化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫、時(shí)間分辨免疫熒光三種方法檢測(cè)乙肝

1、時(shí)間分辨免疫熒光與化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法測(cè)定乙肝標(biāo)志物的比較摘 要 目的: 比較化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（CL）、酶聯(lián)免疫（EIA）與時(shí)間分辨免疫熒光（TRFIA）三種方法檢測(cè)乙肝病毒免疫標(biāo)志物的優(yōu)缺點(diǎn)。方法: 用上述三種方法的檢測(cè)試劑及儀器對(duì)189例臨床血清標(biāo)本分別進(jìn)行檢測(cè)，然后進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果: 三者對(duì)乙肝表面抗原的檢測(cè)靈敏度均達(dá)到了0.1ng/ml。對(duì)HBcAb的測(cè)定，以CL的靈敏度最高，ELISA最低。對(duì)表面抗體、E抗原及E抗體的檢測(cè)，相互符合率均在95%以上，但對(duì)核心抗體的檢測(cè)符合率， TRFIA與CL為83.23%，TRFIA與EIA為85.19%。結(jié)論: 三種方法的檢測(cè)性能相差不大，但

2、操作性各有特點(diǎn)，應(yīng)按各實(shí)驗(yàn)室具體情況加以選擇。關(guān)鍵詞：化學(xué)發(fā)光法，酶聯(lián)免疫試驗(yàn)，時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定本文作者:肖征 周薇薇白立彥趙莉萍 Comparison of chemiluminescence, ELISA and time-resolved fluoroimmunoassay in detecting Hepatitis B markers 肖征，副副主任醫(yī)醫(yī)師，副副教授周周薇薇，主管技技師白立立彥，主主管技師師趙莉萍萍，主管管技師解解放軍總總醫(yī)院微微生物科科，10008553 北北京Zhhengg Xiiao, Weeiweei ZZhouu, LLiyaan BBai, Liipi

3、nng ZZhaooGenneraal HHosppitaal oof PPLA, Beeijiing, 10008553 PPRCAbsttracctSubjjectt: TTo ccompparee thhreee deeferrentt asssayys tto ssee theeir abiilittiess inn deetecctinng hhepaatittis B mmarkkerss. Meethoods：By usiing Cheemillumiinesscennce (CLL), ELIISA andd Tiime-ressolvved fluuorooimmmunooa

4、sssay (TRRFIAA), 1899 seerumm saamplles werre ttestted forr heepattitiis BB maarkeers, thhen thee reesullts werre aanallyzeed.Reesullts: Thhe tthreee aassaays alll caan ddeteect as loww ass 0.1ngg/mll off HBBsAgg. BBut in HBccAb, Thhe CCL sshowwed thee hiigheest sennsittiviity, ELLISAA shhoweed tthe

5、 lowwestt seensiitivvityy. TThe coiinciidenncess off thhe tthreee mmethhodss inn deetecctinng HHBsAAb, HBeeAg, annd HHBeAAb aare norrmallly aboove 95%, bbut forr HBBcAbb, tthe coiinciidennce wass 833.233% bbetwweenn TRRIF andd CLL, aand 85.19% beetweeen TRIIFA andd EIIA. Cooncllusiion: Thheree weere

6、 nott muuch diffferrencce aamonng tthesse tthreee mmethhodss reegarrdinng ttheiir aabillitiies in dettecttingg heepattitiis BB maarkeers, buut tthe manneuvver fleexibbiliitiees oof eeachh meethood ddifffereed aa loot. Onee shhoulld cconssideer hhis ownn laabss siituaatioon bbefoore makkingg chhoicce

7、. Keey wwordds: cheemillumiinesscennce, ELLISAA, ttimee-reesollvedd flluorroimmmunnoasssayy自二十世世紀(jì)七十十年代以以來，許許多高靈靈敏度的的測(cè)定方方法應(yīng)用用于臨床床免疫學(xué)學(xué)檢測(cè)。其中，酶聯(lián)免免疫法應(yīng)應(yīng)用最廣廣。近年年來發(fā)展展起來的的CL與TRFFIA測(cè)測(cè)定據(jù)稱稱是靈敏敏度非常常高的方方法11,2,3。本文就就這三種種方法對(duì)對(duì)乙肝免免疫標(biāo)志志物的測(cè)測(cè)定作一一比較，以下結(jié)結(jié)果供大大家參考考。材料與方方法1.試劑劑與器材材：時(shí)間分辨辨免疫熒熒光測(cè)定定為上海海新波生生物公司司生產(chǎn)的的乙肝兩兩對(duì)半測(cè)測(cè)定試劑劑盒，

8、及及由該公公司提供供的洗板板機(jī)、孵孵育器和和時(shí)間分分辨免疫疫熒光測(cè)測(cè)定儀以以及分析析判定結(jié)結(jié)果軟件件系統(tǒng)。酶酶聯(lián)免疫疫方法試試劑為SSORIIN公司司（HBBsAgg）、科科華公司司（HBBsAbb、HBeeAg、HBeeAb、HBccAb）產(chǎn)品； 儀器有有洗板機(jī)機(jī)（WEELLWWASHH4）、酶標(biāo)比比色儀（REAADERR 2330S），部分分試驗(yàn)在在FAMME（全全自動(dòng)開開放式酶酶免分析析儀）上上進(jìn)行?；瘜W(xué)發(fā)光光法為強(qiáng)強(qiáng)生公司司Vittross Ecci化學(xué)學(xué)發(fā)光免免疫測(cè)定定系統(tǒng)及及配套的的專門試試劑盒。標(biāo)標(biāo)本為臨臨床檢測(cè)測(cè)乙肝標(biāo)標(biāo)志物的的血液標(biāo)標(biāo)本，分分離血清清，-220保存?zhèn)鋫溆?。H

9、HBsAAg標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)品購自自北京市市臨床檢檢驗(yàn)中心心（2nng/mml）,使用時(shí)時(shí)稀釋至至所需濃濃度。2.方法法EELISSA按產(chǎn)產(chǎn)品說明明書進(jìn)行行。主要要步驟有有：加樣樣、孵育育、洗板板、加酶酶或底物物、顯色色、比色色。其中中HBccAb測(cè)測(cè)定的樣樣本經(jīng)11：300稀釋。CCL法為為全自動(dòng)動(dòng)系統(tǒng)，設(shè)計(jì)好好標(biāo)本位位置、檢檢測(cè)項(xiàng)目目，按開開始鍵即即可TTRFIIA測(cè)試試步驟與與ELIISA法法相似，HBccAb測(cè)測(cè)定樣本本亦經(jīng)11：300稀釋，在最后后一步比比色為使使用時(shí)間間分辨免免疫熒光光測(cè)定儀儀測(cè)定發(fā)發(fā)光度。變變異系數(shù)數(shù)(CVV): 取0.5ngg/mll HBBsAgg一次做做20個(gè)個(gè)測(cè)試孔

10、孔，以測(cè)測(cè)得值（ELIISA為為OD值值，CLL為相對(duì)對(duì)熒光強(qiáng)強(qiáng)度，TTRFIIA為定定量值）計(jì)算批批內(nèi)差異異。統(tǒng)計(jì)計(jì)5個(gè)批批次測(cè)定定的結(jié)果果計(jì)算批批間差異異。3.結(jié)結(jié)果判斷斷EELISSA法以以標(biāo)本OOD值與與臨界OOD值的的比值(S/CCO)大大于1為為陽性,核心抗抗體測(cè)定定則相反反，以小小于0.5為陽陽性。CLL法以標(biāo)標(biāo)本熒光光強(qiáng)度/標(biāo)準(zhǔn)熒熒光強(qiáng)度度的比值值(相對(duì)對(duì)熒光強(qiáng)強(qiáng)度，RRF)大大于某一一定值（111.2）為陽性性，核心心抗體測(cè)測(cè)定則相相反，以以小于11.0為為陽性。TTRFIIA為半半定量法法，每批批標(biāo)本中中要作一一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線,再由此此將測(cè)得得結(jié)果用用配套計(jì)計(jì)算機(jī)進(jìn)進(jìn)行計(jì)算算

11、、轉(zhuǎn)換換為被測(cè)測(cè)定物的的含量。結(jié)果1. 三三種方法法檢測(cè)HHBsAAg靈敏敏度的比比較見表表1。三三種方法法都可以以測(cè)出00.1nng/mml的低低濃度HHBsAAg，對(duì)對(duì)該樣品品的測(cè)定定靈敏度度相差不不大。對(duì)對(duì)HBccAb的的測(cè)定以以CL的的靈敏度度最高，ELIISA最最低。2. 三三種方法法變異系系數(shù)的比比較見表表2。三三種方法法中，以以ELIISA的的批內(nèi)、批間差差異值最最大，CCL與TTRFIIA均較較低。3.對(duì)1189份份標(biāo)本的的HBssAg、HBssAb、HBeeAg、HBeeAb、HBccAb五五個(gè)項(xiàng)目目分別測(cè)測(cè)定的結(jié)結(jié)果的一一致性比比較見表表3與表表4。本本文主要要比較TTRF

12、IIA與現(xiàn)現(xiàn)有方法法的差別別，故未未做ELLISAA 與CCL的比比較。對(duì)對(duì)HBssAg、HBssAb、HBeeAg、HBeeAb的的檢測(cè)，相互符符合率均均在955%以上上，但對(duì)對(duì)HBccAb的的檢測(cè)符符合率， TRRFIAA與CLL為833.233%，TTRFIIA與EEIA為為85.19%。討論1.從靈靈敏度上上來看，三種方方法的差差別似乎乎不大。但TRRFIAA法此次次試劑盒盒的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線的的低端定定在0.1ngg/mll，對(duì)00.1的的樣本測(cè)測(cè)定值為為0.009ngg/mll，雖然然低于其其標(biāo)準(zhǔn)曲曲線，但但其熒光光讀數(shù)已已高于陰陰性背景景均值的的3倍標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)差，故可報(bào)報(bào)為陽性性。 HTM

13、LCONTROL Forms.HTML:Image.1 2.對(duì)乙乙肝五項(xiàng)項(xiàng)的測(cè)定定，總體體來說，靈敏度度差別亦亦不大。差別較較大的是是核心抗抗體測(cè)定定。除了了方法學(xué)學(xué)上的差差異外，影響結(jié)結(jié)果的可可能性因因素還有有：ELLISAA法的試試劑廠家家有意調(diào)調(diào)低了核核心抗體體的陽性性率；而而CL法法陽性率率高的可可能因素素也許與與其測(cè)定定時(shí)不稀稀釋標(biāo)本本有關(guān)。 3.不確確定因素素對(duì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)造成的的影響會(huì)會(huì)導(dǎo)致非非特異性性反應(yīng)的的發(fā)生。這一點(diǎn)點(diǎn)，CLL法出現(xiàn)現(xiàn)的相對(duì)對(duì)少一些些，其批批間差異異只有44-5.5%，這是因因?yàn)樗鞘侨詣?dòng)動(dòng)操作，重復(fù)性性好。但但我們也也遇到過過CL法法HBssAg的的RF值值為

14、12的標(biāo)標(biāo)本（大大于1.0為陽陽性），經(jīng)復(fù)查查后為陰陰性。批批間差異異、批內(nèi)內(nèi)差異越越小，樣樣本測(cè)定定的重復(fù)復(fù)性越好好，這三三種方法法中，以以ELIISA差差異最大大，故EELISSA法不不適于作作定量測(cè)測(cè)定。而而CL和和TRFFIA二二者均較較小，用用于定量量測(cè)定的的項(xiàng)目也也較多。 HTMLCONTROL Forms.HTML:Image.1 HTMLCONTROL Forms.HTML:Image.1 HTMLCONTROL Forms.HTML:Image.1 4.TRRFIAA法是最最近應(yīng)用用于臨床床的一種種高靈敏敏度的免免疫學(xué)檢檢測(cè)方法法。它的的基本原原理是延延遲檢測(cè)測(cè)壽命較較長的特

15、特異性激激發(fā)熒光光以排除除非特異異性及背背景熒光光的干擾擾。應(yīng)用用自動(dòng)化化的時(shí)間間分辨免免疫熒光光檢測(cè)儀儀可以自自動(dòng)完成成特異性性熒光的的檢測(cè)并并進(jìn)行濃濃度換算算，從而而獲得較較好的靈靈敏度和和特異性性。 TRRFIAA法的另另一優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)是它的的線性范范圍比較較寬，方方便進(jìn)行行定量。這對(duì)觀觀察病人人的感染染進(jìn)展情情況，對(duì)對(duì)治療有有無應(yīng)答答可得到到最直接接的變化化數(shù)據(jù)。對(duì)于臨臨床來說說，對(duì)表表面抗原原、表面面抗體和和核心抗抗體的定定量測(cè)定定更為重重要。CCL法（儀器）也可以以對(duì)表面面抗體的的測(cè)定定定量，但但對(duì)其它它幾項(xiàng)不不能定量量，只能能通過RRF的高高低來做做相對(duì)的的定量估估計(jì)。EELISSA法

16、的的測(cè)定項(xiàng)項(xiàng)目則都都不作定定量，在在常規(guī)工工作中，我們將將在CUUT-OOFF值值三倍以以內(nèi)的陽陽性標(biāo)本本報(bào)告為為弱陽性性。TRFFIA法法還有一一個(gè)優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)是它的的最終結(jié)結(jié)果比色色對(duì)時(shí)間間要求不不高，反反應(yīng)終止止后結(jié)果果穩(wěn)定，只要反反應(yīng)板的的液體不不揮發(fā)，它的比比色測(cè)定定值能穩(wěn)穩(wěn)定相當(dāng)當(dāng)長時(shí)間間。5.化化學(xué)發(fā)光光法主要要的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)在于其其操作方方便、結(jié)結(jié)果穩(wěn)定定，少量量標(biāo)本時(shí)時(shí)相對(duì)快快速簡便便，但本本文中化化學(xué)發(fā)光光儀，標(biāo)標(biāo)本處理理速度理理論最高高值只有有90測(cè)測(cè)試/小小時(shí)。實(shí)實(shí)際運(yùn)行行中速度度還要慢慢些。而而ELIISA法法和TRRFIAA法則適適合于大大批量標(biāo)標(biāo)本的檢檢測(cè)。另另外，CCL法的

17、的成本也也較高，還有因因出現(xiàn)故故障而浪浪費(fèi)可測(cè)測(cè)試驗(yàn)數(shù)數(shù)的情況況，這更更增加了了它的成成本。6.ELIISA法法的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)在于它它操作簡簡單、適適合于大大批量標(biāo)標(biāo)本的測(cè)測(cè)定，且且成本低低廉。其其靈敏度度也很好好。但由由于它的的靈敏度度較高，各個(gè)標(biāo)標(biāo)本的操操作間隔隔小，容容易互相相影響（污染）。所以以，對(duì)于于陽性標(biāo)標(biāo)本，應(yīng)應(yīng)以適宜宜的方法法復(fù)查，以減少少誤報(bào)。77.TRRFIAA法的靈靈敏度、特異性性均較好好，試驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果可可以保存存較長時(shí)時(shí)間。其其定量是是它的優(yōu)優(yōu)點(diǎn)，同同時(shí)也是是它的弱弱點(diǎn)。如如果一次次試驗(yàn)的的標(biāo)準(zhǔn)沒沒做好，這一批批的結(jié)果果可能都都會(huì)受影影響，甚甚至完全全出不了了結(jié)果。而乙肝肝標(biāo)志

18、物物的檢測(cè)測(cè)有時(shí)不不一定要要精確定定量，有有些項(xiàng)目目的結(jié)果果只要有有大致的的濃度就就能提供供給臨床床足夠的的信息量量了。從以以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)結(jié)果可可以看出出，三種種方法各各有特點(diǎn)點(diǎn)。從目目前臨床床實(shí)驗(yàn)室室免疫學(xué)學(xué)檢測(cè)方方法的發(fā)發(fā)展?fàn)顩r況來說，現(xiàn)在已已是ELLISAA法的發(fā)發(fā)展應(yīng)用用頂峰時(shí)時(shí)期，下下一步取取代它的的，是CCL？TTRFIIA？還還是其它它的方法法？由于于我們?cè)u(píng)評(píng)價(jià)的TTRFIIA法試試劑是一一剛剛開開發(fā)出來來的產(chǎn)品品，可檢檢測(cè)項(xiàng)目目也不多多，如能能進(jìn)一步步改進(jìn)，相信它它會(huì)更多多地被臨臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)室接受受。 參考文獻(xiàn)獻(xiàn)1.時(shí)時(shí)間分辨辨熒光分分析法（TRFFIA），cooolaautuumn， HYPERLINK /edu/ htttp:/n/eddu/rresoourcce/iinsttrummentt/2000100930002.htmm，2.李振甲甲等，時(shí)時(shí)間分辨辨熒光免免疫分析析技術(shù)與與應(yīng)用。北京：科