrgannogeenessis typpe) 外植體先先脫分化化形成愈愈傷組織織，再分分化出器器官的方方式。3、胚狀狀體發(fā)生生型(eembrryoiid ttypee)體細胞增增殖發(fā)育育的順序序與受精精卵發(fā)育育極為相相似，經(jīng)經(jīng)過原胚胚一球形形胚一心心形胚一一魚雷胚胚一子葉葉胚5個個時期，最后發(fā)發(fā)育成完完整的植植株。胚胚狀體可可從愈傷傷組織形形成，也也可不經(jīng)經(jīng)過脫分分化直接接從子葉葉、下

36、胚胚軸和花花藥培養(yǎng)養(yǎng)形成。通過胚胚狀體的的培養(yǎng)可可以獲得得大量的的植株，大大提提高繁殖殖率4、原球球莖型(prootoeeombb tyype)目前蘭花花的快速速繁殖主主要靠原原球莖的的分化方方式。5、球莖莖芽型(gloobosse sstemm buud ttypee)觀葉海棠棠的葉柄柄表面可可產(chǎn)生一一個個圓圓球形的的小突起起（球形形莖），小突起起的一端端產(chǎn)生芽芽和葉片片，另一一端長出出根，最最后形成成完整的的小植株株。 6 塊莖莖型(ttubeer ttypee)花葉芋的的葉片或或葉柄上上，先形形成類似似愈傷組組織的小小硬粒突突起，并并逐漸形形成粒狀狀的芋塊塊。隨后后粒狀芋芋塊上分分化出新

37、新的14個小小突起。由小突突起上分分化出芽芽原基。隨著小小芋塊的的增大，分化出出的芽也也越密集集并形成成許多小小苗，在在小苗基基部與芋芋塊交界界處分化化出白色色的根。7 鱗莖莖型(bbulbb tyype) 百合的鱗鱗莖切塊塊基部近近軸面或或在邊緣緣直接形形成帶根根的小鱗鱗莖。如如卷丹鱗鱗片的頂頂部、中中部和基基部均能能誘導分分化出小小鱗莖。郁金香香鱗莖旁旁又會分分化出小小鱗莖。（二）器器官發(fā)生生型1 愈傷傷組織形形成的條條件 誘導愈傷傷組織常常用的生生長素是是2，44一D，IAAA和NAAA，常常用的細細胞分裂裂素是KKT和66-BAA。在禾禾谷類植植物中，只用22，4一一D就能能成功地地誘

38、導愈愈傷組織織。多數(shù)數(shù)情況下下誘導愈愈傷組織織既需要要生長素素，也需需要細胞胞分裂素素。黑暗條件件下有利利于愈傷傷組織的的形成，光照對對組織的的愈傷化化有抑制制作用。2 愈傷傷組織狀狀態(tài)的調(diào)調(diào)控優(yōu)良愈傷傷組織須須具備的的特性： (1)高度的的胚性或或再分化化能力，以便得得到再生生植株；（2）容容易散碎碎，以便便用這些些愈傷組組織建立立優(yōu)良的的懸浮系系；（3）旺旺盛的自自我增殖殖能力，以便建建立大規(guī)規(guī)模的愈愈傷組織織無性系系。（4）經(jīng)經(jīng)過長期期繼代保保存不喪喪失胚性性，以便便對它們們進行各各種遺傳傳操作。愈傷組織織狀況調(diào)調(diào)整的策策略（1）選選擇適當當?shù)幕蛞蛐秃屯馔庵搀w。如禾谷谷類植物物愈傷組組

39、織培養(yǎng)養(yǎng)的成功功，是由由于選擇擇了未成成熟胚和和幼穗作作為外植植體，它它們的根根和幼葉葉雖然也也能形成成愈傷組組織，但但都是非非胚性的的。（2）選選擇正確確的培養(yǎng)養(yǎng)基，特特別是正正確的植植物激素素種類和和濃度，及二者者之間正正確的配配比。 （3）采采用某些些特殊的的理化因因素，改改變愈傷傷組織誘誘導培養(yǎng)養(yǎng)基和培培養(yǎng)條件件。如在在玉米幼幼胚愈傷傷組織培培養(yǎng)中，通過在在培養(yǎng)基基中添加加5mggL或或10 mgL AAgNOO3，抑抑制組織織內(nèi)乙烯烯的作用用。（4）還還原態(tài)氮氮具有促促進細胞胞分裂的的作用，硝態(tài)氮氮具有抑抑制細胞胞分裂的的作用。增加培培養(yǎng)基中中的氨態(tài)態(tài)氮(或或谷氨酰酰胺、精精氨酸、水

40、解酪酪蛋白等等有機形形式的還還原態(tài)氮氮)可明明顯促進進細胞分分裂；增增加培養(yǎng)養(yǎng)基中的的硝態(tài)氮氮或減少少還原態(tài)態(tài)氮，可可顯著抑抑制細胞胞分裂。3 影響響莖芽分分化的因因素化學因素素 （1）細細胞分裂裂素/生生長素 在莖莖芽誘導導中，22ip在在通常情情況下是是最為有有效的。（2）生生長素能能抑制芽芽的形成成: 在煙草中中，濃度度低到55mollL的的IAAA即足以以完全抑抑制莖芽芽的自發(fā)發(fā)分化。當與激激動素或或腺嘌呤呤結(jié)合使使用時，生長素素可以抵抵消它們們促進莖莖芽形成成的作用用。（3）赤赤霉素對對于莖芽芽的分化化有抑制制作用:在煙草中中，若把把正在分分化的愈愈傷組織織在黑暗暗條件下下以GAA3

41、處理理，時間間即使短短至300600minn，也會會減少芽芽的分化化，而且且在處理理之后448h，所有的的擬分生生組織或或莖芽全全都不復復存在。 物理因素素（1）瓊瓊脂濃度度： 在培養(yǎng)養(yǎng)煙草薄薄層組織織時，當當瓊脂為為l時時，只能能形成花花；隨著著瓊脂濃濃度的下下降，花花的形成成頻率減減少，營營養(yǎng)芽的的分化出出現(xiàn)。在在液體培培養(yǎng)基中中，則只只能愈傷傷化和分分化營養(yǎng)養(yǎng)芽 ；（2）滲滲透壓： 在由馬馬鈴薯葉葉肉原生生質(zhì)體獲獲得的愈愈傷組織織中，只只有在培培養(yǎng)基里里加入00.2O.33 moolLL甘露醇醇以使?jié)B滲透壓保保持在2200到到4000毫滲透透壓摩爾爾時，才才可能出出現(xiàn)莖芽芽的分化化。 （

42、3）光光照： 高強強度的光光照對煙煙草莖芽芽的形成成有抑制制作用。天竺葵葵愈傷組組織只有有在光照照和黑暗暗周期交交替(115116 hh光照最最好)條條件下才才能分化化莖芽，培養(yǎng)在在連續(xù)光光照下的的愈傷組組織總是是白色的的，不表表現(xiàn)器官官發(fā)生。光質(zhì)對器器官分化化也有影影響。在在煙草中中藍光促促進莖芽芽分化，紅光刺刺激生根根。 （4）溫溫度： Skooog(19444)在在5333的范圍圍內(nèi)研究究了溫度度對煙草草愈傷組組織生長長和分化化的影響響，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)直到333時愈傷傷組織的的生長都都隨溫度度的上升升而增加加，但只只有在118時最適適合莖芽芽的分化化，在333時不能能形成莖莖芽。 其他因子子：培

43、養(yǎng)材料料的染色色體組，供體植植株和外外植體的的生理狀狀態(tài)，外外植體的的細胞發(fā)發(fā)育狀態(tài)態(tài)，培養(yǎng)養(yǎng)物的歷歷史以及及內(nèi)生激激素水平平。 （三）影影響莖芽芽增殖的的因素1、無機機鹽水平平對有些植植物來說說，MSS培養(yǎng)基基中的無無機鹽水水平或有有毒或太太高。如如烏飯樹樹的莖芽芽在只含含144強度MMS無機機鹽的培培養(yǎng)基中中能長得得很好，無機鹽鹽水平再再高或是是有毒或或是并沒沒什么好好效果。2、激素素 CTK為為了獲得得健壯的的莖芽應應適當降降低細胞胞分裂素素濃度。細胞分分裂素使使用的 濃度范范圍是OO.55 mmgLL，大多多數(shù)適當當?shù)臐舛榷仁? 2 mgL。GA為促促使莖的的伸長，有時加加入GAA；生

44、長素在在進行莖莖芽繁殖殖時，IIAA、NAAA使用的的濃度范范圍是00.11mggL。3、瓊脂脂 微繁繁所用的的培養(yǎng)基基通常都都用0.6 %O.8的的瓊脂固固化。但但在卡特特蘭和大大多數(shù)鳳鳳梨科植植物中，只有在在液體培培養(yǎng)基中中才能把把培養(yǎng)建建立起來來。應用用液體振振蕩培養(yǎng)養(yǎng)的一個個特殊優(yōu)優(yōu)點是莖莖芽一邊邊增殖一一邊彼此此離散，不必用用人工把把成簇的的莖芽切切開。4、光照照和溫度度光的作用用只是滿滿足某些些形態(tài)發(fā)發(fā)生過程程的需要要，因此此10000550000 lxx的光強強即已足足夠。光光周期嚴嚴格地說說也是不不重要的的。每天天16 h光照照8 h黑暗暗交替照照明，即即可產(chǎn)生生令人滿滿意的效

45、效果。培養(yǎng)室的的溫度一一般恒定定在255左右。三、離體體枝條的的生根1、試管管內(nèi)生根根 1）生根根培養(yǎng)基基應降低低鹽的濃濃度，減減少到112MMS或114MMS。 2）誘導導生根需需要有適適當?shù)纳L素，最常用用的是NNAA和和IBAA，濃度度一般為為O.11 110.OO mggL。3）對于于難生根根的植物物，可嘗嘗試把它它們的下下端浸在在高濃度度生長素素溶液中中若干時時間(由由幾秒到到幾小時時)之后后，再插插于無激激素培養(yǎng)養(yǎng)基中。4）在生生根培養(yǎng)養(yǎng)基中減減少蔗糖糖濃度(如減到到1)和增加加光照強強度，能能刺激小小植株通通過光合合作用制制造食物物的能力力，以便便由異養(yǎng)養(yǎng)型過渡渡到自養(yǎng)養(yǎng)型。5

46、）枝條條在離體體條件下下生根所所需的時時間由110d到到15dd不等。根長115mmm左右時時移栽最最為方便便，更長長的根在在移栽時時易斷，會降低低植株的的成活率率。2、試管管外生根根在有些植植物中，可以把把在離體體條件下下形成的的枝條當當做微插插條處理理，使它它們在土土中生根根。在這這種情況況下，須須把插條條的基部部切口先先用標準準的生根根粉或混混在滑石石粉中的的IBAA處理；有些植物物如月季季，則可可先在試試管內(nèi)誘誘導枝條條形成根根原基，然后再再移栽土土中，遮遮蔭保濕濕，待其其生根。試管外外生根由由于減少少了一個個無菌操操作步驟驟，因而而可降低低成本。無根苗的的嫁接試管內(nèi)嫁嫁接(微微體嫁接

47、接): 即以試試管苗的的0.11O.2mmm長的莖莖尖為接接穗 ，以在試試管內(nèi)預預先培養(yǎng)養(yǎng)出來的的帶根無無菌苗為為砧木，在無菌菌條件下下借助顯顯微鏡進進行嫁接接，之后后繼續(xù)在在試管內(nèi)內(nèi)培養(yǎng)，愈合后后成為完完整植株株再移入入土中。 試管外嫁嫁接: 無籽西西瓜試管管苗嫁接接到瓠子子上后，在溫度度為255300，相對對濕度基基本飽和和的條件件下，33d后傷傷口長出出愈傷組組織，11周后成成活并長長出新葉葉。四、壯苗苗、煉苗苗和移栽栽 需壯苗、煉苗的的原因 ：試管管苗生長長在恒溫溫、高濕濕、弱光光、無菌菌和有完完全營養(yǎng)養(yǎng)供應的的條件下下，雖有有葉綠素素，但營營異養(yǎng)生生活，在在形態(tài)解解剖和生生理特性性上

48、都有有很大脆脆弱性，如無角角質(zhì)層或或蠟質(zhì)層層，氣孔孔開張過過大且不不具備關(guān)關(guān)閉功能能等。這這樣的試試管苗若若未經(jīng)充充分鍛煉煉，一旦旦被移出出試管，投入到到一個變變溫、低低濕、強強光、有有菌和缺缺少完全全營養(yǎng)的的條件下下，必定定要被劇劇變的環(huán)環(huán)境所吞吞噬。壯苗：是是移栽成成活的首首要條件件，在培培養(yǎng)基中中加入一一定數(shù)量量的生長長延緩劑劑如多效效唑(PPP3333)，B9或或矮壯素素(CCCC)等等，在很很多種植植物中都都是培育育壯苗的的一項有有效措施施。煉苗：壯壯苗之后后則須開開瓶，降降低瓶中中濕度，增強光光照強度度，以便便促使葉葉表面逐逐漸形成成角質(zhì)，促使氣氣孔逐漸漸建立開開閉機制制，促使使葉

49、片逐逐漸啟動動光合功功能等。移栽： 先要輕輕輕地、徹底地地洗掉沾沾在根上上的瓊脂脂培養(yǎng)基基，以免免栽后發(fā)發(fā)霉。要要選用排排水性和和透氣性性良好的的移栽介介質(zhì)，例例如蛭石石、河沙沙、珍珠珠巖、腐腐植土等等。移栽栽后，最最初100155 d要要通過噴噴霧或罩罩上透明明塑料以以保持很很高的濕濕度(990%1000)。五、微繁繁中存在在的一些些問題1、物種種的局限限性很多難于于用傳統(tǒng)統(tǒng)方法繁繁殖的重重要樹木木，包括括若干裸裸子植物物，離體體繁殖技技術(shù)還未未過關(guān)。2、無性性系變異異 在商業(yè)性性微繁當當中，一一旦無菌菌培養(yǎng)已已經(jīng)建立立，人們們就禁不不住以此此為起點點連續(xù)繁繁殖若干干世代，結(jié)果就就有可能能使

50、培養(yǎng)養(yǎng)早期發(fā)發(fā)生的變變異(芽芽變或偶偶然變異異)累積積起來。如果是是通過愈愈傷組織織進行微微繁的話話，經(jīng)過過長期繼繼代培養(yǎng)養(yǎng)之后，再生植植株中出出現(xiàn)變異異的可能能性更大大。3、培養(yǎng)養(yǎng)物污染染在植物大大規(guī)模微微繁期間間，即使使外植體體在一開開始進行行了嚴格格的表面面消毒，某些慢慢速生長長的病原原菌(特特別是內(nèi)內(nèi)生菌)可能依依然存在在，但只只有在培培養(yǎng)物經(jīng)經(jīng)過多次次繼代之之后，這這些污染染物才表表現(xiàn)出來來并被人人們所發(fā)發(fā)現(xiàn)。4、玻璃璃化玻璃化現(xiàn)現(xiàn)象是植植物組織織培養(yǎng)過過程中特特有的一一種生理理失調(diào)或或生理病病變，多多數(shù)發(fā)生生在植物物莖尖培培養(yǎng)和離離體快繁繁中。玻玻璃苗生生長繁殖殖速度下下降，最最后

51、甚至至死亡。玻璃化的的誘因 外植體類類型、培培養(yǎng)基成成分和培培養(yǎng)條件件等各種種內(nèi)外因因素都可可能是玻玻璃化現(xiàn)現(xiàn)象出現(xiàn)現(xiàn)的原因因，其中中比較重重要的如如瓊脂用用量太低低或細胞胞分裂素素濃度過過高，培培養(yǎng)溫度度過高，光照不不足以及及乙烯合合成增加加等。5、培養(yǎng)養(yǎng)基的褐褐變褐變的原原因：由由外植體體的切口口表面滲滲出的酚酚類物質(zhì)質(zhì)氧化后后成為醌醌類物質(zhì)質(zhì)，使培培養(yǎng)基變變成暗褐褐色，從從而對組組織產(chǎn)生生毒害作作用。克服培養(yǎng)養(yǎng)基褐變變的措施施1、以幾幾天的時時間間隔隔將外植植體轉(zhuǎn)到到新鮮培培養(yǎng)基上上233次，在在這段時時間內(nèi)外外植體的的切口愈愈合，酚酚類物質(zhì)質(zhì)外滲停停止。 2、把由由親本植植株上直直接采

52、集集的莖芽芽，先在在一種液液體培養(yǎng)養(yǎng)基上培培養(yǎng)3dd，然后后再在半半固體培培養(yǎng)基上上培養(yǎng)?；蛴诮咏臃N的第第一個星星期之內(nèi)內(nèi)，每天天更換一一次液體體培養(yǎng)基基 。3、在培培養(yǎng)基中中加入一一些抗氧氧化物，如鹽酸酸半胱氨氨酸(1100mmgLL)、抗抗壞血酸酸(5001000mggL)或者是是檸檬酸酸(1550mggL)。 4、使用用能夠吸吸收酚類類化合物物的聚乙乙烯吡咯咯烷酮(PVPP，用量量一般為為0.001)、活性性炭(OO.10.5) 。5、由于于光能促促進酚的的氧化，開始時時把培養(yǎng)養(yǎng)物置于于暗處也也可能有有助于減減輕褐變變的問題題。6、適當當降低培培養(yǎng)溫度度。第八章 體細胞胞胚胎發(fā)發(fā)生一、體

53、細細胞胚(sommatiic eembrryo)或胚狀狀體(eembrryoiid)的的概念 指在植物物組織培培養(yǎng)中起起源于一一個非合合子細胞胞、經(jīng)過過胚胎發(fā)發(fā)生和胚胚胎發(fā)育育過程形形成的具具有雙極極性的胚胚狀結(jié)構(gòu)構(gòu)。胚狀體的的特點： 1、不是是兩性細細胞融合合的產(chǎn)物物；2、不同同于孤雌雌胚或孤孤雄胚，不是無無融合生生殖的產(chǎn)產(chǎn)物；3、不同同于器官官發(fā)生途途徑形成成的莖芽芽和根，它的形形成須經(jīng)經(jīng)歷與合合子胚相相似的發(fā)發(fā)育過程程，而且且成熟的的胚狀體體是一個個雙極性性結(jié)構(gòu)。二、體細細胞胚發(fā)發(fā)生研究究的歷史史離體條件件下的體體細胞胚胚胎發(fā)生生過程最最早是在在胡蘿卜卜中由RReinnertt（1995

54、8）和Sttewaard等等（19958）發(fā)現(xiàn)的的。 迄今已在在分屬于于40余余科（包包括裸子子植物）的1000多個個種植物物中有過過關(guān)于體體細胞胚胚胎發(fā)生生的報道道。能產(chǎn)生體體細胞胚胚胎的外外植體有有：單倍倍體的小小孢子；二倍體體組織如如莖段、子葉、莖尖、葉柄、貯藏根根的韌皮皮部和木木質(zhì)部等等；三倍倍體的胚胚乳。三、體細細胞胚胎胎發(fā)生的的方式1、從培培養(yǎng)中的的器官、組織、細胞或或原生質(zhì)質(zhì)體直接接分化成成胚，中中間不經(jīng)經(jīng)過愈傷傷組織階階段，如如石龍芮芮再生植植株莖表表面長出出不定胚胚。2、外植植體先愈愈傷化，然后由由愈傷組組織細胞胞分化成成胚，如如石龍芮芮花器愈愈傷組織織成胚，從愈傷傷組織產(chǎn)產(chǎn)

55、生胚狀狀體最為為常見。A、由外外植體外外層細胞胞直接產(chǎn)產(chǎn)生體細細胞胚 B、由外外植體組組織內(nèi)的的細胞產(chǎn)產(chǎn)生體細細胞胚C、愈傷傷組織表表層細胞胞分化為為體細胞胞胚 D，E、多個或或單個細細胞形成成體細胞胞胚四、體細細胞胚胎胎發(fā)生及及植株再再生研究究的意義義（1）植植物細胞胞分化、全能性性表達過過程和機機理等重重大理論論問題的的研究提提供了理理想的實實驗體系系 ；（2）人人工種子子的制作作，是促促進離體體快速繁繁殖、實實現(xiàn)田間間和溫室室栽培的的重要途途徑；（3）胚胚性愈傷傷組織可可在適宜宜的條件件下長期期保存，為解決決瀕危植植物挽救救等問題題提供了了可能；（4）胚胚性愈傷傷組織具具有遺傳傳穩(wěn)定、再

56、生頻頻率高的的特點，對于基基因工程程非常適適用； （55）體胚胚發(fā)生過過程中眾眾多體細細胞無性性系變異異為突變變體的篩篩選提供供了新的的來源； (6)以胚性性細胞為為材料制制備原生生質(zhì)體，為細胞胞分化和和植株再再生等奠奠定了基基礎(chǔ)。五、影響響植物體體細胞胚胚發(fā)生及及植株再再生的因因素1、基因因型的影影響 2、外植植體種類類：外植植體的類類型、所所處發(fā)育育和生理理狀態(tài)以以及取材材部位等等因素均均影響體體胚發(fā)生生。甚至至外植體體形態(tài)學學部位也也是影響響因素之之一。幼幼嫩的生生殖器官官較容易易由外植植體直接接產(chǎn)生體體細胞胚胚胎。而而幼嫩的的營養(yǎng)器器官則一一般需經(jīng)經(jīng)愈傷組組織途徑徑產(chǎn)生體體細胞胚胚胎。

57、 3、預處處理：在在一些植植物體胚胚誘導中中，如預預先低溫溫(48)儲藏藏12個月月。4、培養(yǎng)養(yǎng)基種類類及其成成分培養(yǎng)基種種類 體胚胚誘導中中70采用MMS培養(yǎng)養(yǎng)基。MMS培養(yǎng)養(yǎng)基中含含較高水水平的NNH4NNO3和和螯合鐵鐵。對體體胚發(fā)生生有促進進作用。氮源 在胡蘿卜卜葉柄節(jié)節(jié)段培養(yǎng)養(yǎng)物中，只有當當培養(yǎng)基基里含有有一定數(shù)數(shù)量的還還原態(tài)氮氮時，才才能出現(xiàn)現(xiàn)胚胎發(fā)發(fā)生過程程。在以以KN003為唯唯一氮源源的培養(yǎng)養(yǎng)基上建建立起來來的愈傷傷組織，去掉生生長素以以后不能能形成胚胚。然而而，若在在含有555mmmolL KKNO33的培養(yǎng)養(yǎng)基中加加入少量量(5mmmollL)NH44C1形形態(tài)的氮氮，胚

58、胎胎發(fā)育過過程就會會出現(xiàn)。碳源 作為外植植體的滲滲透壓調(diào)調(diào)節(jié)物和和體胚發(fā)發(fā)育的能能源物質(zhì)質(zhì)，碳源源對體胚胚發(fā)生有有重要影影響。在在柑橘體體胚發(fā)生生中，適適當濃度度的甘油油大大刺刺激了愈愈傷組織織的生長長和胚胎胎發(fā)生，而且能能獲得同同步控制制。蘋果果離體葉葉片培養(yǎng)養(yǎng)時，在在保證碳碳源供應應的前提提下，降降低蔗糖糖濃度有有利于直直接體胚胚發(fā)生。高濃度的的鉀 在野生胡胡蘿卜中中，高濃濃度的鉀鉀(200mmoolLL)是胚胚胎發(fā)生生所必需需的。培養(yǎng)基中中溶解氧氧 在培養(yǎng)基基中溶解解氧的含含量應低低于一個個臨界值值(1.5mggL)，否則則將有利利于生根根，而不不利于成成胚。這這是因為為低水平平的溶解解

59、氧在細細胞內(nèi)會會導致高高水平的的ATPP。如果果加入AATP，則有可可能取代代對低水水平溶解解氧的需需要。活性炭在培養(yǎng)基基中加入入活性炭炭也能提提高胡蘿蘿卜細胞胞胚胎發(fā)發(fā)生的頻頻率。酵母提取取物在培養(yǎng)基基中加入入酵母提提取物能能提高胡胡蘿卜細細胞胚胎胎發(fā)生的的頻率。植物激素素生長素類類：多數(shù)數(shù)植物誘誘導胚性性愈傷組組織需用用2.44一D，特別是是單子葉葉植物。而且胚胚性細胞胞發(fā)育時時還必須須及時降降低或去去掉2，4一DD。但低低濃度的的生長素素是大多多數(shù)植物物誘導體體胚發(fā)生生所必需需的。細胞分裂裂素類：許多植植物體胚胚發(fā)生的的誘導必必須加入入外源生生長素和和細胞分分裂素，CTKK在裸子子植物中

60、中起著比比生長素素更重要要的作用用。（3）脫脫落酸：外源AABA可可促進枸枸杞、石石刁柏等等胚性愈愈傷組織織的形成成和體胚胚的發(fā)生生。保持持秈稻愈愈傷組織織的胚性性結(jié)構(gòu)，并使其其綠苗分分化率明明顯提高高。(4)乙乙烯及多多胺： 低濃度度的乙烯烯利顯著著刺激胚胚胎發(fā)生生，高濃濃度則抑抑制胚胎胎發(fā)生。 外外源多胺胺或其前前體可使使人參體體胚發(fā)生生數(shù)增加加4倍；外源PPut使使茄子體體胚發(fā)生生數(shù)增加加6倍，并伴隨隨內(nèi)源PPut增增加，而而抑制多多胺合成成和降解解則使體體胚發(fā)生生數(shù)減少少。（5）赤赤霉素：抑制許許多植物物胚狀體體的發(fā)生生，但對對胚狀體體的進一一步發(fā)育育成熟及及胚的萌萌發(fā)效果果很好 5、